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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기존에 널리 사용되어온 환류 냉각 추출 방법과 마이크로웨이브 추출 방법을 비교하고 참취를 추출하는데 있어서 적정한 마이크로웨이브 추출 조건을 설정하고자 하였다. 이를 위하여 환류 냉각 추출과 마이크로 웨이브 추출 방법을 사용하여 메탄올, 에탄올 및 물을 가지고 참취로부터 추출물을 얻고 각 추출방법에 따른 가용성 고형분 함량과 총 폴리페놀 함량을 비교하였다.
제안 방법
- 마이크로 웨이브 추출(MAE)에 사용된 추출장치는 Soxwave-100(Prolabo, France)으로 마이크로웨이브 에너지 강도를 30 W(watts) 단위로 최대 300 W까지 높일 수 있었으며 주파수는 2, 450 MHz이었다. RE와의 추출 효율을 비교하기 위한 마이크로 웨이브 추출은 밀폐형 추출관(closed extraction vessel)에서 120 W의 마이크로 웨이브 에너지로 8분 동안 수행하였다. 최적 마이크로 웨이브 추출조건을 선정하기 위하여 마이크로 웨이브 에너지의 경우 60-210 W로 추출 시간의 경우는 1~15분으로 변화시키면서 추출하였다.
- 각각의 추출 조건에 의해 추출한 추출물을 회전 감압증발기를 사용하여 농축시키고 105℃ 건조 오븐(Forced convection oven, Jeico Tech, Korea)에서 건조한 후 항량이 되었을 때의 무게를 측정하였으며 2회 측정한 평균값을 건조 참취 100 g에 대한 solid 함량으로 나타내었다.
- 이를 위하여 환류 냉각 추출과 마이크로 웨이브 추출 방법을 사용하여 메탄올, 에탄올 및 물을 가지고 참취로부터 추출물을 얻고 각 추출방법에 따른 가용성 고형분 함량과 총 폴리페놀 함량을 비교하였다. 그리고 추출 용매, 마이크로 웨이브 에너지, 추출 시간 등의 추출 조건을 변화시켜가며 얻은 참취 추출물의 가용성 고형분 및 총 폴리페놀 함량을 측정하고 DPPH(α, α-diphenyl-picryl-hydrazl)에 대한 전자공여능(electron donating ability)으로 항산화성을 조사하였으며 이들의 변화 양상으로부터 마이크로웨이브 추출 공정의 최적 추출 조건을 선정하고자 하였다.
- 3회의 추출로 얻은 약 150 mL의 여과액을 40℃ 이하에서 rotary vacuum evaporator(Rotavapor R-124, Buchi, Swizerland)를 사용하여 농축시키고 건조하였다. 여기에 물 50 mL를 가하여 참취 추출물로 하고 총 폴리페놀 함량과 항산화 작용의 측정에 사용하였다.
- 즉, 희석액 5 mL에 Folin reagent 5 mL을 가하고 3분간 정치한 다음 5 mL의 10% Na2CO3용액을 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 정치한 후 분광광도계(UV/VIS Spectrophotometer, Jasco, Japan)를 사용하여 760 run에서 흡광도를 측정하고 (+)catechin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다. 각 추출물의 총 폴리페놀 함량은 2회 측정하고 그 평균값을 100 g 건조 시료 중의 g(+)catechin 당량으로 나타내었다.
- 하였다. 이를 위하여 환류 냉각 추출과 마이크로 웨이브 추출 방법을 사용하여 메탄올, 에탄올 및 물을 가지고 참취로부터 추출물을 얻고 각 추출방법에 따른 가용성 고형분 함량과 총 폴리페놀 함량을 비교하였다. 그리고 추출 용매, 마이크로 웨이브 에너지, 추출 시간 등의 추출 조건을 변화시켜가며 얻은 참취 추출물의 가용성 고형분 및 총 폴리페놀 함량을 측정하고 DPPH(α, α-diphenyl-picryl-hydrazl)에 대한 전자공여능(electron donating ability)으로 항산화성을 조사하였으며 이들의 변화 양상으로부터 마이크로웨이브 추출 공정의 최적 추출 조건을 선정하고자 하였다.
