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문제 정의
- [1, 6, 9, 21]. 따라서 본 연구에서는 대전소재 도축장에서 도축되는 정상 돼지 분변을 채취하여 STEC 분리 시험을 하여 326개의 분변 재료에서 13주를 동정하고 병원 학적 및 유전학적 성상을 연구하였다.
제안 방법
- 5 mM) 4|il, taq polymerase(바이오니아) 1(2 Unit) 그리고 멸균증류수 371를 가하여 총 50 가 되도록 혼합한 후 PCR을 수행하였다. 1% ethidium bromide agarose gel을 이용하여 전기영동 하였고 Image Analyser(Pharmacia판독하였다 [16, 24].
- 13주 STEC의 plasmid profile을 비교하여(Fig. 2), 10~11개(약 100, 40, 20, 5.0, 4.0, 2.5, 2.3, 2.0, 1.8, 1.5 및 1.0 Kb 크기)의 밴드를 나타내는 S1, S2, S3 및 S4주는 A형, 4개(약 100, 20, 4.0 및 2.0 Kb 크기 밴드가 관찰된 S9, S10, S11 및 S12주는 B형, 그리고 2개(약 100 및 20 Kb 크기)의 밴드를 보이는 S5, S7 및 S8주는 C형으로 구분하였다. 또한 7개(약 100, 80, 20, 4.
- 13주의 STEC 분리주에 대해 STX1(STX1-F, STX1-R) 및 STX2(STX2-F, STX2-R) primers를 이용하여 PCR을 실시하였으며, Reverse passive latex agglutination test로 독소형을 시험하였다. 그 결과 Fig.
- 2001년 12월부터 2002년 10월까지 대전소재 도축장에서 도죽된 돼지 326두의 분변을 채쥐하여 균분리 배양법, PCR 및 colony hybridization 방법을 이용하여 13 주(3.9%)의 shiga toxin-producing E. coli(STEC:를 분리하였다. STEC 분리주에 대해 PCR을 실시한 바 STX common primer인 STXc에서는 13주 모두 518 bp의 특이 밴드가 나타났고, STX1 primers 에서는 4주에서 stxl 유전자에 해당되는 130 bp, 그리고 STX2 primers에서는 9주에서 stx2 유전자에 해당되는 378bp의 특이 밴드가 각각 관찰되었다.
- coli ATCC 35150(STEC, O157:H7 대조용 균주로 공시하였다. Brain heart infusion broth(BHI, Difco), Luria-Bertani broth(LB broth, Difco), SIM 배지 (Difco), MacConkey agar(Difbo) 공시하였다. 또한 MacConkey agar에 D-sorbitol(Difco) 1% 되게 첨가한 Sorbitol MacConkey agar를 선택배지로 사용하였다.
- E. coli antisera kit(Denka Seiken, Tokyo, Japan)를 이용하여 수행하였다 [23]. O 혈청형 시험은 분리균을 BHI agaefl 접종하여 37oC에서 18시간 배양한 후 백금이의 3~4배 크기의 균을 채취하여 3 ml의 멸균 생리식염수에 부유시켰다.
- 0, 1 mM EDTA)에 부유하여 digoxigenin이 표지된 gene probe DNA를 제조하였다. Nylon membrane (Boehringer Mannheim, Germany)을 LB agar에 형성된 집락에 붙이고 5분간 정치시킨 후 떼어내어 filter paper (Whatmann, Germany) 위에서 변성액 (0.5N NaOH, 1.5M NaCl로 15분간, 중화액 (1.5M NaCl, 1M Tris로 15 분간 각각 처리하고, 다시 2X SSC(0.3M NaCl, 30mM Sodium citrate, pH 7.0 15분간 처리하였다. 용해된 집락을 30분간 80oC로 열을 가해 DNA를 고정하였다.
- [24]. STEC과 E. coli O157의 검출을 위해 STXc [16] 및 RfbE [26] primers를, toxin typing을 위해 STX1 [25] 및 STX2 [19] primers를, 그리고 병원성 인자인 intimin과 enterohemolysin 관련 유전자 검출을 위해 EaeA [13] 및 HlyA [15] primers를 각각 작제하였다 (Table 1).
