최근 콜레스테롤 합성을 억제하는 효능을 가진 것으로 알려진 홍국균 대사생성물의 일종인 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 본 연구에서는 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발을 위한 기초연구로 monacolin K의 생산 효율성을 높이고자 미동정된 1종의 홍국균을 포함해 29종의 홍국균을 수집하여 monacolin K를 대량생산하는 균주를 탐색하였다. 홍국은 PDA배지에서 배양한 흥국균을 침지ㆍ증자한 백미에 5%가 되도록 접종 후, 3$0^{\circ}C$에서 10일간 배양하여 제조하고 이를 건조, 분말로 하여 사용하였다. 그 결과 색소생성량이 많은M. purpureus ATCC 16457, M. puypureus IFO 32316, M. purpureus IFO 32228, M. kaoliang ATCC 46595, M. kaoliang ATCC 46596 등의 균체를 배양한 홍국에서 monacolin K 생성량도 높았다. 그러나 색소와 monacolin K 생산량은 미동정된 홍국균이 가장 많은 것으로 나타나 형태학적 관찰과 ITS 및 28S rRNA부분 유전자 염기서열분석을 실시한 결과, M. purpureus CBS 281.34인 것으로 동정되었다.
최근 콜레스테롤 합성을 억제하는 효능을 가진 것으로 알려진 홍국균 대사생성물의 일종인 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 본 연구에서는 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발을 위한 기초연구로 monacolin K의 생산 효율성을 높이고자 미동정된 1종의 홍국균을 포함해 29종의 홍국균을 수집하여 monacolin K를 대량생산하는 균주를 탐색하였다. 홍국은 PDA배지에서 배양한 흥국균을 침지ㆍ증자한 백미에 5%가 되도록 접종 후, 3$0^{\circ}C$에서 10일간 배양하여 제조하고 이를 건조, 분말로 하여 사용하였다. 그 결과 색소생성량이 많은M. purpureus ATCC 16457, M. puypureus IFO 32316, M. purpureus IFO 32228, M. kaoliang ATCC 46595, M. kaoliang ATCC 46596 등의 균체를 배양한 홍국에서 monacolin K 생성량도 높았다. 그러나 색소와 monacolin K 생산량은 미동정된 홍국균이 가장 많은 것으로 나타나 형태학적 관찰과 ITS 및 28S rRNA부분 유전자 염기서열분석을 실시한 결과, M. purpureus CBS 281.34인 것으로 동정되었다.
We had screened the Monascus strain capable of producing monacolin K dominantly among 29 Monascus strains. Red yeast rice was prepared by culturing each Monascus sp. with 200 g of steamed rice (12$0^{\circ}C$, 20 min) at 3$0^{\circ}C$ for 10 days and drying at 8$0^{\circ}C...
We had screened the Monascus strain capable of producing monacolin K dominantly among 29 Monascus strains. Red yeast rice was prepared by culturing each Monascus sp. with 200 g of steamed rice (12$0^{\circ}C$, 20 min) at 3$0^{\circ}C$ for 10 days and drying at 8$0^{\circ}C$ for 20 min. As a result, red yeast rice cultured by M. purpureus ATCC16457, M. purpureu IFO 32316, M. purpureus IFO 32228, M. kaoliang ATCC 46595 and M. kaoliang ATCC 46596 produced lots of red pigment and monacolin K. An unidentified Monascus sp. showed the highest productivityof red pigment and monacolin K among 29 Monascus strains. Its production of red pigment and monacolin K was 1.3∼39 times and 2.4∼8 times higher than other strains, respectively. Although the morphological characteristics of unidentified Monascus strain were a little different from the typical M. purpureus, it was identified as M. purpureus CBS 281.34 from the result of sequencing of ITS (Internal transcribed spacer) and 28S ribosomal RNA (partial).