- 즉, 희석액 0.2 mL에 99.9%의 에탄올에 용해한 4×10-4M DPPH용액 0.8 mL, pH를 6.5로 조정한 0.1 M phosphate buffer 2 mL와 99.9% 에탄올 2 mL을 가하여 10초간 혼합하고 10분 후에 분광광도계를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여 효과는 2회 측정하여 그 평균값을 구하였으며 추출물을 첨가하지 않은 구에 대한 추출물 첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
- 환류냉각 추출(RE) 방법은 냉간관이 부착된 heating mantle에서 실시하였으며 1회 추출 시간은 2시간이었다. 마이크로 웨이브 추출(MAE)에 사용된 추출장치는 Soxwave-100(Prolabo, France)으로 마이크로웨이브 에너지 강도를 30 W(watts) 단위로 최대 300 W까지 높일 수 있었으며 주파수는 2, 450 MHz이었다.
대상 데이터
- RE와 MAE 추출 방법 그리고 MAE 추출의 경우 마이크로 웨이브 에너지, 추출 시간을 변화시키면서 참취 추출물을 얻었으며 추출용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 70% 에탄올 및 메탄올, 50% 에탄올 및 메탄올의 7가지가 사용되었다. 분쇄한 참취 2.
- 실험에 사용한 참취는 경북 안동지역에서 재배된 것으로 90℃ 물에서 2~3분간 처리한 후 60℃에서 건조하였다. 건조된 참취는 분쇄기(Osteiizer, Sunbeam-oster company, Inc.
- 39%이었다. 총 폴리페놀 함량의 측정에는 sodium tungstate(S-0765)와 phosphomolybdic acid(P-7390)가 사용되었으며 모두 Sigma사 제품이었다. 항산화력의 측정에 사용된 α, α -diphenyl-piciyl-hydrazyI(DPPH, D-9132) 역시 Sigma사 제품이었으며 추출 용매로는 메탄올과 에탄올이 사용되었으며 모두 특급 시약이었다.
데이터처리
- 9% 에탄올 2 mL을 가하여 10초간 혼합하고 10분 후에 분광광도계를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여 효과는 2회 측정하여 그 평균값을 구하였으며 추출물을 첨가하지 않은 구에 대한 추출물 첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
이론/모형
- 전자공여 작용은 Blois와 Kang 등(13, 14)의 방법에 따라 각 시료액의 DPPH에 대한 전자공여 효과(electron donating ability)로 시료액의 환원력을 측정하였으며 이때, 시료액은 각 추출 조건에 따라 제조된 참취 추출물의 5배 희석액을 사용하였다. 즉, 희석액 0.
- 총 폴리페놀 함량은 분석 방법으로 널리 사용되고 있는 Folin-Denis 방법(12)으로 측정하였으며, 각각의 추출 조건에 따라 제조된 참취 추출물의 1/25 희석액을 사용하였다. 즉, 희석액 5 mL에 Folin reagent 5 mL을 가하고 3분간 정치한 다음 5 mL의 10% Na2CO3용액을 가하였다.
성능/효과
- 1분에서 2분으로 추출시간을 증가시켰을 때 가용성 고형분 함량의 변화는 작았고 2분에서 4분 사이에 급격히 증가하였으며 8분 이상으로 추출 시간을 증가시켜도 더 이상의 증가는 없었다. 그러나 물과 에탄올로 추출했을 때는 추출 시간 15분까지도 증가율은 작았지만 계속적으로 가용성 고형분의 함량이 증가하는 경향을 나타내었고 마이크로웨이브 에너지를 변화시켰을 때와 마찬가지로 추출시간에 의한 영향을 많이 받는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량의 경우에는 가용성 고형분 함량보다 더 빠른 3분 또는 4분에서 총 폴리페놀 함량의 증가는 없었으며 항산화력의 경우 마이크로웨이브 에너지를 변화시켰을 때와 마찬가지로 추출 시간에 의한 영향은 거의 보이지 않았다.
- 추출 용매에 의한 영향을 보면, 에탄올로 추출했을 때 가용성 고형분 함량이 가장 낮았으며 메탄올로 추출했을 때는 이의 2배 수준이었다. 그리고, 혼합용매 및 물로 추출했을 때 비교적 높은 가용성 고형분 함량을 나타내었으며 물의 비율이 높아짐에 따라 다소 가용성 고형분 함량이 증가하는 경향을 보였다.