- [2이의 방법을 응용하여 수행하였다. STXc primers로 증폭된 518bp의 DNA 분절을 100oC에서 1간 꿇여 denaturation 시킨 후 2 의 hexaprimer와 2 의 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 digoxigenin이 표지된 dUTP를 첨가하고 1 의 Klenow enzyme을 가하여 37oC에서 18시간 동안 반응시킨 다음 2l의 EDTA 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. 이어서 4M lithium chloride 용액과 100% ethanol 으로 침전시켰으며 이것을 50 μ l의 TE용액 (100mM TrisCl, pH 8.
- STXc primers를 이용한 PCR에서 양성반응을 보인 균주들을 E. coli O157에 특이적인 RfbE primers를 이용한 PCR을 수행하였다. 또한 Farmer et al.
- 또한 Farmer et al. [11]의 방법에 따라 Sorbitol MacConkey agar 평판에 접종하고 18~24시간 배양한 후 sorbit이를 분해하지 않는 백색 집락을 선발하고 다시 MacConkey agar 평판에 도말하여 유당을 분해하는 집락을 검색하였다.
- Germany)와 Masahisa et al. [2이의 방법을 응용하여 수행하였다. STXc primers로 증폭된 518bp의 DNA 분절을 100oC에서 1간 꿇여 denaturation 시킨 후 2 의 hexaprimer와 2 의 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 digoxigenin이 표지된 dUTP를 첨가하고 1 의 Klenow enzyme을 가하여 37oC에서 18시간 동안 반응시킨 다음 2l의 EDTA 용액을 가하여 반응을 정지시켰다.
- STXc primers를 이용한 PCR에서 양성반응을 보인 배양액을 MacConkey agarf] 접종한 후 분홍색을 나타내는 집락을1b agar에 접종하여 colony hybridization을 실시한 결과 100개의 집락 중 2~9개의 집락이 STEC으로 증명되었다. 각 분변가검물로부터 STEC으로 증명된 집락 중 하나를 선택하여 순수배양하였으며 분리주를 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12 및 S13으로 명명하였다(Table 2).
- 균부유액을 95oC 에서 5분간 처리한 후 15,000 rpm 에서 원침한 다음 상층액 1 μ/에 STXc-F와 STXc-R 각각 1 \kl 씩, 1O reaction buffer(100mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15mM MgCl2, pH9.0) 5 , dNTPs mixture(10mM, each dNTP 2.5 mM) 4|il, taq polymerase(바이오니아) 1(2 Unit) 그리고 멸균증류수 371를 가하여 총 50 가 되도록 혼합한 후 PCR을 수행하였다. 1% ethidium bromide agarose gel을 이용하여 전기영동 하였고 Image Analyser(Pharmacia판독하였다 [16, 24].
- 0 Kb 크기 밴드가 관찰된 S9, S10, S11 및 S12주는 B형, 그리고 2개(약 100 및 20 Kb 크기)의 밴드를 보이는 S5, S7 및 S8주는 C형으로 구분하였다. 또한 7개(약 100, 80, 20, 4.5, 4.3, 3.0 및 2.2 Kb 크기)의 밴드를 나타내는 S6주와 4개(약 100, 20, 3.5 및 3.3 Kb 크기)의 밴드를 보이는 S13주는 D형으로 분류하였다 (Table 2).
- 시험하였다. 또한 enterohemolysin과 intimin 을 암호하는 hlyA 및 eaeA 유전자를 검색하고 분리 균주의 plasmid profile] 대한 일련의 시험을 수행하였다.
- coli 관련 43개 항혈청을 각각 떨어뜨린 후 항원액 10 씩을 가하여 혼합한 다음 응집 유무를 관찰하였다. 별 시험은 분리된 STEC을 SIM 배지에서 3~5회 계대 배양하여 운동성을 증가시킨 후 실시하였다. 시험관에 병원성 E.