We had screened the Monascus strain capable of producing monacolin K dominantly among 29 Monascus strains. Red yeast rice was prepared by culturing each Monascus sp. with 200 g of steamed rice (12$0^{\circ}C$, 20 min) at 3$0^{\circ}C$ for 10 days and drying at 8$0^{\circ}C$ for 20 min. As a result, red yeast rice cultured by M. purpureus ATCC16457, M. purpureu IFO 32316, M. purpureus IFO 32228, M. kaoliang ATCC 46595 and M. kaoliang ATCC 46596 produced lots of red pigment and monacolin K. An unidentified Monascus sp. showed the highest productivityof red pigment and monacolin K among 29 Monascus strains. Its production of red pigment and monacolin K was 1.3∼39 times and 2.4∼8 times higher than other strains, respectively. Although the morphological characteristics of unidentified Monascus strain were a little different from the typical M. purpureus, it was identified as M. purpureus CBS 281.34 from the result of sequencing of ITS (Internal transcribed spacer) and 28S ribosomal RNA (partial).
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문제 정의
최근 콜레스테롤 합성을 억제하는 효능을 가진 것으로 알려진 홍국균 대사 생성물의 일종인 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 본 연구 에서 는 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발을 위한 기초연구로 monacolin K의 생산효율성을 높이고자 미동정된 1종의 홍국균을 포함해 29종의 홍국균을 수집하여 monacolin K를 대량 생산하는 균주를 탐색하였다. 홍국은 PDA배 지 에서 배양한 홍국균을 침지-증자한 백미에 5%가 되도록 접종 후, 30℃에서 10일간 배양하여 제조하고 이를 건조, 분말로 하여 사용하였다 그 결과 색소 생성량이 많은 M purpureas ATCC 16457, M.
또한 Ryu 등(17)은 monacolin K의 대량생산을 목적으로 수종의 홍국균의 선별작업을 행하고 선별된 홍국 균의 monacolin K의 최적 생산 조건을 검토하였으나, monacolin K의 기능성을 살린 건강식품의 개발을 위해서는 최우선적으로 보다 많은 양의 monacolin K를 생 성 하는 균주를 탐색하여 이의 생산 효율성을 높일 필요가 있다. 이에 본 연구에서는 monacolin K의 생산 효율성을 높이고자 29종의 홍국균을 수집하여 monacolin K를 대량 생산하는 균주를 탐색하였고 미동정된 1종의 홍국균은 동정하였다
제안 방법
또한 PDA와" MEA(malt extract agar, Difco)배 지상에서의 번식 형태 및 광학현미경[Mier이Dhot-TXA(자낭포자 관찰), Eclipse E600(분생포자 관찰), Nickon, Japan]을 사용하여 형태학적 관찰을 행하였다.
29종의 홍국균 중 미동정된 29번 홍국균이 monacolin K의 대량생산에 가장 적합한 것으로 판정되었기에 이 균주의 동정을 실시하였다. 형태학적 관찰 결과 중 MEA와 PDA 배지상에서의 번식 형태를 보면, Fig.
홍국분말 1 g에 80%에 탄올 9 mL을 가해 1분간 흔들어 추출한 후 상 등액을 취해 HPLC(Jasco PU-987 pump, Tokyo, Japan)를 이용하여 monacolin K 함량을 측정하였다. HPLC 분석은 Hypersil ODS column(5 pore size, 150 '乂 4.6 mm, Sup인co Inc.)을 사용하여 acetonitrile: 0.1% phosphoric acid 二 65 : 35(v/v)로 한 용액을 이동상으로 하고 1 mL/min의 유속으로 10 μL를 투여시 238 nm(Jasco UV-975 detector, Tokyo, Japan)에서 측정 하였다. Monacolin K 함량은 표준물질을 같은 조건에서 작성한 검량선으로부터 산출하였다.
