선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 4의 결과에서 0-sitosterol 처리에 의한 암세포의 성장억제 효과에 Cdk의 활성 을 조절하는 cyclin의 발현 감소효과는 비교적 강하게 나타나지 않았다. 따라서 이들 양성조절인자 외 다른 유전자 산물에 의한 조절 가능성이 매우 크기 때문에 P-sito- sterol의 처리에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 현재 까지 알려 진 Cdk inhibitor 중 가장 많은 연구가 이루어져 있는 p21 과 종양억제인자 p53의 발현에 미치는 P-sito- sterol의 영 향을 Western blotting 및 RT-PCR법으로 조사하였다.
- 따라서 세포주기 조절과 연관된 특정 인자들의 발현 조절을 통한 암세포의 증식 억 제 기구해석은 암을 포함한 특정 약제의 개발에 매우 중요한 의의를 가질 수 있다. 본 연구에서는 B-sitosterol에 의한 인체 대장암세포의 성장억제와 연관된 기전의 해석을 시도하기 위하여 G2/M기 관련 조절 인자들의 발현에 미치는 B-sitosterol의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 먼저 HCT116 인체 대장암세포의 성장에 미치는 B-sitosterol의 영향을 알아보기 위하여 48시간 동안 다양한 농도의 6-sitosterol을 처리한 후 살아있는 세포의 수를 계수하여 Ssitosterol이 처리되지 않은 대조군의 세포 수와 비교한 결과는 Fig.
- 본연구에서는 6-sitosterol의 암세포 증식억제 기전의 해석을 시도하기 위하여 인체 대장암세포 HCT116의 증식에 미치는 sitosterol의 영 향을 조사하였다.。-Sitosterol의 처리로 HCT116 암세포의 증식은 처리 농도 의존적으로 감소되었으며, 특히 7.
제안 방법
- (卜Sitosterol 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위하여 P-sitosterol 이 처리된 세포들을 PBS로 세척하고 3.7% paraformalde- hyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 4, 6- diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형 태 변화를 정상군과 비교하였다.
- 3A는 DAPI 염 색에 의한 핵의 형태에 미치는 sitosterol의 영 향을 나타낸 결과로서 , B-sitoster胡이 처리된 배지에서 자란 암세포의 경우 정상배지에서 자란 세포들에서 관찰할 수 없는 apoptosis 유발 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 apoptotic body의 출현(21, 22)이 증가되어 sitosterol의 처 리 에 의 한 암세 포 성 장 억 제 는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성 이 있음을 알 수 있었다. 다음은 阡sitos- teml에 의 한 apoptosis의 유발을 생화학적 으로 증명 하기 위하여 apoptosis 유발시 특이 하게 분해가 일어 나는 표적 단백질인 B-catenin의 발현에 미치는。-sitosterol 영향을 West- em blot 분석으로 조사하였다. B-Catenin은 세포내 골격의 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요하며 세포 유착과 관계된 apoptosis 조절과 연관성을 가지고 있다(23-26).
- 최근 Awad 등(15)에 의하여 세포주기 교란에 관한 접근이 시도되어 P- sitosterol이 세포주기 진행의 G2/M기 특이적 세포증식 억제를 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서는。-sitosterol에 의한 암세포 성장억제 기전해석의 일환으로 이들 연구에 기초를 두어 [卜sitosterol에 의한 세포주기 G2/M기 arrest에 관여하는 중요한 유전자들의 발현에 미치는 6-sitosterol의 영향을 조사하였다.
- 6-Sitoster이에 의한 인체 대장암세포의 apoptosis 유발 이상의 P sitosterol에 의한 암세포의 성장억제가 apop tosis 유발과 연관성이 있을 것으로 기대되어 이에 관한 직접적 인 증거 를 제 시 하기 위 하여 정 상 및 阡 sitosterol이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 핵의 형태적인 변화를 조사하였다. Fig.
- 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehy- drogenase(GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 1% agarose gel을 이용하여 전기 영동하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma)를 이용하여 염 색한 후 UV 하에서 확인하였다.
- 1% Tween 20 in PBS)에 4°C에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 bkx이ing을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한이 차 항체 반응을 실시한 후 ECL(Enhanced Chemi Lumin- oesence) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적 용시 킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc, (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin^- Amersham Corp.
- 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 RNAzoI B (TEL-TEST, Inc., Texas, ESA)을 이용하여 total RNA를 분리 하였다. 분리 된 RNA를 정 량한 후, Choi의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 Ug의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였匸H18).
- 그리고 cholesterol의 경우 동일 조건에서 S기의 증가 현상이 있었다는 결과는 암세포에 대한 6-sitosterol 고유의 특징적인 작용이 있음을 시사하는 바이지만 이와 연관된 연구가 진행된 예는 없다. 따라서 본 실험의 결과와 연관된 sitosterol의 항암기 전 해석의 일환으로 sitosterol이 함유된 배지에서 배양한 세포들을 대상으로 세포주기 G2/M checkpoint 관점 에서 중요한 몇 가지 cyclin 및 Cdks의 발현 정도를 비교 조사하였다. Fig.