- 이는 용매마다 유전 상수가 다르기 때문이며 유전 상수의 차이가 마이크로 웨이브 에너지가 시료에 흡수되는데 영향을 주었을 것으로 보인다 즉, 높은 유전상수를 갖는 물을 용매로 하였을 경우 낮은 마이크로 웨이브 에너지로 추출했을 때 시료에 충분히 마이크로 웨이브를 전달하지 못하여 낮은 추출율을 보이다가 에너지 강도가 증가함에 따라 계속적으로 추출율이 증가한 것으로 생각된다. 또한 에탄올로 추출하였을 경우에는 낮은 마이크로웨이브 에너지에서는 수분 함량이 낮은 시료에 에너지가 충분히 흡수되지 못하여 낮은 추출율을 나타내었고 마이크로웨이브 강도가 증가함에 따라 추출율이 계속적으로 증가했다고 할 수 있다. 에탄올로 추출했을 때는 가용성 고형분 함량이 가장 낮아서 7.
- 8% 수준이었다. 마이크로 웨이브 에너지 강도를 변화시키면서 총 폴리페놀 함량을 측정하였을 때 역시 Fig. 2에서처럼 마이크로웨이브 강도를 증가시킴에 따라서 서서히 총 폴리페놀 함량이 증가하였으며 가용성 고형분 함량보다 더 낮은 에너지 수준인 120 W에서 평형에 도달하였다. 이때 에탄올로 추출했을 때의 총 폴리페놀 함량은 0.
- 마이크로 웨이브 추출(MAE)에 사용된 추출장치는 Soxwave-100(Prolabo, France)으로 마이크로웨이브 에너지 강도를 30 W(watts) 단위로 최대 300 W까지 높일 수 있었으며 주파수는 2, 450 MHz이었다. RE와의 추출 효율을 비교하기 위한 마이크로 웨이브 추출은 밀폐형 추출관(closed extraction vessel)에서 120 W의 마이크로 웨이브 에너지로 8분 동안 수행하였다.
- 마이크로 웨이브 추출시 최적 마이크로웨이브 에너지는 120-150 W였고 추출 시간은 4~8분이 적당하였다. 추출에 사용한 용매들 가운데 에탄올, 메탄올보다 물 그리고 물과 에탄올 또는 메탄올 혼합용매를 사용한 추출물의 가용성 고형분, 총 폴리페놀 함량 및 항산화 효과가 높은 것으로 나타났다.
- 마이크로웨이브 추출 방법과 환류 냉각 추출방법을 비교한 결과, 물과 에탄올의 혼합용매로 추출한 경우 마이크로 웨이브 추출 방법에 의하여 추출 시간을 단축시키면서 환류 냉각 추출 방법에서와 같은 수준의 가용성 고형분 및 총 폴리페놀 함량을 갖는 참취 추출물을 얻을 수 있었다. 마이크로 웨이브 추출시 최적 마이크로웨이브 에너지는 120-150 W였고 추출 시간은 4~8분이 적당하였다.
- 마이크로웨이브 에너지를 증가시킴에 따라 가용성 고형분 함량이 서서히 증가하다가 물과 에탄올로 추출했을 때를 제외하고는 대체로 150 W에서 평형에 도달하였다. 물과 에탄올 추출 용매로 하였을 경우 증가율이 크지는 않았지만 실험조건에서 계속적으로 고형분 함량이 증가하는 경향을 보였고 다른 용매로 추출했을 때보다 마이크로웨이브 에너지에 의한 영향을 크게 받았다. 이는 용매마다 유전 상수가 다르기 때문이며 유전 상수의 차이가 마이크로 웨이브 에너지가 시료에 흡수되는데 영향을 주었을 것으로 보인다 즉, 높은 유전상수를 갖는 물을 용매로 하였을 경우 낮은 마이크로 웨이브 에너지로 추출했을 때 시료에 충분히 마이크로 웨이브를 전달하지 못하여 낮은 추출율을 보이다가 에너지 강도가 증가함에 따라 계속적으로 추출율이 증가한 것으로 생각된다.