- 본 연구에서는 대전지역소재 도축장에서 도축되는 돼지의 장분변에 대해 배양법, PCR 및 colony hybridization 을 이용하여 STEC을 분리하고 reverse passive latex agglutination test를 이용하여 Stx 독소의 유전자형과 독소형을 시험하였다. 또한 enterohemolysin과 intimin 을 암호하는 hlyA 및 eaeA 유전자를 검색하고 분리 균주의 plasmid profile] 대한 일련의 시험을 수행하였다.
- O 혈청형 시험은 분리균을 BHI agaefl 접종하여 37oC에서 18시간 배양한 후 백금이의 3~4배 크기의 균을 채취하여 3 ml의 멸균 생리식염수에 부유시켰다. 부유액을 121oC에서 15분간 처리한 후 900 g에서 2간 원심분리하여 상층액을 버리고 0.5ml의멸균 생리식염수를 가하여 사용하였다. 슬라이드 글라스 위에 병원성 E.
- 5ml의멸균 생리식염수를 가하여 사용하였다. 슬라이드 글라스 위에 병원성 E. coli 관련 43개 항혈청을 각각 떨어뜨린 후 항원액 10 씩을 가하여 혼합한 다음 응집 유무를 관찰하였다. 별 시험은 분리된 STEC을 SIM 배지에서 3~5회 계대 배양하여 운동성을 증가시킨 후 실시하였다.
- 별 시험은 분리된 STEC을 SIM 배지에서 3~5회 계대 배양하여 운동성을 증가시킨 후 실시하였다. 시험관에 병원성 E. coli 관련 22개 H항혈청 100와 항원액 0.5 ml 씩을 각각 혼합한 후 50oC 항온수조에서 1시간 반응시킨 다음 응집상태를 관찰하였다. 결과의 판정은 별 시험은 1분내에 강한 응집반응을 나타내는 것은 양성으로 판정하였다.
- 시험균주를 Mueller Hinton medium(Difco) 에 접종한 후 Sensi-Disc(Becton Dickinson, U.S.A.)을 이용하여 amikacine(AN, 301g), amoxicillin-clavulanic acid(AMC, 20 |ig+10 |ig), ampicillin(AM, 10 |ig), cefazolin (CZ, 30 |ig), ceftiofur(CT, 30 |ig), cephalothin(CF, 30 |ig), ciprofloxacin(CIP, 5 g), clindamycin(CC, 2 g), colistin (CL, 10 μg), enrofloxacin(ENR, 51g), erythromycin(E, 15g), gentamicin(GM, 10g), kanamycin(K, 30g), lincomycin (L, 2g), linco-spectin(LS, 15 g+200 g), neomycin(N, 30 |g), streptomycin(S, 10 |g), sulfamethoxazole-trimethoprim(SXT, 23.75 |g+1.25 |g), tetracycline(TE, 30 |g), tylosin(TL, 150 |g)의 20가지 항생제에 대한 내성을 검사하였다 [16].
- 96 well V-type microplate(Becton Dickinson, USA:를 이용하여 25 의 희석액이 가해진 well에 균 배양 상층액을 가하여 2배 단계 희석하였다<1:2~1:128). 여기에 Stx1 토끼항체와 Stx 2 토끼항체가 각각 코팅된 라텍스 입자를 25 씩 가하였다. 음성대조로 정상 토끼 IgG 가 코팅된 라텍스입자를 공시하였고, 양성대조로는 verotoxin 1과 2를 공시하였다.
- STXc primers로 증폭된 518bp의 DNA 분절을 100oC에서 1간 꿇여 denaturation 시킨 후 2 의 hexaprimer와 2 의 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 digoxigenin이 표지된 dUTP를 첨가하고 1 의 Klenow enzyme을 가하여 37oC에서 18시간 동안 반응시킨 다음 2l의 EDTA 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. 이어서 4M lithium chloride 용액과 100% ethanol 으로 침전시켰으며 이것을 50 μ l의 TE용액 (100mM TrisCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 부유하여 digoxigenin이 표지된 gene probe DNA를 제조하였다. Nylon membrane (Boehringer Mannheim, Germany)을 LB agar에 형성된 집락에 붙이고 5분간 정치시킨 후 떼어내어 filter paper (Whatmann, Germany) 위에서 변성액 (0.
