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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 개 주요 소화기, 호흡기질병 원인체의 복합항원과 여러가지 adjuvant를 이용하여 시험 백신을 제조하고 산란계에 면역접종시킨 후 닭 혈중 및 난황 중의 항체가를 비교조사하여 최적 복합난황 항체를 생산하는데 기여하고자 하였다.
- bronchiseptica [4] 등의 개별항원에 대한 일부 연구가 있어 왔으나 닭이나 돼지에 비해 상대적으로 미미한 실정이다. 본 연구에서는 이들 3가지 주요 병원체에 대한 혼합백신을 제조하고 닭에 면역접종하여 생성되는 난황을 이용하여 바이러스와 세균, 소화기성 질병과 호흡기질병을 동시에 효과적으로 방제하려는 데 적용하고자 수행되었으며, 여러 가지 부형제를 달리하여 비교시험한 결과, 먼저 B. bronchiseptica의 경우 ISA70를 사용한 경우에서 사용 전보다 높은 항체상승효과를 유도할 수 있었다. 이는 신 등 [4, 5] 이 보고한 돼지 호흡기질병 원인균 항원에 대한 난항항체 생성시험에서 gel 사용 그룹보다 ISA70를사용한 그룹에서 높은 ELISA 항체가가 장기간 유지한 시험성적과 일치하는 결과이다.
제안 방법
- 3의 농도로 조절하여 사용하였으며, crudeDNT 항원은 500 μ g/ml 의 농도를, 파보 바이 러스는 hemagglutination inhibition(HI) test 역가 210의 농도를, 디스템파바이러스 MDCK cell에서의 바이러스 역가 108#TCID50/ml 농도의 항원을 면역보좌제로서 Al(OH)3: gel, ISA25 및 멱역증강제와 freund's complete adjuvant(difco) 및 ISA70 등을 다양하게 사용하여 시험 백신을 제조하였으며, 보좌제와 혼합된 시험백신의 경우는 근육접종을, 정맥주사시에는 항원만을 주사하였다. 1차 시험의 경우는 개 기관지폐렴과 파보바이러스 항원에 대한 항체 형성능을, 2차 시험의 경우는 개 디스템퍼 바이러스를 추가한 혼합 시험백신에 대한 항체생성 양상을 조사하였다.
- Microplate aggulutination test게 의하여 항체 역 가를 측정하였으며, 응집용 항원은 B. bronchiseptica 균을 BHI broth에서 1일 배양한 뒤 PBS 로 2회 세척하고(6, 000 rpm 30분) spectrophotometer로 410 nm에 OD 0.5 정도의 탁도가 되도록 조정한 뒤 formalin을 0.2% 첨가하여 냉장 보관하면서 사용하였다. 응집 항체 역 가의 검사는 96 well microplate를 이용하여 PBS(pH7.
- Seed virus는 KCPVC(녹십자수의 약품보유)를 사용하였으며 세포단층이 80% 형성된 CRFK(crandell feline kidney) cell 에 접종하고 4일간 배양한 후 80% cytopathic effect(CPE)가 보일 때 채독하여 동결융해를 2회 반복하여 항원으로 사용하였다.
- 개 기관지폐렴균 항원을 파보바이러스 등 타 항원과 혼합한 후 여러가지 adjuvant를 이용하여 닭에 면역 접종하여 나타나는 닭 혈중의 항체가를 microplate 응집 역가로 나타내었다 (Fig. 1). 시험 1에서 백신접종 후 5주까지는 adjuvant로서 gel 및 ISA25 사용한 경우보다 면역증 강제를 사용한 그룹에서 다소 높게 나타났으나 그 이후 25주까지 gel 백신접종 그룹에서 높은 혈중 항체가를 나타내었다.