- 2%의 가용성 고형분 함량을 나타내었다. 반면, 70%와 50% 메탄올 및 에탄올로 추출했을 경우에는 추출방법에 의한 가용성 고형분 함량의 차이는 적었으며 70% 메탄올과 에탄올로 추출하였을 때는 27-29%의 가용성 고형분 함량을 50% 메탄올과 에탄올로 추출한 경우 28~29%의 가용성 고형분 함량을 나타내었다. 이와 같이 추출용매에 따라 추출방법에 의한 가용성 고형분 함량의 차이 정도가 다른 것은 용매마다 유전상수(dielectric constant)가 다르며 이것이 마이크로웨이브 추출에 영향을 주었기 때문이라 여겨진다.
- 5%의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다. 이상과 같이 RE와 MAE 추출물을 비교한 결과, 70% 또는 50% 메탄올과 에탄올 혼합 용매를 사용한 경우, 8분 동안의 마이크로 웨이브 추출에 의해 2시간의 환류 냉각 추출에서와 비슷한 수준의 가용성 고형분 및 총 폴리페놀 함량을 갖는 추출물을 얻는 것으로 나타났다.
- 따라서 본 실험에서 물을 추출용매로 하였을 경우 마이크로웨이브 에너지가 물에 흡수되어 시료에 적게 전달되었기 때문에 가용성 고형분의 추출효율이 감소하였을 것이라 생각한다. 이에 비하여 메탄올이나 에탄올은 유전상수가 20~30으로 물에 비하여 마이크로 웨이브 에너지를 잘 투과시켜 에너지를 시료에 전달함으로써 추출용매로는 적합하였을 것이나 본 실험에서는 건조 시 료를 사용하였으므로 전달된 마이크로웨이브 에너지가 시료에 충분히 흡수되지 못하여 추출율이 감소하였을 것으로 여겨진다. 양파나 마늘 등의 생시료를 사용하여 2시간 이상의 용매 추출과 8분간의 마이크로 웨이브 추출 방법으로 추출하고 얻은 추출물의 가용성 고형분 함량을 비교한 실험에서 두 가지 추출 방법 간에 차이가 없었다고 하였다(16, 17).
- Table 1에서처럼 대체로 MAE보다 RE 방법으로 추출했을 때 가용성 고형분 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 즉, 물로 추출했을 때는 RE와 MAE 추출 방법에 의하여 약 34.3% 및 28.1%의 가용성 고형분 함량을 보였고 메탄올 추출의 경우 각각 21.6% 및 15.5%로 추출방법에 의한 차이를 나타내었다. 또한, 에탄올로 추출하였을 때는 그 차이가 더욱 커서 각각 9.
- 총 폴리페놀 함량의 경우에는 가용성 고형분 함량보다 더 빠른 3분 또는 4분에서 총 폴리페놀 함량의 증가는 없었으며 항산화력의 경우 마이크로웨이브 에너지를 변화시켰을 때와 마찬가지로 추출 시간에 의한 영향은 거의 보이지 않았다. 즉, 추출시간을 1분에서 2분으로 증가시켰을 때 약간 항산화력이 증가하였을 뿐 1~15분의 실험조건에서는 거의 변화가 없었다.
- 용매에 따라서는 에탄올로 추출했을 때 전자공여 효과가 약 35%인 것을 제외하고는 모두 추출용매에서 62~69%로 추출용매에 의한 차이는 없었다. 총 폴리페놀 함량의 경우 메탄올 추출물과 혼합 용매 추출물 또는 물 추출물이 2배 이상의 차이를 보인 것과 달리 항산화 효과에 있어서는 서로 비슷한 수치를 보였다. 이러한 결과는 참취가 폴리페놀 외에 메탄올에 녹는 다른 항산화 물질을 가지고 있거나 참취가 가지고 있는 여러 폴리페놀 화합물 가운데 에탄올보다 메탄올이나 다른 혼합 용매에 더 많이 용해되는 성분이 항산화력과 더 직접적으로 관련이 있을 가능성을 보여주는 것이라 하겠다.