- 용해된 집락을 30분간 80oC로 열을 가해 DNA를 고정하였다. 이후 kit 사용 방법에 따라 hybridization 반응과 발색반응시험을 수행하였고, STEC 양성으로 증명된 집락을 선택하여 다음 시험에 공시하였다.
대상 데이터
- 2001년 12월부터 2002년 10월까지 대전지역 도축장에서 무작위로 선정한 정상돼지(5~6개월령, 90~110kg) 326두의 결장부위를 무균적으로 절개 후 내용물을 멸균 면봉으로 3~5 g 정도 채취하여 생리식염수가 첨가된 멸균 수송용기에 넣어 냉장상태를 유지하면서 실험실로 운반하여 공시하였다.
- E. coli ATCC 35150(STEC, O157:H7 대조용 균주로 공시하였다. Brain heart infusion broth(BHI, Difco), Luria-Bertani broth(LB broth, Difco), SIM 배지 (Difco), MacConkey agar(Difbo) 공시하였다.
- 여기에 Stx1 토끼항체와 Stx 2 토끼항체가 각각 코팅된 라텍스 입자를 25 씩 가하였다. 음성대조로 정상 토끼 IgG 가 코팅된 라텍스입자를 공시하였고, 양성대조로는 verotoxin 1과 2를 공시하였다. Microplat 습윤상자에 넣어 실온에서 18시간 반응시킨 후 침전정도를 육안으로 확인하였으며 반응정도에 따라 1+에서 3+로 표시하였다.
이론/모형
- PCR 결과 stx 유전자 양성반응을 나타낸 분변의 배양액은 MacConkey agE] 도말하여 37oC에서 18시간 배양 후 분홍색을 나타내는 100개의 집락을 LB agar에 patching method로 재 접종하여 colony hybridization에 사용하였다 [24]. STEC과 E.
성능/효과
- 13주의 STEC 분리주에 대한 plasmid profile 분석 결과 4가지 패턴이 관찰되었으며, 20종의 항생제에 대한 내성패턴을 plasmid profile 패턴과 비교한 바 높은 연관성을 보였다.
- 4%)가 각각 내성을 나타내었다. AN, GM, LS 및 N에 대해서는 13주 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 나머지 항생제에 대해서는 중등도 이상의 감수성을 나타냈다 (Table 4).
- Amikacin을 포함한 20개의 항생제에 대한 내성 검사 결과 분리된 13주의 STEC 모두 AM, CC, E, L, S, TE, TL의 7가지 항생제에 대해 내성을 나타냈으며 CF에 대해 2주(15.4%), ENR에 대해 2주(15.4%), K 에 대해 4주 (30.8%) 그리고 SXT에 대해 2주(15.4%)가 각각 내성을 나타내었다. AN, GM, LS 및 N에 대해서는 13주 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 나머지 항생제에 대해서는 중등도 이상의 감수성을 나타냈다 (Table 4).
- coli(STEC:를 분리하였다. STEC 분리주에 대해 PCR을 실시한 바 STX common primer인 STXc에서는 13주 모두 518 bp의 특이 밴드가 나타났고, STX1 primers 에서는 4주에서 stxl 유전자에 해당되는 130 bp, 그리고 STX2 primers에서는 9주에서 stx2 유전자에 해당되는 378bp의 특이 밴드가 각각 관찰되었다. stxl과 stx2를 동시에 가지는 STECe관찰되지 않았으며, PCR 에서 Stx2에 양성반응을 나타낸 S8 및 S13주는 음성으로 나타났으며, 13주의 STEC 모두 eaeA, hlyA, rfbE 유전자가 검 줄되지 않았다.
- STEC으로 동정된 13주를 Sorbitol MacConkey agar에 배양하였던 바 모두 분홍색 집락을 나타내어 O157 음성이었다. 또한 RfbE primers를 이용하여 PCR을 수행하였던 바 모두 음성이었으며, O 및 H 형에 대한 혈청형 시험에서도 O157형은 검색되지 않았다(Table 2).