- gel 전기영동으로 분리하였다(17). 분리된 단백질을 함유한 acrylamide g이을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) 으로 electrobl - ottir蟾에 의 해 전이 시 킨 후, 10% 아【im milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 4°C에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 bkx이ing을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한이 차 항체 반응을 실시한 후 ECL(Enhanced Chemi Lumin- oesence) 용액 (Amersham Life Science Corp.
- 분리 된 RNA를 정 량한 후, Choi의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 Ug의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였匸H18). 이 cDNA 를 template로 사용하여 p53 및 p21 유전자를 polymerase 사lain reaction(PCR) 방법으로 증폭하였다(Table 1). 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehy- drogenase(GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다.
- 준비 된 세포를 phosphate-buffered saline(PBS) 용액으로 수세한 후, try pan blue(Gibco BRL, Gaithersberg, MA, USA)로 염색하였다. 이 를 hematocytometer°l] 옮긴 후 위 상차 현 미 경 ( x 200) 하에서 살아있는 세포의 수를 측정하였다.
- 7% paraformalde- hyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 4, 6- diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형 태 변화를 정상군과 비교하였다.
- 본 연구에서는 B-sitosterol에 의한 인체 대장암세포의 성장억제와 연관된 기전의 해석을 시도하기 위하여 G2/M기 관련 조절 인자들의 발현에 미치는 B-sitosterol의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 먼저 HCT116 인체 대장암세포의 성장에 미치는 B-sitosterol의 영향을 알아보기 위하여 48시간 동안 다양한 농도의 6-sitosterol을 처리한 후 살아있는 세포의 수를 계수하여 Ssitosterol이 처리되지 않은 대조군의 세포 수와 비교한 결과는 Fig. 2와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 sitosterol의 처 리농도 증가에 따라 대장암세포의 생존율은 처리된sitosterol의 농도 의존적으로 강하게 감소되었음을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc, (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin^- Amersham Corp.(Arlington Heights, IL, USA에서 구입하였다.
이론/모형
- 1)은 Sigma Chem ical-Co.(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였고, Greenberg - Ofrath 등(16)의 방법에 준하여 적정 용액으로 희석하여 배지에 처리하였다.
- , Texas, ESA)을 이용하여 total RNA를 분리 하였다. 분리 된 RNA를 정 량한 후, Choi의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 Ug의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였匸H18). 이 cDNA 를 template로 사용하여 p53 및 p21 유전자를 polymerase 사lain reaction(PCR) 방법으로 증폭하였다(Table 1).
- 따라서 이들 양성조절인자 외 다른 유전자 산물에 의한 조절 가능성이 매우 크기 때문에 P-sito- sterol의 처리에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 현재 까지 알려 진 Cdk inhibitor 중 가장 많은 연구가 이루어져 있는 p21 과 종양억제인자 p53의 발현에 미치는 P-sito- sterol의 영 향을 Western blotting 및 RT-PCR법으로 조사하였다. Fig.
성능/효과
- 본연구에서는 6-sitosterol의 암세포 증식억제 기전의 해석을 시도하기 위하여 인체 대장암세포 HCT116의 증식에 미치는 sitosterol의 영 향을 조사하였다.。-Sitosterol의 처리로 HCT116 암세포의 증식은 처리 농도 의존적으로 감소되었으며, 특히 7.5 이 상 처 리 에서는 급격한 성장 억제 효과가 있 었 다. 또한 5.
- Cyclin Bl의 경우 저농도 P-sitosterol 처 리군에서 다소 증가되는 양상을 보였으나, 고농도 처리군에서는 대조군과 유사한 발현을 보였다. 한편 세포주기 양성 조절인자와의 결합을 통해 세포의 증식을 활성화할 수 있으면서 그의 inhibitor에 의해 활성화가 억제되는 Cdks의 발현에 미 치는。-sitosterol 영향을 조사한 결과에서는, Fig. 4B에서 처럼, Cdk2는 유의적인 변화가 없었으나, G2/M기 조절 에 중요한 Cdc2는 8-sitosterol의 처리농도 의존적으로 발현이 다소 감소되었다.
- B-Catenin은 세포내 골격의 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요하며 세포 유착과 관계된 apoptosis 조절과 연관성을 가지고 있다(23-26). 0-Sitosterol에 의한 apoptosis가 이러한 세포 유착과 밀접한 관계를 지니는지의 여부를 조사하기 위해서 0-sitosterol이 함유된 배지에서 자란 세포들의 f-catenin 발현을 조사한 결과 Fig. 3B에서 처럼 고농도의 p-sitosterol 처 리군에서는 대조군에 비하여catenin의 발현이 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 실험 과정에서 관찰된 site广 sterol이 함유된 배지에서 배양된 암세포의 부착력 상실과 연관성이 있었음을 알 수 있었다.