- 개 디스템파 백신주를 종독으로 하여 7일령 SPF란의장뇨막에 계란 1개당 0.2 ml 씩 접종하여 37oC에서 7일간 배 양한 후 장뇨막만을 분리, 수집 하여 homogenizer로 유제 후 원심분리하여 상층액중의 바이러스를 SPF 란을이용하여 형성한 chicken embryofibroblast(CEF) 에 접종하여 6일간 37oC에서 배양하고 세포변성이 80-90% 나타났을 때 채독하였다. 이 바이러스를 다시 단층이 형성된 MDCK cell에 접종하고 37oC에서 6일간 배양하면서 세포 변성이 100% 나타났을 때 채독하여 MDCK cell에서# 계대한 다음 항원으로 사용하였다.
- 개 디스템퍼항원으로 면역시킨 닭의 혈중 및 난황에 대한 항체역가를 바이러스 중화시험에 의하여 측정하였 . 이 시험 결과는 2 시험에서의 타 항원과의 혼합에 의한 닭에 대한 백신접종시 adjuvant 종류 및 접종 횟수에 관계없이 중화시험에 의한 항체형성이 확인되지 않았으며, 그 이후 디스템퍼 단일항원에 대하여 adjuvant 로서 ISA70을 사용하여 2주 간격으로 3회에 걸쳐 추가 접종한 후 항체형성을 Fig.
- 균체항원제조를 위하여 기관지폐렴 증상이 있는 개 가검물로부터 분리된 Bordetella bronchiseptica 분리 균을 사용하였으며, 냉동보관중인 분리균을 blood agaQl〕 1차배양하고 다시 brain heart infusion(BHI, difco) broth에서 37oC, 18시간 배 양한 후에 8, 000 rpm, 30분간 원심 분리하여 균을 집균하고 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2# 2회 세척하여 적당량의 PBS에 부유시킨 후, 2% formalin을 첨가하여 37oC 에서 2일간 불활화시 켰다. 8, 000 rpm, 30분간 원심분리하여 PBS(pH 7.
- 백신접종전 및 접종후 2주 간격으로 닭의 익하정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고 56℃에서 3#간 비동화하여 혈중항체가 측정에 사용하였다. 난황내 항체가 변화 및 역가측정을 위하여 계란은 백신접종전 및 접종후 2주부터 주기적으로 수거하여 우등 [3, 4]의 방법에 준하여 추출하였다.
- 시험백신의 항원은 개 기관지폐렴균의 경우 균체 항원은 410 nm 파장에서 흡광도 1.3의 농도로 조절하여 사용하였으며, crudeDNT 항원은 500 μ g/ml 의 농도를, 파보 바이 러스는 hemagglutination inhibition(HI) test 역가 210의 농도를, 디스템파바이러스 MDCK cell에서의 바이러스 역가 108#TCID50/ml 농도의 항원을 면역보좌제로서 Al(OH)3: gel, ISA25 및 멱역증강제와 freund's complete adjuvant(difco) 및 ISA70 등을 다양하게 사용하여 시험 백신을 제조하였으며, 보좌제와 혼합된 시험백신의 경우는 근육접종을, 정맥주사시에는 항원만을 주사하였다. 1차 시험의 경우는 개 기관지폐렴과 파보바이러스 항원에 대한 항체 형성능을, 2차 시험의 경우는 개 디스템퍼 바이러스를 추가한 혼합 시험백신에 대한 항체생성 양상을 조사하였다.
- 2% 첨가하여 냉장 보관하면서 사용하였다. 응집 항체 역 가의 검사는 96 well microplate를 이용하여 PBS(pH7.2)로 혈청의 경우 10배부터, 난황의 경우 2배부터 단계적으로 희석한 후 동량의 항원 (50|“well:# 가하여 2-3분간 shaking한 후 37oC 에서 overnight 반응시킨 후 응집역가를 측정하였다.
- 2) 로 2회 세척하여 적당량의 PBS 에 부유시켜 sonicati#로 균을 파괴하였다. 이것을 8, 000rpm, 30분간 원심분리하여 상층액을 수집하고 BCA protein assay reagent kit(Pierce Co) 를 이용하여 단백질 농도를 측정한 후에 crude DNT로 하고 이것을 formalin으로 불활화하여 toxoid로 사용하였다.