- 1, Table 2). STXc primers를 이용한 PCR에서 양성반응을 보인 배양액을 MacConkey agarf] 접종한 후 분홍색을 나타내는 집락을1b agar에 접종하여 colony hybridization을 실시한 결과 100개의 집락 중 2~9개의 집락이 STEC으로 증명되었다. 각 분변가검물로부터 STEC으로 증명된 집락 중 하나를 선택하여 순수배양하였으며 분리주를 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12 및 S13으로 명명하였다(Table 2).
- Stx와 더불어 enterohemorrhagic E. coli가 질병을 유발시키는데 작용하는 94 kDa크기의 장내부착인자인 intimin을 암호하는 유전자와, 90 Kb 크기로 plasmid에 위치하는 enterohemolysin 암호 유전자를 검출하기 위해 각각 EaeA와 HlyA primers를 작제하여 PCR을 실시하였으나 13 STEC 분리주 모두에서 음성반응이 나타났다. 또한 분리주의 plasmid profile 결과와 비교하여 볼 때 90 Kb와 비슷한 크기의 plasmid는 관찰되었으나 enterohemolysin을 암호화 하는 hlyA gen 없는 것으로 생각된다.
- STEC 분리주에 대해 PCR을 실시한 바 STX common primer인 STXc에서는 13주 모두 518 bp의 특이 밴드가 나타났고, STX1 primers 에서는 4주에서 stxl 유전자에 해당되는 130 bp, 그리고 STX2 primers에서는 9주에서 stx2 유전자에 해당되는 378bp의 특이 밴드가 각각 관찰되었다. stxl과 stx2를 동시에 가지는 STECe관찰되지 않았으며, PCR 에서 Stx2에 양성반응을 나타낸 S8 및 S13주는 음성으로 나타났으며, 13주의 STEC 모두 eaeA, hlyA, rfbE 유전자가 검 줄되지 않았다.
- 균주별 내성 양상은 1의 약제에 대한 내성균이 1주, 8종의 약제에 대한 내성균이 7주, 7종의 약제에 대한 내성균이 5주로 나타났다(Table 5). 항생제 내성과 plasmid profile pattern을 비교한 바 A 형 4주는 AM, CC, E, K, L, S, TE 및 TL, 그리고 B형 4주는 AM, CC, E, L, S, TE 및 TL 에 대해 저항성을 보여 완전 일치하였다.
- 시험하였다. 그 결과 Fig. 1 및 Table 2에서 나타낸 바와 같이 13주의 STEC 분리주 중 S1, S2, S3 및 S4주는 stxl 유전자에 해당하는 130bp의 특이밴드가 증폭되었으며 S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12 및 S13 주에서는 stx2 유전자에 해당하는 378bp의 특이 밴드가 증폭되었으며, stxl 과 stx2를 동시에 가지는 STECe 관찰되지 않았다.
- 대전지역소재 도축장에서 채취한 돼지 분변가검물 326 건을 배양하고 Stx common primer STXc를 이용하여 PCR을 실시한 결과 13개(3.9%)의 분변에서 518 bp의 특이 밴드가 증폭됨을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1, Table 2). STXc primers를 이용한 PCR에서 양성반응을 보인 배양액을 MacConkey agarf] 접종한 후 분홍색을 나타내는 집락을1b agar에 접종하여 colony hybridization을 실시한 결과 100개의 집락 중 2~9개의 집락이 STEC으로 증명되었다.
- 0~125Kb 크기의 다양한 수의 plasmid} 관찰되었다는 연구 결과와 유사하였다. 또한 13주의 STEC의 plasmid 패턴과 내성을 나타내는 항생제제의 종류를 plasmid 형과 균주 간에 상호 비교한 바 매우 연관성이 높다는 사실을 알 수 있었다. 다만 S8주의 경우 다른 분리주들에 비해 함유하고 있는 plasmid의 수는 적지만 1의 항생제에 내성을 나타내는 것으로 보아 함유하고 있는 plasmid 내에 많은 항생제에 대한 내성 유전자가 존재할 가능성이 있는 것으로 생각된다.