미동정홍국균은 (주)마이크로아우디에 의뢰하여 ITS (Internal transcribed spacer) 및 28S ribosomal RNA 부분 염기 서열을 분석하여 동정하였다, 먼저 ITS 및 28S rDNA 각 유전자를 PCR(GenAmpni PCR system 9700, Perkin- Elmer, Boston, USA)에 의해 증폭시켰다. PCR을 위한 반응액의 구성은 10 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 40 mM KC1, 0.15 mM MgCh, 3 mM MgSO」, 200 PM deoxynucleotide triphosphate, 10 ng DNA 주형 , 1 U Taq polymerase 및 0.5 11M primer set로 총부피 는 50 虬로 하였다. 사용된 primer 와 probe는 각각 ITS의 경우 ITS5(5-GGAAGTAAAAG- TCGTAACAAGG-37)와 ITS4(5, -TCCTCCGCTTATATG C-3, ), 28S rDNA의 경우 NL 26(5-ACCCGCTGAAYTT- AAGCATAT-3')과 NL660(5, ~CTCCTTGGTCCGTGT~ TTCAAGACGG-3)을 사용하여 행하였다(18).
홍국분말 1 g에 80%에 탄올과 80% 메탄올 또는 물 9 m札 을 가한 후 실온에서 1시간 교반하여 색소를 추출하였다. 다음 membrane filtertPVDF, pore size 0.45 ]im, diameter 13 mm, Whatman)를 사용하여 추출액을 여과하고 적정 농도로 희석한 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 (Hewlett Packard spectrophotometer, model 8753, Germany) 이를 홍국색소추 출양으로 하였다.
미동정홍국균은 (주)마이크로아우디에 의뢰하여 ITS (Internal transcribed spacer) 및 28S ribosomal RNA 부분 염기 서열을 분석하여 동정하였다, 먼저 ITS 및 28S rDNA 각 유전자를 PCR(GenAmpni PCR system 9700, Perkin- Elmer, Boston, USA)에 의해 증폭시켰다. PCR을 위한 반응액의 구성은 10 mM Tris-HCl buffer (pH 9.
홍국 제조를 위한 종균은 PDA(potato dextrose agar, Difco) 배지를 사용하여 30“C에서 4일간 균체를 배양하였다. 백미는 하루 밤 수침하여 탈수한 후 200 g을 1L 삼각플라스크에 넣고 120K에서 20분간 증자하고 곡물 건물량의 10%의 멸균수를 첨가하였다. 다음 종균을 5%가 되도록 접종하고 30℃에서 10일간 배양한 후&TC에서 20분간 건조하였다.
증폭된 PCR 산물은 Wizard PCR Prep DNA purification system (Promeg a, USA)를 이용하여 정제하였고, 염기 서열 분석은 BigDye1재 terminator cy- cle sequencing ready reaction kit (Perkin - Elmer) # 사용하여 PCR로 반응(96”C 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분)시킨 후 Genetic analyzer(ABI Prism1X1 310, Perki口-Elmer)로 하였다. 얻어진 염기서열의 상동성은 NCBKNational Ceter for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 Blast wogram으로 분석하였다.
다음 종균을 5%가 되도록 접종하고 30℃에서 10일간 배양한 후&TC에서 20분간 건조하였다. 이때 홍국의 수분 함량은 37%였으며 건조한 홍국은 후드믹 서 (Hanil, Ko n?a)로 제분하였다.
색소, monacolin K, 기타 홍국균 대사산물은 공통적인 polyketide pathway를 경유해 합성되므로 (15, 16) 색소 생성량이 많은 홍국균이 monacolin K도 다량 생성할 것으로 예측되었다. 이에 monacolin K함량을 측정하기 전에 1차 스크리닝으로 색소 생성량을 측정하였다. Fig.
PCR 반응은 predenaturation (94℃, 3분), den a turartion (64℃, 30초), annealing(50℃, 30초), elongation(94℃, 3분), extention(72℃, 10분)을 30회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard PCR Prep DNA purification system (Promeg a, USA)를 이용하여 정제하였고, 염기 서열 분석은 BigDye1재 terminator cy- cle sequencing ready reaction kit (Perkin - Elmer) # 사용하여 PCR로 반응(96”C 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분)시킨 후 Genetic analyzer(ABI Prism1X1 310, Perki口-Elmer)로 하였다. 얻어진 염기서열의 상동성은 NCBKNational Ceter for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 Blast wogram으로 분석하였다.