- 총 폴리페놀 함량의 경우에는 가용성 고형분 함량과 비교했을 때 추출방법에 의한 차이가 더 적었으며 에탄올과 메탄올을 제외하고 추출방법에 의한 차이는 거의 없었다. 인삼으로부터 8시간씩 5회 추출하는 기존 추출 방법과 동일 온도와 용매조건에서 추출 시간을 2분에서 8분으로 변화시키며 마이크로 웨이브 추출방법으로 추출했을 때, 가용성 고형분은 기존의 추출방법에서 더 높았으나 인삼의 유효성분인 조사포닌의 경우 마이크로웨이브 추출 시 더 높다(18)고 하여 본 실험과 같은 결과를 보였다.
- 그러나 물과 에탄올로 추출했을 때는 추출 시간 15분까지도 증가율은 작았지만 계속적으로 가용성 고형분의 함량이 증가하는 경향을 나타내었고 마이크로웨이브 에너지를 변화시켰을 때와 마찬가지로 추출시간에 의한 영향을 많이 받는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량의 경우에는 가용성 고형분 함량보다 더 빠른 3분 또는 4분에서 총 폴리페놀 함량의 증가는 없었으며 항산화력의 경우 마이크로웨이브 에너지를 변화시켰을 때와 마찬가지로 추출 시간에 의한 영향은 거의 보이지 않았다. 즉, 추출시간을 1분에서 2분으로 증가시켰을 때 약간 항산화력이 증가하였을 뿐 1~15분의 실험조건에서는 거의 변화가 없었다.
- 따라서 본 실험에서도 생시료를 사용하였거나 건조 시료를 습윤시킨 후 마이크로웨이브 추출을 하였다면 마이크로 웨이브에 의한 추출율을 높일 수 있었을 것이라 생각한다. 추출 용매에 의한 영향을 보면, 에탄올로 추출했을 때 가용성 고형분 함량이 가장 낮았으며 메탄올로 추출했을 때는 이의 2배 수준이었다. 그리고, 혼합용매 및 물로 추출했을 때 비교적 높은 가용성 고형분 함량을 나타내었으며 물의 비율이 높아짐에 따라 다소 가용성 고형분 함량이 증가하는 경향을 보였다.
- 마이크로 웨이브 추출시 최적 마이크로웨이브 에너지는 120-150 W였고 추출 시간은 4~8분이 적당하였다. 추출에 사용한 용매들 가운데 에탄올, 메탄올보다 물 그리고 물과 에탄올 또는 메탄올 혼합용매를 사용한 추출물의 가용성 고형분, 총 폴리페놀 함량 및 항산화 효과가 높은 것으로 나타났다.
- Pare 등(15)은 이러한 이유가 대류에 의해서 에너지가 전달되는 일반적인 가열방식과 달리 마이크로웨이브 추출에서는 시료 혼합물 전체가 마이크로웨이브 에너지에 노출됨으로써 천연물 내의 목적 성분이 국소적으로 가열되어 용매로 유리되기 때문이라고 하였다. 추출용매에 따라서는 에탄올로 추출했을 때 0.3% 수준으로 가장 낮았고 메탄올로 추출했을 때는 이보다 5배이상 높은 1.5% 수준이었으며 물 및 혼합용매로 추출했을 때는 2.2~2.5%의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다. 이상과 같이 RE와 MAE 추출물을 비교한 결과, 70% 또는 50% 메탄올과 에탄올 혼합 용매를 사용한 경우, 8분 동안의 마이크로 웨이브 추출에 의해 2시간의 환류 냉각 추출에서와 비슷한 수준의 가용성 고형분 및 총 폴리페놀 함량을 갖는 추출물을 얻는 것으로 나타났다.
후속연구
- 양파나 마늘 등의 생시료를 사용하여 2시간 이상의 용매 추출과 8분간의 마이크로 웨이브 추출 방법으로 추출하고 얻은 추출물의 가용성 고형분 함량을 비교한 실험에서 두 가지 추출 방법 간에 차이가 없었다고 하였다(16, 17). 따라서 본 실험에서도 생시료를 사용하였거나 건조 시료를 습윤시킨 후 마이크로웨이브 추출을 하였다면 마이크로 웨이브에 의한 추출율을 높일 수 있었을 것이라 생각한다. 추출 용매에 의한 영향을 보면, 에탄올로 추출했을 때 가용성 고형분 함량이 가장 낮았으며 메탄올로 추출했을 때는 이의 2배 수준이었다.
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