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문제 정의
- 따라서 본 연구는 돌나물의 기내 식물체 재분화 체계를 확립하기 위하여, 캘러스 형성과 식물체 분화에 미치는 생장조절물질의 종류 및 농도의 영향을 조사하기 위하여 실시하였다.
가설 설정
- Callus derived from leaf segments. C. Plantlets regenerated from callus. D.
제안 방법
- 멸균된 여지로 신초 표면의 수분을 제거한 다음, 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 마디를 1개씩 잘라서 기내증식하였다 (Figure 3A). 기내에서 새로 발생한 5 cm 크기의 신초로부터 잎을 2X5 mm 크기로 잘라 샤레당 20절편씩 5반복 치상하였다. 캘러스 유기배지는 MS 배지에 1.
- 돌나물 (Sedum samentosum)의 기내 식물체 재분화 체계를 확립하기 위하여, 생장조절물질을 다르게 조합한 MS 배지에 잎 절편을 치상한 후, 캘러스 유기 및 식물체 분화에 미치는 생장조절물질의 영향을 조사하였다. 캘러스 유기는 3.
- 5% sodium hypoclorite로 20분간 살균하여 멸균수로 4회 수세하였다. 멸균된 여지로 신초 표면의 수분을 제거한 다음, 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 마디를 1개씩 잘라서 기내증식하였다 (Figure 3A). 기내에서 새로 발생한 5 cm 크기의 신초로부터 잎을 2X5 mm 크기로 잘라 샤레당 20절편씩 5반복 치상하였다.
- sec-1(18/6 h, day/night)로 조절된 배양실에서 명배양하였다. 배양 30일 후부터 60일까지 10일 간격으로 분화된 shoot수를 조사하였다. 재분화된 식물체는 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 기본배지에 옮겨 30일 동안 생장 및 발근을 유도한 다음, 발근된 소식물체를 버미큐라이트와 펄라이트를 1 : 1로 혼합한 상토를 채운 소형폿트에 이식하였다.
- 2kg/cm2에서 15분간 고압 멸균하여 샤레당 20mL씩 분주하여 사용하였다. 배양조건은 25±2℃에서 암배양하여, 50일 후 캘러스 형성유 캘러스 생체중 및 건물 중을 5반복 조사하였다. 건물중은 70℃ 건조기에서 3일간 건조 후 평량하였다.
- 배양 30일 후부터 60일까지 10일 간격으로 분화된 shoot수를 조사하였다. 재분화된 식물체는 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 기본배지에 옮겨 30일 동안 생장 및 발근을 유도한 다음, 발근된 소식물체를 버미큐라이트와 펄라이트를 1 : 1로 혼합한 상토를 채운 소형폿트에 이식하였다.
- 기내에서 새로 발생한 5 cm 크기의 신초로부터 잎을 2X5 mm 크기로 잘라 샤레당 20절편씩 5반복 치상하였다. 캘러스 유기배지는 MS 배지에 1.0, 2.0, 3.0 mg/L의 2, 4-D 와 NAA를 각각 0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L의 BA와 조합한 12종의 배지를 이용하였다. 배지의 pH는 5.
- 캘러스로부터 식물체 분화에 미치는 생장조절물질의 종류및 농도를 구명하기 위하여, 0, 0.2, 0.5, 1.0 mg/L NAA와 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/L BA를 조합한 20종의 배지를 조제하여, 잎절편 유래의 캘러스를 샤레당 10개씩 5반복 배양하였다. 배양조건은 25±2℃에서 27 μmol .
대상 데이터
- 치상 재료의 준비는 충남 금산군 금산읍 상리에서 수집한 금산 지역종의 신초를 채취하여, 70% 에틸알콜에 10초간 표면살균 후 0.5% sodium hypoclorite로 20분간 살균하여 멸균수로 4회 수세하였다. 멸균된 여지로 신초 표면의 수분을 제거한 다음, 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 마디를 1개씩 잘라서 기내증식하였다 (Figure 3A).
데이터처리
- 'Data were investigated after 50 days of culture. Data followed by the same letter in each column were not significantly different at the 0.05 probability level based on Duncan's multiple range test.
