[논문]홍경천(Rhodiola sachlinensis)에서 항균성 물질의 분리 및 동정

심창주; 이규희; 정재홍; 이상덕; 김영호; 오만진

[국내논문] 홍경천(Rhodiola sachlinensis)에서 항균성 물질의 분리 및 동정
Isolation and Identification of Antimicrobial Active Substances from Rhodiola sachlinensis 원문보기

한국식품저장유통학회지 = Korean journal of food preservation, v.11 no.1, 2004년, pp.63 - 70

심창주 (충남대학교 식품공학과) , 이규희 (충남대학교 식품공학과) , 정재홍 (충남대학교 식품공학과) , 이상덕 (충남대학교 식품공학과) , 김영호 (충남대학교 약학대학 약학부) , 오만진 (충남대학교 식품공학과)

초록
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홍경천의 천연 보존료로서의 이용성을 검토하기 위하여 각종 용매로 홍경천 추출물을 제조하고 극성에 따라 순차 분획, silica-gel chromatography, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography의 분리과정을 거쳐 순수 분리된 각 물질을 GC/MS(EI) spectrum, $^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR spectrum, 을 이용하여 항균물질을 동정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 홍경천에 대해 acetone, ethyl acetate, ethanol, methanol, chloroform, water의 각 용매로 추출한 결과 항균성분의 추출 용매로는 methanol이 가장 우수하였다. 홍경천 methanol 추출물을 n-hexane, chloroform, ethyl ether, ethyl acetate, n-butyl alcohol로 분획한 결과 ethyl acetate와 n-butyl alcohol 분획에서 우수한 항균력을 나타내었다. 홍경천 methanol 추출물은 그람양성 4균주와 그람음성 4균주에 대해 고체 배지의 경우 대체로 500 $\mu\textrm{g}$mL에서 최소저해를 나타냈으며, 액체배지의 경우 100 $\mu\textrm{g}$mL 내외에서 최소저해를 나타내었다. Silica gel column chromatography에서 용매의 비율을 높여가며 용출한 결과 chloroform methanol(8:2, v/v)의 비율에서 항균력이 가장 높게 나타났다. 분리된 항균성분을 silica-gel TLC plate에 용매의 비율을 높여가며 전개시켜 chloroform methanol(9:1, v/v)에서 9개의 물질군을 얻을 수 있었으며, 그중 항균력이 확인된 3개의 물질군을 HPLC와 NMR spectrum을 분석한 결과 gallic acid, (-)-epicatechin 및 kaempferol로 동정되었다. gallic acid, (-)-epicatechit kaempferol의 항균물질 각각의 최소저해농도는 Staphylococcu aureus와 Listeria monocytogenes에 대해 gallic acid와 kaempferol이 500 $\mu\textrm{g}$mL(-)-epicatechin이 100 UgfmL에서 저해를 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The antimicrobial substances from Rhodiola sachalinensis were extncted, isolated and identified. The highest level of antimicrobial activity and its yield were obtained in methanol extract. The minimum inhibition concentrations of the methanol extract were 500 $\mu\textrm{g}$mL on agar plate and 100 $\mu\textrm{g}$mL in broth media for four gram positive and four gram negative microbials. The methanol extract was fractionated by n-hexane, chloroform, ethyl ether, ethyl acetate, and butanol, orderly. The separate was developed on the TLC plate with different solvent system ratio of chloroform and methanol. Nine substances were isolated from chloroform and methanol mixture(9:1, v/v). Among them, three isolates showed antimicrobial activity. Three substances separated by HPLC were identified by GC/MS(EI) spectrum and $^1$H, /sup13/C-NMR spectrum. They were gallic acid, (-)-epicatechin and kaempferol. The antimicrobial activities of each substances were shown gallic acid, (-)-epicatechin, kaempferol orderly.