- [1]. 또한 E. coli O157:H7 신속검출을 위한 multiplex-PCR 기법을 확립하여 쇠고기에 대한 검출시험을 실시한 결과 s&J 과 stx2 유전자를 가진 E. col를 검출한 바 있다. [3].
- 또한 RfbE primers를 이용하여 PCR을 수행하였던 바 모두 음성이었으며, O 및 H 형에 대한 혈청형 시험에서도 O157형은 검색되지 않았다(Table 2). 또한 intimin과 enterohemolysin 검출을 위해 EaeA 및 HlyA primers를 각각 이용하여 PCR을 수행한 바 13주의 STEC 분리주 모두 음성으로 나타났다(Table 2).
- 또한 STXc primer 이용한 PCR 에서 특이밴드를 나타내는 분변 가검물에 대해 colony hybridization을 수행한 바 100개 당 2~9개의 집락이 STEC 특이 반응을 보였다. 13주의 STEC 분리주에 대한 plasmid profile 분석 결과 4가지 패턴이 관찰되었으며, 20종의 항생제에 대한 내성패턴을 plasmid profile 패턴과 비교한 바 높은 연관성을 보였다.
- 또한 RfbE primers를 이용하여 PCR을 수행하였던 바 모두 음성이었으며, O 및 H 형에 대한 혈청형 시험에서도 O157형은 검색되지 않았다(Table 2). 또한 intimin과 enterohemolysin 검출을 위해 EaeA 및 HlyA primers를 각각 이용하여 PCR을 수행한 바 13주의 STEC 분리주 모두 음성으로 나타났다(Table 2).
- coli가 질병을 유발시키는데 작용하는 94 kDa크기의 장내부착인자인 intimin을 암호하는 유전자와, 90 Kb 크기로 plasmid에 위치하는 enterohemolysin 암호 유전자를 검출하기 위해 각각 EaeA와 HlyA primers를 작제하여 PCR을 실시하였으나 13 STEC 분리주 모두에서 음성반응이 나타났다. 또한 분리주의 plasmid profile 결과와 비교하여 볼 때 90 Kb와 비슷한 크기의 plasmid는 관찰되었으나 enterohemolysin을 암호화 하는 hlyA gen 없는 것으로 생각된다. 이러한 성적은 Gannon 등 [13]이 돼지에서 분리한 4주의 STEC에 대해 multiplex PCR기법으로 eaeA 검출시험을 실시한 바 모두 음성이었다고 보고한 것과 같은 결과를 보였다.
- 본 시험에 공시한 가검물의 수량은 적은 편이나 국내건강 도축돈의 장관내에 서식하고 있는 STEC 의 독소형과 유전적 성상을 구명할 수 있었다. STEC 은 산업 동물 및 애완동물에 광범위하게 보균되어 있으며, 공중보건학적으로 중요한 인수공통병원체로 인정되고 있기 때문에 축종, 계절 및 지역별로 보다 광범위한 동물을 대상으로 분자역학적 연구를 수행할 필요가 있다고 생각된다.
- 균주별 내성 양상은 1의 약제에 대한 내성균이 1주, 8종의 약제에 대한 내성균이 7주, 7종의 약제에 대한 내성균이 5주로 나타났다(Table 5). 항생제 내성과 plasmid profile pattern을 비교한 바 A 형 4주는 AM, CC, E, K, L, S, TE 및 TL, 그리고 B형 4주는 AM, CC, E, L, S, TE 및 TL 에 대해 저항성을 보여 완전 일치하였다. C형 3주는 80~87.
후속연구
- 받을 수 있을 것으로 생각된다. 국내 STEC의 분리율이 다른 나라에 비해 비교적 낮으며, 특히 돼지에서 분리율이 낮게 나타난 것은 환경적 요인 외에 검사동물의 수와 사용한 검사법의 감수성 등 여러 요인이 작용한 결과이며, 이에 대한 지속적인 연구가 수행되어야 할 것이다.
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