성능/효과
- 2, 4-D와 NAA 단독 첨가배지에서는 캘러스 형성이 저조하였으며, 2, 4-D와 BA 혼합배지가 캘러스 형성에 효과적이었다 (Figure 1). 특히 3.
- 0 mg/L에서 비교적 양호하였으나, BA 단독첨가 배지보다는 NAA와 BA 혼합 첨가 배지에서 고빈도의 식물체가 분화되었다 (Table 2). 가장 높은 식물체 분화율을 보인 것은 0.5 mg/L NAA와 4.0 mg/L BA 첨가배지였나, 캘러스 당 식물체수는 0.2mg/LNAA와 3.0 mg/L BA 에서 가장 양호하였고, 기형의 신초나 잎비대 현상도 거의 없어 돌나물의 캘러스로부터 식물체 분화배지로 가장 적합하였다 (Figure 3C). 이와 같이 캘러스로부터 식물체 분화에는 지황 (Rha and Kim 1996)에서와 같이 BA 단독 처리가 신초 분화에 효과적인 경우도 있지만, 대부분의 경우 NAA 와 BA 혼합배지에서 식물체 분화가 양호한 결과를 얻었는데, 바위솔의 줄기배양에서는 0.
- 돌나물의 캘러스 형성에 미치는 생장조절물질의 영향을 구명하기 위하여, 금산 지역종의 잎절편을 2, 4-D와 NAA를 BA와 혼합조제한 MS배지에 치상하여 캘러스 형성양상을 조사한 결과, 치상된 잎 절편체는 배양 1주 후부터 비대해지기 시작하였으며, 20일경에는 육안으로 캘러스 형성을 관찰 할 수 있었다. 2, 4-D와 NAA 단독 첨가배지에서는 캘러스 형성이 저조하였으며, 2, 4-D와 BA 혼합배지가 캘러스 형성에 효과적이었다 (Figure 1).
- 0 mg/L BA를 조합한 분화 배지로 잎절편 유래 캘러스를 옮긴 후 30~60일까지 10일 간격으로 캘러스당 식물체수를 조사한 결과 60일까지도 식물체 수는 계속 증가하지만 BA의 농도가 높기 때문에 분화된 신초의 잎이 비대해져 기형식물체가 증가하였다 (Figure 2). 따라서 엽록소 황화현상 및 기형 식물체가 발생하기 전 계대배양 적기는 캘러스를 옮긴 후 40~50일경에 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 기본배지로 분화된 식물체를 계대배양하는 것이 발근 및 신초생장이 양호하여, 건전 식물체를 다수 획득할 수 있었다 (Figure 3D). 분화된 식물체는 버미큐라이트와 펄라이트를 1 : 1로 혼합한 상토를 넣은 소형 폿트에 이식후 순화 재배한 결과 95% 이상의 생존율을 보였다.
- 또한 캘러스 형성이 양호한 2, 4-D와 BA 혼합 첨가 배지에서의 캘러스 생장을 비교하기 위하여 캘러스의 생체중과 건물 중을 비교조사한 결과, 2, 4-D 단독처리에서는 캘러스 생장이 저조하였으며, 3.0 mg/L 2, 4-D와 0.5~2.0 mg/L BA 첨가배지에서 양호한 캘러스 생장을 보였다 (Table 1).
- 본 실험에서 돌나물의 캘러스 생장은 auxin과 cytokinin의 혼합비가 중요한 것으로 나타났는데, 2, 4-D 농도가 l.0mg/L 일 경우 0.5 mg/L BA 첨가배지에서, 2, 4-D 농도가 2.0 mg/L일 경우 1.0 mg/L BA 첨가배지에서, 그리고 2, 4-D 농도가 3.0 mg/L일 경우 1.0~2.0 mg/L BA 첨가배지에서 높은 생체중 및 건물 중을 보이는 것으로 보아, 대체로 2, 4-D와 BA의 혼합비율이 2 : 1일때 캘러스 생장이 양호한 경향을 보였다 (Table 1, Figure 3B). 이러한 결과는 다음의 연구결과와도 일치하는 것으로 할미꽃에서 auxin 또는 PVP와 cytokinin의 비율이 2 : 1 일 때 현저한 캘러스 증가를 보였으며 (Yoon 1996), 돌나물과 같은 Sedum속 식물인 꿩의 비름에서도 잎절편으로부터 캘러스 형성은 2.