Keyword

AI 본문요약
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제안 방법

본 연구의 실험재료로 사용한 홍경천(Rhodiola sachlinensis : 참돌꽃)은 한방이나 민간요법에서 신체쇠퇴 억제, 노인병, 당뇨병, 각혈, 해열, 화상 등에 유효하다고 알려져 왔고 (14, 15) 노화방지와 성인병예방의 소재로 연구되어 왔으며(16), 항산화작용과 항돌연변이성에 대한 연구가 있다(17). 본 연구에서는 실용적인 천연 항균제를 개발하기 위하여 홍경천을 이용하여 용매별 추출물의 항균력을 검색하고, 여러 종류의 용매로 순차분획한 후 silica-gel column chromatography, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography 로 항균성 물질을 순수분리하여 GC/MS(EI), *H-NMR, 13C-NMR 로 동정하였다.
항균력 과 최소 저해농도 측정은 한천배지 확산법(agar diffusion method)으로 측정하였다. 즉, 각각의 시료용액을 0.45 "m membrane filter로 여과하여 제균하고 멸균된 paper disk에 60 mL씩을 흡수시키고 추출용매를 완전히 증발시켜 시험용 평판배지위에 밀착시킨 후 75 mL의 멸균된 증류수 를 paper disk 위에 떨어뜨려 확산시킨 다음 4℃냉장고에서 1시간 방치 후 31℃ incubator에서 24~48시간 배양 후 disk 주변의 clear zone의 직경을 측정하였다.
항균활성이 가장 좋은 추출용매를 확인하기 위해 홍경천 100 g에 각각의 acetone, ethyl acetate, ethanol, methanol, chloroform, water 용매를 10배량 가하여 24시간 동안 환류추 출 후 다시 용매를 10배량 가하여 24시간동안 2차 추출하고 glass filter로 여과하여 50 ℃ 에서 vacuum evaporator로 감압하 에서 농축하고 50℃ 에서 nitrogen evaporator로 용매를 완전히 제거한 후 24시간 동결건조시켜 증류수에 100 mL로 정용하여 항균력을 측정하였다.
홍경천 methanol 추출물에 극성을 달리하는 n-hexane, chloroform, ethyl ether, ethyl acetate, n -butyl alcohol 을 2배량 가하여 1시간 동안 funnel shaker로 shaking하여 3회 순차 분 획하고 각 분획용매를 회수하여 50C에서 감압농축 후 항균 력을 측정하였다 (Fig. 1).
홍경천 methanol 추출물을 순차분획하여 얻은 각 분획물 들의 항균활성을 측정 비교한 후, 활성이 가장 강한 ethyl acetate 분획물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 silica-gel column chromatography를 행하였다. 이때 사용된 colurnm의 크기는 4x30 cm 였고, chloroform-methanol 용매계로 0~ 100%까지 단계적으로 gradient하여 각각 분당 10mL씩 fraction collector로 분취하고 subfraction을 농축하여 paper disk법으로 항균활성을 측정하였다.
홍경천 methanol 추출물을 순차분획하여 얻은 각 분획물 들의 항균활성을 측정 비교한 후, 활성이 가장 강한 ethyl acetate 분획물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 silica-gel column chromatography를 행하였다. 이때 사용된 colurnm의 크기는 4x30 cm 였고, chloroform-methanol 용매계로 0~ 100%까지 단계적으로 gradient하여 각각 분당 10mL씩 fraction collector로 분취하고 subfraction을 농축하여 paper disk법으로 항균활성을 측정하였다.
TLC에서 항균성이 확인된 band를 모아서 감압농축한 항 균성 물질을 HPLC를 이용하여 최종 순수분리하였다. Semi preparative HPLC(Spectra System-P2000, USA), Cis column (Waters, p-bondapack GQ을 이용하여 1 차적으로 acetonitrile과 water의 용매를 사용해 gradient하여 가장 분리가 잘 되는 용 매비율을 확인한 후 농축한 각 band를 HHC로 분취하여 항 균력을 확인하였다 HPLC의 분석조건은 Table 2와 같다
TLC에서 항균성이 확인된 band를 모아서 감압농축한 항 균성 물질을 HPLC를 이용하여 최종 순수분리하였다. Semi preparative HPLC(Spectra System-P2000, USA), Cis column (Waters, p-bondapack GQ을 이용하여 1 차적으로 acetonitrile과 water의 용매를 사용해 gradient하여 가장 분리가 잘 되는 용 매비율을 확인한 후 농축한 각 band를 HHC로 분취하여 항 균력을 확인하였다 HPLC의 분석조건은 Table 2와 같다
순수분리된 항균성분 1 mg을 순수 Methanol에 녹여 JEOL SX-102A(254℃, high resolve)에 점작하여 gas chromatography 에서 휘발성 성분들을 분리시키고 electron impact 이온화법을 이용하여 70 V로 이온화시킨 물질을 capillary column(DB-5) 에 통과시켜 분자량을 측정하였다.
순수분리 된 항균성분을 tetramethylsilane 내부표준물질로 첨가하여 CDC₁₃("C-NMR)와 D2O(1H-NMR)에 녹인 다음 여 과하면서 NMR용 tube에 넣고 DMX-300(300 MHz), DMX- 600(600 MHz)를 이용하여 1H-NMR와 13C-NMR spectrum을 분석하였다.
또한 이 등(20)의 천연식물의 항균성 검색에서는 chloroform 분획에서만 항균 효과를 보이고 있어 분획 용매별로 각 균주에 대한 항균성 이 다른 것은 항균성 물질이 단일물질이 아니라는 것을 시 사하는 것으로 사료되었다. 본 실험에서는 ethyl acetate와 chloroform 분획에서 항균효과를 보였으나 당이나 단백질과 같은 일반 성분들이 다량으로 추출되어지기 때문에 분리가 어려우므로 ethyl acetate 분획을 항균성 물질 분획으로 분취 하였다.
TLC에서 항균력이 확인된 Rf 048, Rf 0.15 및 Rf 0.09의 subfraction 각각을 모아서 감압농축 하여 용매를 제거한 후 증류수에 녹여 semi preparative HPLC를 이용해 최종적으로 순수분리하였다. 그 결과 Fig.
555 peak에서 항균력을 확인하여 prep. HPLC로 분취한 순수분리 물질들을 동결건조하여 구조를 분석하였다.
지금까지 보고된 천연식물의 항균성 물질인 liquiritigenin(6), isorhamnetin (13), benzoic acid, salicylic acid, 3-hydrobenzoic, guaiacol, 4-vinylphenol 등의 phenolic compound(21) 등과 비교하여 월등한 저해력을 나타내었다.