- 난황내 항체가 변화 및 역가측정을 위하여 계란은 백신접종전 및 접종후 2주부터 주기적으로 수거하여 우등 [3, 4]의 방법에 준하여 추출하였다. 즉, 수집된 계란을 난황만 분리하여 50 ml 원심튜브에 넣은 후 동량의 PBS(pH7.2:를 가하여 vortex하고, 다시 혼합액에 동량의 chloroform을 가하고 실온에서 2시간 정치시킨 후 상층액을 수거하거나 일부를 취하여 eppendorf tube에 옳겨 8, 000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 IgY 항체가를 측정하였다.
- 파보바이러스는 hemagglutination inhibition(HI) test에 의하여 각각 혈중 및 난황중의 항체역가를 측정하였으며 닭 혈청의 경우 56oC에서 30분간 비동화시킨 후 kaoline 처리한 혈청을 5배부터, 난황의 경우 2배부터 단계별로 희석하였다. 시험에 이용된 혈구는 pig erythrocyte 를 0.
대상 데이터
- 희석하였다. 시험에 이용된 혈구는 pig erythrocyte 를 0.7% 농도로 희석하여 사용하였으며, HI 시험에 이용한 바이러스 항원은 8 HA units/50w로 조정하여 사용하였다. 디스템파바이 러스는 바이 러스 중화 시험법을 이용하여 난황중의 항체역가를 측정하였다.
이론/모형
- 혈중항체가 측정에 사용하였다. 난황내 항체가 변화 및 역가측정을 위하여 계란은 백신접종전 및 접종후 2주부터 주기적으로 수거하여 우등 [3, 4]의 방법에 준하여 추출하였다. 즉, 수집된 계란을 난황만 분리하여 50 ml 원심튜브에 넣은 후 동량의 PBS(pH7.
- 7% 농도로 희석하여 사용하였으며, HI 시험에 이용한 바이러스 항원은 8 HA units/50w로 조정하여 사용하였다. 디스템파바이 러스는 바이 러스 중화 시험법을 이용하여 난황중의 항체역가를 측정하였다.
성능/효과
- 나타내었다. 1차 시험에서 1차 및 2차 접종 후나타나는 각 adjuvant 별 항체 가는 ISA25(그룹 B)가 가장 높게 나타났으며, 이후 2차례의 혈관내 항원 접종 및 3차례에 걸친 각 백신의 근육접종결과 계속적으로 혈중항체가 는 상승하였고 그 이후 백신을 중단한 22주까지의 항체가 변화에서도 그룹 日에서 가장 완만한 하향곡선을 나타내어 파보바이러스항원에 대한 닭 혈중항체가는 ISA25 가 gel 이나 면역증강제보다 면역형성 및 항체가 유지에 우수하게 나타났다(Fig. 3).
- 개 기관지폐렴균, 파보바이러스 및 개 디스템퍼 바이러스 혼합항원을 이용하여 닭에 백신접종 후 닭 혈중 및 난황에서의 항체가 조사결과 adjvan# ISA70을 사용할시 이들 항원에 대한 가장 높은 항체가 유도할 수 있었다. 기관지 폐렴균의 경우 닭 혈중 항체가는 1, 280~ 10, 240 를, 난황중 항체가는 160~1, 280의 수준으로 가장 높게 나타내 었으며, 파보바이 러스는 ISA25로 초기면역시 킨 후 ISA70를 사용한 경우에서 항체형성 및 지속기간이 우수하게 나타내어 혈중 항체가 80~320, 난황항체가는 64-256를 각각 나타내었다.