- 2와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 sitosterol의 처 리농도 증가에 따라 대장암세포의 생존율은 처리된sitosterol의 농도 의존적으로 강하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 암세포의 성장 억제 효과는 P-sitosterol의 농도 증가에 따른 암세포의 심한 형 태적변형과도 연관성이 있었는더), 저농도 처리군에서는 전체적으로 세포질이 응축되면서 짧고 많은 가지를 친 듯한 모양으로 바뀌었으며, 이러한 수상돌기와 같은 형태가 더욱 신장되면서 고농도 처리군에서는 암세포들의 부착력이 상실되었음을 알 수 있었다(data not shown).
- 0 11M 처 리 군에 서 부터 apoptotic body의 형성이 관찰되었고, P-catenin 단백질의 분해 현상과 연관성이 있었다. 그리고 B-sitosterol이 처리된 암세포에서는 종양 억제유전자 p53 및 Cdk inhibitor p21 의 발현이 전사 및 번역 수준에서 모두 증가되었다. 본 결과는 그동안 연구가 거의 진행되어져 있지 않았던 6-sitosterol에 의한 암세포주기 조절 해석을 위한 주요한 자료로 활용될 것이다.
- 5B). 따라서 P-sitosterol 처리에 의한 세포 증식의 억제에는 Cdks의 단백질 발현 변화보다는 Cdk inhibitor의 발현 증가를 통하여 그들 활성 자체를 감소시켰을 것으로 생각되어지며 이때 p21 이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 그러나 0-sitosteroi에 의한 p21 의 발현 증가가 p53의 발현과 관계가 있는지의 여부를 조사하기 위 해서는 추가적으로 p53 null 또는 mutant 세포주를 사용한 세포주기 관련 연구의 검증이 필요할 것으로 생각되어진다.
- 5 이 상 처 리 에서는 급격한 성장 억제 효과가 있 었 다. 또한 5.0 11M 처 리 군에 서 부터 apoptotic body의 형성이 관찰되었고, P-catenin 단백질의 분해 현상과 연관성이 있었다. 그리고 B-sitosterol이 처리된 암세포에서는 종양 억제유전자 p53 및 Cdk inhibitor p21 의 발현이 전사 및 번역 수준에서 모두 증가되었다.
- 결과에서 알 수 있듯이 sitosterol의 처 리농도 증가에 따라 대장암세포의 생존율은 처리된sitosterol의 농도 의존적으로 강하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 암세포의 성장 억제 효과는 P-sitosterol의 농도 증가에 따른 암세포의 심한 형 태적변형과도 연관성이 있었는더), 저농도 처리군에서는 전체적으로 세포질이 응축되면서 짧고 많은 가지를 친 듯한 모양으로 바뀌었으며, 이러한 수상돌기와 같은 형태가 더욱 신장되면서 고농도 처리군에서는 암세포들의 부착력이 상실되었음을 알 수 있었다(data not shown).
- 3B에서 처럼 고농도의 p-sitosterol 처 리군에서는 대조군에 비하여catenin의 발현이 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 실험 과정에서 관찰된 site广 sterol이 함유된 배지에서 배양된 암세포의 부착력 상실과 연관성이 있었음을 알 수 있었다. 그러나 P-sitosterol 처리에 의한 암세포의 생존율이 7.
후속연구
- 따라서 P-sitosterol 처리에 의한 세포 증식의 억제에는 Cdks의 단백질 발현 변화보다는 Cdk inhibitor의 발현 증가를 통하여 그들 활성 자체를 감소시켰을 것으로 생각되어지며 이때 p21 이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 그러나 0-sitosteroi에 의한 p21 의 발현 증가가 p53의 발현과 관계가 있는지의 여부를 조사하기 위 해서는 추가적으로 p53 null 또는 mutant 세포주를 사용한 세포주기 관련 연구의 검증이 필요할 것으로 생각되어진다.
- 5 UM 처리군에서 급격하게 떨어지지만 阡catenin의 발현은 7, 5 卩M 처리군에서 큰 차이가 나타나지 않았다. 따라서 P-catenin 발현 조절과 연관된 다른 유전자산물의 변화나, B-catenin단백질 활성의 정도 등에 관한 후속 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
- 그리고 B-sitosterol이 처리된 암세포에서는 종양 억제유전자 p53 및 Cdk inhibitor p21 의 발현이 전사 및 번역 수준에서 모두 증가되었다. 본 결과는 그동안 연구가 거의 진행되어져 있지 않았던 6-sitosterol에 의한 암세포주기 조절 해석을 위한 주요한 자료로 활용될 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.