대상 데이터

본 연구의 실험재료로 사용한 홍경천(Rhodiola sachlinensis : 참돌꽃)은 한방이나 민간요법에서 신체쇠퇴 억제, 노인병, 당뇨병, 각혈, 해열, 화상 등에 유효하다고 알려져 왔고 (14, 15) 노화방지와 성인병예방의 소재로 연구되어 왔으며(16), 항산화작용과 항돌연변이성에 대한 연구가 있다(17). 본 연구에서는 실용적인 천연 항균제를 개발하기 위하여 홍경천을 이용하여 용매별 추출물의 항균력을 검색하고, 여러 종류의 용매로 순차분획한 후 silica-gel column chromatography, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography 로 항균성 물질을 순수분리하여 GC/MS(EI), *H-NMR, 13C-NMR 로 동정하였다.
본 실험에 사용한 홍경천은 1999년 중국 길림성 연변에서 구입한 것을 음건 세절한 후 시료로 사용하였다.
항균성분 추출과 순차 분획용 유기용매(methanol, hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol)는 99%이상의 1 급 및 특급 시약, HPLC, NMR, GC/MS(EI) 분석용매는 Fisher의 99.9%이상의 특급용매를 helium degassing하여 사용하였다. Column chromatography의 resin으로 사용한 silica gel 60과 TLC plate(silica gel 60, 20x20 cm, 0.
9%이상의 특급용매를 helium degassing하여 사용하였다. Column chromatography의 resin으로 사용한 silica gel 60과 TLC plate(silica gel 60, 20x20 cm, 0.25 mm)는 Merck사의 제품을 사용하였으며, HPLC는 spectra system P-2000 (TSP, USA)을, gas chromatography는 JMS-SX 102A(JEOL, Japan) 을, mass spectrometer (High Resolution-EI)t DS6200 GC (Donam, Korea), NMR spectrometere DMX-3OO(3OO MHz)와 DMX-600 (600 ㎒, Bruker, Germany)를 사용하였다.
항균활성 측정 에 사용된 공시 균주는 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자 은행에서 분양받아 사용하였으며 , 항균활성 측정에 사용된 배지는 Difco의 nutrient agar를 기층 용 배지로, Mueller Hinton medium을 중층용 배지로 사용하였으며, nutrient broth 배지는 계대 배양용을 사용하였다. 본 실험에 사용된 균주는 Table 1과 같다.
5 mm, Merck))상에 점적 한 후 전개용매에 의해 포화 상태가 형성된 chamber에서 전 개시켰다. 전개용매는 아ilomfonn-methanol(9:l, v/v)을 사용하였으며, UV 254 nm와 365 nm에서 관찰하였다.