- 개 파보바이러스에 대한 항체가는 ISA25 를 사용한 그룹에서 높은 항체가를 장기간 지속하는 것으로 나타났으며, 특히 gel과 ISA25를 혼합하여 사용한 경우에서 ISA25 단독 및 항원만 접종시보다 빠른 항체형성과 높은 항체가를 유지하였으며 그 이후 모든 시험그룹에 ISA70을 사용한 결과 기관지 폐렴균과 같은 양상으로 급속하게 항체가는 상승하여 평균적으로 장기간 높은 수준의 항체가를 유지하였다. 본 시험에서 얻은 닭 혈중 및 난황중의 항체 역가는 오 등 [2] 의 4회 근육접종 후 닭 혈중 혈구응집억제반응 역가 1:640~1:5, 120 및 난황 중 역가 1:640~1:2, 560에 비해 다소 낮은 경향이나 닭의 개체차이 및 접종된 항원량과의 관련이 있는 것으로 추정되었다.
- 이루어지는 것으로 나타났다. 그 이후 모든 시험그룹에 ISA70을 사용한 결과 기관지 폐렴균과 같은 양상으로 급속하게 항체가는 상승하여 평균적으로 장기간 높은 수준의 항체가를 유지하는 것으로 나타내었다.
- 기관지 폐렴균의 경우 닭 혈중 항체가는 1, 280~ 10, 240 를, 난황중 항체가는 160~1, 280의 수준으로 가장 높게 나타내 었으며, 파보바이 러스는 ISA25로 초기면역시 킨 후 ISA70를 사용한 경우에서 항체형성 및 지속기간이 우수하게 나타내어 혈중 항체가 80~320, 난황항체가는 64-256를 각각 나타내었다. 반면 개 디스템퍼의 경우는 고농도의 단일 항원에 ISA70를 사용한 경우에서 바이러스 중화역가 8-64의 낮은 항체생성이 확인되어 닭 혈중 및 난황항체 형성능은 항원의 종류에 따라 다양하게 나타날 수 있으며 adjuvant의 선택 또한 중요함을 알 수 있었다.
- 난황중 개 파보바이러스에 대한 항체역가는 백신 접종 후 9주째 측정한 결과 음성으로 나타났으며 그이후 adjuvant로써 ISA70를 사용하여 닭 혈중항체가의 상승을 확인한 후 난황 중 항체를 측정한 결과 닭 혈중 항체가 와 같이 adjuvant를 ISA25를 사용한 그룹 #에서 평균 항체가 6~7(log2 base #서 가장 높게 나타났으며, 그다음으로 gel이 5~6 및 면역증강제 3~4의 순이었다. 이들 항체가는 마지막 접종 후약 1#까지 계속적으로 유지하였다.
- 시험 1에서 백신접종 후 5주까지는 adjuvant로서 gel 및 ISA25 사용한 경우보다 면역증 강제를 사용한 그룹에서 다소 높게 나타났으나 그 이후 25주까지 gel 백신접종 그룹에서 높은 혈중 항체가를 나타내었다. 다량의 높은 난황항체가를 얻기 위하여 모든 그룹에 ISA70를 사용한 결과(시험 1 24주, 시험 2 1#) 사용전의 수준인 4.0~8.0(1/10 log2 base) 혈중항체가 가사용 후 크게 상승하여 모든 그룹에서 9.0~10.0(1/10log2 base) 수준의 높은 항체가 나타내었다.
- 닭 혈중 항체가 측정과 같은 방법으로 시험한 결과 난 황 중의 항체가는 모든 그룹에서 4.0~7.0(1/10 log2 base) 의 수준으로 닭 혈중 항체가 4.0~10.0(1/10 log2 base)보다는 다소 낮은 경향이었으며, ISA25 및 gel를 사용한 그룹보다는 면역증강제를 사용한 그룹에서 높게 나타낸 것이나, 모든 그룹에 ISA70를 사용한 이후의 난황중 항체가의 상승은 닭 혈중항체가의 향상과 유사한 결과로 나타났으나 전반적으로 닭 혈중 항체보다는 다소 낮게 나타났다(Fig. 2).