홍국분말 1 g에 80%에 탄올 9 mL을 가해 1분간 흔들어 추출한 후 상 등액을 취해 HPLC(Jasco PU-987 pump, Tokyo, Japan)를 이용하여 monacolin K 함량을 측정하였다. HPLC 분석은 Hypersil ODS column(5 pore size, 150 '乂 4.
홍국분말 1 g에 80%에 탄올과 80% 메탄올 또는 물 9 m札 을 가한 후 실온에서 1시간 교반하여 색소를 추출하였다. 다음 membrane filtertPVDF, pore size 0.
대상 데이터
Table 1에서와 같이 실험에 사용한 29종의 모든 홍국균은 한국 식품 개발 연구원에서 보관 중인 것을 사용하였다. 홍국 제조를 위한 종균은 PDA(potato dextrose agar, Difco) 배지를 사용하여 30“C에서 4일간 균체를 배양하였다.
백미는 시중 재래시장에서 구입하여 사용하였다. Mona~ colin K 추출용에탄올, 메탄올, 물은 HPLC분석용(Fisher Scientific Korea Ltd.
5 11M primer set로 총부피 는 50 虬로 하였다. 사용된 primer 와 probe는 각각 ITS의 경우 ITS5(5-GGAAGTAAAAG- TCGTAACAAGG-37)와 ITS4(5, -TCCTCCGCTTATATG C-3, ), 28S rDNA의 경우 NL 26(5-ACCCGCTGAAYTT- AAGCATAT-3')과 NL660(5, ~CTCCTTGGTCCGTGT~ TTCAAGACGG-3)을 사용하여 행하였다(18). PCR 반응은 predenaturation (94℃, 3분), den a turartion (64℃, 30초), annealing(50℃, 30초), elongation(94℃, 3분), extention(72℃, 10분)을 30회 반복하였다.
)을 사용하였다. 표준품 monacolin K (mevinolin)는 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
Table 1에서와 같이 실험에 사용한 29종의 모든 홍국균은 한국 식품 개발 연구원에서 보관 중인 것을 사용하였다. 홍국 제조를 위한 종균은 PDA(potato dextrose agar, Difco) 배지를 사용하여 30“C에서 4일간 균체를 배양하였다. 백미는 하루 밤 수침하여 탈수한 후 200 g을 1L 삼각플라스크에 넣고 120K에서 20분간 증자하고 곡물 건물량의 10%의 멸균수를 첨가하였다.
성능/효과
한편 ITS와 28S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, Table 4와 5에서와 같이 29번 홍국균의 염기서열과 100%의 높은 유사성을 갖는 균주는 각각 3종인 것으로 나타났다. 그러나 28S rRNA의 염기서열에서는 100%의 유사성을 나타낸 M. "施厂와 〃汀osHs가 ITS의 염기서열의 유사성은 동일하게 99.58%인 데 비해서, M. pu门기貝us는 ITS오+ 28S rRNA에서 유사성이 모두 100%로 나타난 결과로부터 29번 홍궄균은 M. purpureas CBS 281.34(accession No.: AF222496, 유사성 : 100%, 염 기 차 : 유사균 체 540종 중 0)인 것으로 확인되었다.
이어서 21, 8, 13, 12, 22, 24번 등의 순으로 높은 생산량을 보였다. 21, 8, 13, 12, 22, 24 번 홍국균은 각각 M. kaoliang ATCC 46595, M. purpureus ATCC 6405, M. purpureus IFO 32228, M. purpureus 32316, M. kaoliang ATCC 46596, M. ruber ATCC 46598로 M. purpureus와 M. kaoliange M. anZca나 M. pz7osus보다 색소 생산량이 우수한 것으로 사료되었다.