이론/모형

항균력 과 최소 저해농도 측정은 한천배지 확산법(agar diffusion method)으로 측정하였다. 즉, 각각의 시료용액을 0.

성능/효과

홍경천의 항균물질 용매별 추출물의 항균력은 Table 3과 같이 각 용매별 추출물에서 전반적으로 항균력을 보였으며, 그 중에서도 methanol 추출물이 타 용매에 비해 월등히 높은 항균력을 보였다. 또한 추출물의 건조 후 수율에서도 ethyl acetate, chloroform 및 물 추출물은 3% 이하의 수율을 나타내 었고, acetone 4.
홍경천의 항균물질 용매별 추출물의 항균력은 Table 3과 같이 각 용매별 추출물에서 전반적으로 항균력을 보였으며, 그 중에서도 methanol 추출물이 타 용매에 비해 월등히 높은 항균력을 보였다. 또한 추출물의 건조 후 수율에서도 ethyl acetate, chloroform 및 물 추출물은 3% 이하의 수율을 나타내 었고, acetone 4.7%, ethanoi 18.7%, methanol 19.8%의 수율을 보였다. 이와 같은 결과는 송 등(1)의 한약재 추출물의 항균 력 검색, 여 등(4)의 천연 식물로부터의 항균력 검색에 대한 실험결과와 비슷하게 나타났으므로 홍경천의 항균성 물질 추 출용매로는 methanol이 적절한 용매로 판단되었다.
홍경천 methanol 추출물을 그람음성과 양성의 대표 균주 에 대해 고체배지와 액체배지에서 최소저해농도를 측정한 결과는 Table 4와 같다. 그람음성균들에 비해 그람양성균들 이 대체적으로 저해가 크게 나타났으며, 고체배지의 경우 최소 500 /zg/mL 의 농도에서 전체 시험균주에 대한 저해를 나타내었고 액체배지의 경우 최소 100 mL의 농도에서 저해를 나타내었다. 이 등(18)은 유백피 추출물이 Bacillus subtilis 등 그람양성균 5종과 Escherichia coli 등 그람음성균 5종에 대한 저해농도가 15-20 mg/mL이라고 보고하였고, 박 등(25)이 갓 추출물의 최소저해농도가 Escherichia coli 균주 에 대해 35 mg/mL이고 다른 균주에 대해서는 40 -60 mg/mL 에서 최소저해를 나타낸 것과 비교해 볼 때 홍경천 추출물 은 월등히 높은 항균활성을 나타내었다.
홍경천 methanol 추출물을 증류수에 100 mL로 정용한 후 극 성을 달리하는 용매를 2배량 사용하여 순차분획을 한 각각의 분획물을 다시 감압 농축하여 항균력을 시험한 결과 Table 5와 같이 n-hexane과 chloroform분획은 특정균에 대해 서만 어느 정도의 항균력을 보였으며, ethyl acetate 분획과 "-butyl alcohol 분획은 타 용매 분획과 비교해 월등한 항균 력을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 홍경천 methanol 추출물 중의 항균물질은 특정용매에만 해당되지 않고 일부 다른 용 매에도 용해되는 성분으로서 한가지 성분이라기 보다는 여러가지 항균성 물질이 서로 복합적으로 작용하고 있는 것을 추측 할 수 있었으며, 그 중 항균물질이 ethyl acetate와 butyl alcohol 분획으로 많이 이행되었음을 알 수 있었다.