- 이는 신 등 [4, 5] 이 보고한 돼지 호흡기질병 원인균 항원에 대한 난항항체 생성시험에서 gel 사용 그룹보다 ISA70를사용한 그룹에서 높은 ELISA 항체가가 장기간 유지한 시험성적과 일치하는 결과이다. 또한 난황중 항체 가는 모든 그룹에서 4.0~7.0(1/10 log2 base>의 수준으로 닭 혈중 항체가 4.0-10.0(1/10 log2 base) 보다는 다소 낮은 경향이었고, ISA70를 사용한 후에 모든 그룹에서 난황 중 항체 가의 상승은 닭 혈중항상승 양상과 유사하게 나타났으나 난황중 항체가는 닭 혈중항체가에 비하여 다소 낮고 2-4주 늦게 나타났다. 이와 같은 결과는 신 등 [4, 5]의 난황에서 닭 혈중보다 낮은 ELISA 항체가를 보인 성적과 유사한 결과이며, ISA70 사용 이후 전 그룹에서 난황 중 항체가가 높게 상승하여 나타난 것은 adjuvant의 선택이 면역반응에서 중요하게 작용함을 알 수 있었다.
- 1). 시험 1에서 백신접종 후 5주까지는 adjuvant로서 gel 및 ISA25 사용한 경우보다 면역증 강제를 사용한 그룹에서 다소 높게 나타났으나 그 이후 25주까지 gel 백신접종 그룹에서 높은 혈중 항체가를 나타내었다. 다량의 높은 난황항체가를 얻기 위하여 모든 그룹에 ISA70를 사용한 결과(시험 1 24주, 시험 2 1#) 사용전의 수준인 4.
- 이 시험 결과는 2 시험에서의 타 항원과의 혼합에 의한 닭에 대한 백신접종시 adjuvant 종류 및 접종 횟수에 관계없이 중화시험에 의한 항체형성이 확인되지 않았으며, 그 이후 디스템퍼 단일항원에 대하여 adjuvant 로서 ISA70을 사용하여 2주 간격으로 3회에 걸쳐 추가 접종한 후 항체형성을 Fig. 5와 같이 확인할 수 있었다. 즉, 디스템퍼 항원량의 증가와 계속적인 ISA70의 사용으로 닭 혈중 평균항체 및 난황항체가는 각각 3.
- 이와 같은 결과는 전반적으로 시험 2에서도 같은 양상이었으나, 그룹 D의 gel과 ISA25를 혼합하여 사용한 경우에서 ISA25 단독(그룹 E) 및 항원만 접종시보다 빠른 항체형성능이 나타났으며, 특히 그룹 E에서 5주 이후에 나타나는 최고 항체가와 항체소실이 가장 완만하게 이루어지는 것으로 나타났다. 그 이후 모든 시험그룹에 ISA70을 사용한 결과 기관지 폐렴균과 같은 양상으로 급속하게 항체가는 상승하여 평균적으로 장기간 높은 수준의 항체가를 유지하는 것으로 나타내었다.
- 5와 같이 확인할 수 있었다. 즉, 디스템퍼 항원량의 증가와 계속적인 ISA70의 사용으로 닭 혈중 평균항체 및 난황항체가는 각각 3.0 에서 6.0( 이상 log2 baseQ 로서, 디스템퍼 항원에 대한 닭에서의 항체형성능은 전술한 개 기관지폐렴균이나 파보바이러스에 비하여 매우 낮게 나타났다.
후속연구
- 개 디스템퍼 바이러스에 대한 닭 혈중 및 난황에 대한 항체역가를 바이러스 중화시험에 의하여 측정한 결과 #의 시험에서 다른 항원과의 혼합에 의한 백신 접종 시 adjuvant 종류 및 접종횟수에 관계없이 중화시험에 의한 항체형성이 확인되지 않았고, 그 이후 디스템퍼 단일 항원에 대하여 adjuvant로서 ISA70을 사용하여 2주 간격으로 3회에 걸쳐 추가 접종한 후에 비로서 항체 형성이 확인된 것은 항원량의 증가와 ISA70 의 사용의 결과로 추정되나 개 기관지폐렴균이나 파보바이러스에 비해 상대적으로 항체역가가 낮고 치료목적으로 사용하는 데는 어려움이 예상되어 이에대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되었다.
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