kaoliang 을 배양한 것이었다. 29번 홍국의 monacolin K 함량은 M. purpuerus와 M. kaoli이辎을 배양한 홍국보다도 2.4—8배나 높았다. 한편 보고된 홍국중의 monacolin K 함량은 丿诺 ruber ATCC 20657과 M.
kaoliang ATCC 46596 등의 균체를 배양한 홍국에서 monacolin K 생성량도 높았다. 그러나 색소와 monacolin K 생산량은 미동정된 홍국균이 가장 많은 것으로 나타나 형태학적 관찰과 ITS 및 28S rRNA 부분 유전자 염기서열 분석을 실시한 결과, M. purpureas CBS 281.34인 것으로 동정되었다.
시료 중 29번 홍국에서 가장 많은 양의 적색 색소가 생산되었으며 이의 색소 생산량은 다른 홍국에 비해 1.3배에서 39배나 많이 생산된 것을 알 수 있었다. 이어서 21, 8, 13, 12, 22, 24번 등의 순으로 높은 생산량을 보였다.
1에서와 같이 29종의 홍국균을 쌀에 배양하여 제조한 홍국의 적색 정도는 1, 2, 8, 10, 12, 13, 21, 22, 24, 29번의 홍국에서 높았다. 시료 홍국을 80% 에탄올과 메탄올 및 물을 용매로 사용하여 추출한 추출물의 색소량을 측정한 결과, Table 2에서와 같이 홍국색소는 메탄올과 에탄올에 잘 추출되나 증류수에서는 잘 추줄되지 못하여 수용성 색소는 극히 적게 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 홍국색소가 대부분 에탄올, 메탄올, 석유에테르, 클로로 포름, 아세톤 등의 유기용매에 의해 추출된다는 보고(11, 19-21)와 일치하였다.
02 g/100 g(17), 상업적 홍국에서는 0, 2%⑸의 monacolin K가 얻어졌다고 보고되어 있匸}. 이들 결과로부터 미동정된 29번 홍국균의 monacolin K 생성량은 M. 厂如e厂나 M. /刀7os必(5, 17, 22)나 본 연구에 사용된 28종의 홍국균보다도 현저하게 높은 것을 알 수 있었다.
한편 ITS와 28S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, Table 4와 5에서와 같이 29번 홍국균의 염기서열과 100%의 높은 유사성을 갖는 균주는 각각 3종인 것으로 나타났다. 그러나 28S rRNA의 염기서열에서는 100%의 유사성을 나타낸 M.
29종의 홍국균 중 미동정된 29번 홍국균이 monacolin K의 대량생산에 가장 적합한 것으로 판정되었기에 이 균주의 동정을 실시하였다. 형태학적 관찰 결과 중 MEA와 PDA 배지상에서의 번식 형태를 보면, Fig. 3에서와 같이 7일간 배양한 균체 모두 뿌리형의 형태로 번식하였으며, MEA배지에서보 다는 PDA배지 에서 더 잘 배양되었다. 또한 M.
이에 본 연구 에서 는 monacolin K를 이용한 건강식품의 개발을 위한 기초연구로 monacolin K의 생산효율성을 높이고자 미동정된 1종의 홍국균을 포함해 29종의 홍국균을 수집하여 monacolin K를 대량 생산하는 균주를 탐색하였다. 홍국은 PDA배 지 에서 배양한 홍국균을 침지-증자한 백미에 5%가 되도록 접종 후, 30℃에서 10일간 배양하여 제조하고 이를 건조, 분말로 하여 사용하였다 그 결과 색소 생성량이 많은 M purpureas ATCC 16457, M. purpureas IFO 32316f M. purpureas IFO 32228, M. kaoliang ATCC 46595, M. kaoliang ATCC 46596 등의 균체를 배양한 홍국에서 monacolin K 생성량도 높았다. 그러나 색소와 monacolin K 생산량은 미동정된 홍국균이 가장 많은 것으로 나타나 형태학적 관찰과 ITS 및 28S rRNA 부분 유전자 염기서열 분석을 실시한 결과, M.
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