홍경천 methanol 추출물을 증류수에 100 mL로 정용한 후 극 성을 달리하는 용매를 2배량 사용하여 순차분획을 한 각각의 분획물을 다시 감압 농축하여 항균력을 시험한 결과 Table 5와 같이 n-hexane과 chloroform분획은 특정균에 대해 서만 어느 정도의 항균력을 보였으며, ethyl acetate 분획과 "-butyl alcohol 분획은 타 용매 분획과 비교해 월등한 항균 력을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 홍경천 methanol 추출물 중의 항균물질은 특정용매에만 해당되지 않고 일부 다른 용 매에도 용해되는 성분으로서 한가지 성분이라기 보다는 여러가지 항균성 물질이 서로 복합적으로 작용하고 있는 것을 추측 할 수 있었으며, 그 중 항균물질이 ethyl acetate와 butyl alcohol 분획으로 많이 이행되었음을 알 수 있었다.
극성을 달리하는 각각의 용매별 순차분획물을 Staphylococcus aureus와 Escherichia coli에 대해 항균활성을 확인한 결과 Fig. 2과 같이 chkmfomi과 methanol의 비율이 8:2(v/v)에서 가장 우수한 항균력을 나타내었다.
09의 subfraction 각각을 모아서 감압농축 하여 용매를 제거한 후 증류수에 녹여 semi preparative HPLC를 이용해 최종적으로 순수분리하였다. 그 결과 Fig. 4, Fig. 5 및 Fig. 6의 각 물질 에 대한 최종 chromatogram을 얻을 수 있었으며, 각각의 chromatogmm에서 Fig.3의 TLC Rf 0.48에서 용출한 RT3.817, 7.485, Fig. 4의 Rf 0.15 에서 용출한 RT 10.138, 10.795, Fig. 5의 Rf 0.09에서 용출한 RT 6.766, 8.555의 각 peak들을 분취하여 항균력을 확인한 결과 Rf 0.48 band의 RT 3.817 peak, Rf 0.15band의 10.138 peak, Rf 0.09 band의 RT 8.555 peak에서 항균력을 확인하여 prep. HPLC로 분취한 순수분리 물질들을 동결건조하여 구조를 분석하였다.
각 흡수 peak와 mass spectnnm을 조합하고 Wiley/NBS mass library를 비교하였으며 standard 물질을 HPLC로 확인한 결과 [ I ] 물질은 gallic acid(3, 4, 5- Trihydroxybenzoic acid)로 확인되었다.
각 흡수 peak와 mass spectrum을 조합하고 Wiley/NBS mass library를 비교하였으며 standard 물질을 HPLC로 확인한 결과 [H] 물질은 (-)-epicatechin (cis-2-[3, 4-Dihydroxyphenyl]- 3, 4dhyd2-2H-l~benzop/Taii-3, 5, 7-Hol)으로 확인되었다.
4(C-8)로 분석되었다. 각 흡수 peak와 mass spectrurml을 조합하고 Wiley/ NBS mass library를 비교하였으며, standard 물질을 HPLC로 확인한 결과 [Ⅲ] 물질은 kaempferol (3, 5, 7-Trihydroxy-2-[4-hydroxyphenyl]-4H- 1-benzopyran- 4-one)로 확인되었다.

참고문헌 (21)

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이경행, 전은경, 유시영, 오만진 (2000) 유백피 추출물의 항산화 활성. 한국 농산물저장유통학회지 7, 373-379
Hong, N.D., Rho, Y.S., Kim, N.J. and Kim, J.S.(1990) studies on the constituents of Ulmi cortex., Kor. J. Pharmacogn, 21, 201-204
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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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