- 따라서 엽록소 황화현상 및 기형 식물체가 발생하기 전 계대배양 적기는 캘러스를 옮긴 후 40~50일경에 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 기본배지로 분화된 식물체를 계대배양하는 것이 발근 및 신초생장이 양호하여, 건전 식물체를 다수 획득할 수 있었다 (Figure 3D). 분화된 식물체는 버미큐라이트와 펄라이트를 1 : 1로 혼합한 상토를 넣은 소형 폿트에 이식후 순화 재배한 결과 95% 이상의 생존율을 보였다.
- 0 mg/L BA 첨가 배지에서 가장 높은 캘러스 유기율을 보였으나, NAA와 BA 혼합첨가 배지에서는 캘러스 형성율이 0~3% 이하로 극히 낮았다. 식물체 분화는 NAA 단독첨가 배지에서는 전혀 분화되지 않았으며, 0.2 mg/L NAA와 3.0 mg/L BA 첨가배지에서 가장 양호하였다. 캘러스를 식물체 분화 배지에 계대배양 후 50일까지는 신초수 증가와 함께 (17.
- 영향을 조사하였다. 캘러스 유기는 3.0 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 첨가 배지에서 가장 높은 캘러스 유기율을 보였으나, NAA와 BA 혼합첨가 배지에서는 캘러스 형성율이 0~3% 이하로 극히 낮았다. 식물체 분화는 NAA 단독첨가 배지에서는 전혀 분화되지 않았으며, 0.
- 캘러스로부터 식물체 분화에 미치는 생장조절물질의 종류 및 농도를 구명하기 위하여, 돌나물의 잎절편 유래 캘러스를 NAA와 BA를 첨가한 배지에 옮겨 식물체 분화양상을 조사한 결과, NAA 단독첨가 배지에서는 전혀 식물체 분화가 이루어지지 않았고, BA 단독첨가 배지에서는 1.0 mg/L에서 비교적 양호하였으나, BA 단독첨가 배지보다는 NAA와 BA 혼합 첨가 배지에서 고빈도의 식물체가 분화되었다 (Table 2). 가장 높은 식물체 분화율을 보인 것은 0.
- 0 mg/L BA 첨가배지에서 가장 양호하였다. 캘러스를 식물체 분화 배지에 계대배양 후 50일까지는 신초수 증가와 함께 (17.2 개/캘러스), 식물체의 기형이나 잎비대 현상도 적어 식물체 분화 배지로 가장 적합하였다. 분화 식물체는 생장조절물질을 첨가하지 않은 MS 기본배지로 계대배양하였을 때 발근 및 생육이 양호하였다.
- 2, 4-D와 NAA 단독 첨가배지에서는 캘러스 형성이 저조하였으며, 2, 4-D와 BA 혼합배지가 캘러스 형성에 효과적이었다 (Figure 1). 특히 3.0 mg/L 2, 4-D와 0.5 ~ 2.0 mg/L BA 첨가 배지에서 양호하였으며, 3.0 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA첨가 배지에서 가장 높은 캘러스 형성율을 보였다. 그러나 NAA와 BA 혼합첨가 배지에서의 캘러스 형성율은 아주 낮게 나타나 2.
- 한편 15 μM AgNC3 와 250 mg/L Glutamine을 첨가한 MS 기본배지에 0.2 mg/L NAA와 3.0 mg/L BA를 조합한 분화 배지로 잎절편 유래 캘러스를 옮긴 후 30~60일까지 10일 간격으로 캘러스당 식물체수를 조사한 결과 60일까지도 식물체 수는 계속 증가하지만 BA의 농도가 높기 때문에 분화된 신초의 잎이 비대해져 기형식물체가 증가하였다 (Figure 2). 따라서 엽록소 황화현상 및 기형 식물체가 발생하기 전 계대배양 적기는 캘러스를 옮긴 후 40~50일경에 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 기본배지로 분화된 식물체를 계대배양하는 것이 발근 및 신초생장이 양호하여, 건전 식물체를 다수 획득할 수 있었다 (Figure 3D).
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