In order to promote the value of the flowers as new agricultural products, we investigated the biological activities of rape, arrowroot, and rose extracts. Biological activities investigated included antioxidant activity and the effects on 3T3-L1 fibroblast cells. When each flower was extracted with...
In order to promote the value of the flowers as new agricultural products, we investigated the biological activities of rape, arrowroot, and rose extracts. Biological activities investigated included antioxidant activity and the effects on 3T3-L1 fibroblast cells. When each flower was extracted with methanol, the antioxidant index and electron donating activity of roses was the highest $(IC_{50}$ of rose extract was $17.6 \mu{g}/m\ell$). When 3T3-L1 fibroblast cells were treated with extracts made with hexane, ethyl acetate, and ether, the rape extracts had a cytotoxic effect on the cells. 12.2% of cells survived when treated with a 3mg/$m\ell$ ether extract while those treated with the same concentration of hexane and ethyl acetate had survival rates of 76.2% and 78.6% respectively. In contrast to rape, the ether extract of arrowroot and rose stimulated the growth of 3T3-L1 cells. The effect of rose extracts was much bigger than those of other extracts. Although every rose extract stimulated the growth of the 3T3-L 1 cells, the ether extract stimulated growth up to 168.6% compared to the control at the concentration of $0.3mg/m\ell$, and 148.3% at the concentration of $1mg/m\ell$. The toxicity on cells treated with $H_2 O_2$ of $450\mu{M}l$was decreased with the addition of rose extract. The survival rate after treatment with rose extract at the concentration of $100\mu{g}/m\ell$ was increased to 71% compared to the 32% survival rate of control. From these results, it can be concluded that the extracts of arrowroot and rose seem to stimulate cells, whereas the extract of rape has a cytotoxic effect. Biological activities of ether extract were the strongest compared to those of other extracts at the tested concentrations.
In order to promote the value of the flowers as new agricultural products, we investigated the biological activities of rape, arrowroot, and rose extracts. Biological activities investigated included antioxidant activity and the effects on 3T3-L1 fibroblast cells. When each flower was extracted with methanol, the antioxidant index and electron donating activity of roses was the highest $(IC_{50}$ of rose extract was $17.6 \mu{g}/m\ell$). When 3T3-L1 fibroblast cells were treated with extracts made with hexane, ethyl acetate, and ether, the rape extracts had a cytotoxic effect on the cells. 12.2% of cells survived when treated with a 3mg/$m\ell$ ether extract while those treated with the same concentration of hexane and ethyl acetate had survival rates of 76.2% and 78.6% respectively. In contrast to rape, the ether extract of arrowroot and rose stimulated the growth of 3T3-L1 cells. The effect of rose extracts was much bigger than those of other extracts. Although every rose extract stimulated the growth of the 3T3-L 1 cells, the ether extract stimulated growth up to 168.6% compared to the control at the concentration of $0.3mg/m\ell$, and 148.3% at the concentration of $1mg/m\ell$. The toxicity on cells treated with $H_2 O_2$ of $450\mu{M}l$was decreased with the addition of rose extract. The survival rate after treatment with rose extract at the concentration of $100\mu{g}/m\ell$ was increased to 71% compared to the 32% survival rate of control. From these results, it can be concluded that the extracts of arrowroot and rose seem to stimulate cells, whereas the extract of rape has a cytotoxic effect. Biological activities of ether extract were the strongest compared to those of other extracts at the tested concentrations.
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제안 방법
본 연구는 우리나라에서 나는 꽃을 식용. 비식용 가공제품 소재로서 가치를 부여하는 한편, 기능성 소재로서의 새로운 수요를 창출하기 위한 기초연구의 일환으로 유채꽃, 칡꽃, 그리고 장미 꽃추출물의 항산화력과 수소전자 공여능을 분석하는 한편 3T3-L1 fibroblast cell을 이용하여 세포 성장에 미치는 영향과 压。2에 의한 세포독성 억제 효과를 조사함으로써 유채꽃, 칡꽃 및 장미꽃의 항산화 및 세포 성장에 영향을 주는 생리 활성 효과를 조사하였다.
H2O2 세포독성에 대한 억제효과는 3T3-L1 fibroblast 세포를 사용하여 H2O2 45O]1M에 6시간 노출시키면서 무처리군과, H2O2 45011M만을 처리 한 군, H2O2 450J1M과 식용꽃 추출물을 함께 처리한 군으로 나누어 처리하고 세포에 대한 독성을 조사하였다. 6시간 후에 MTT assay에 의해 cell을 acidic isopropanol과 4시간 동안 배양시킨 다음 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Rancimat법에 의한 항산화력 측정은 시료 10g을 75℃, 수욕상에서 75% ethanol로 3시간씩 3회에 걸쳐 반복 추출 후, 추출액의 가용성 고형분을 측정하고 추출액의 농도가 lOOOppm (추출액 /lard) 이 되도록 lard에 첨가한 다음, Rancimat (Metrohm AG, CH-9100 Herisau, Swiss)을 이용하여 120℃, 2W/hr에서 산화유도기간을 측정하여 무처리구에 대한 산화유도기간의 비로 AI(Anti- oxidant Index)를 나타내었다.
생리활성효과 측정을 위해 soxMet장치를 이용하여 식용꽃 건조분말 추출액을 제조하였다. 즉, 칡꽃, 장미꽃, 유채꽃 건조 분말 10g을 원통 여지에 취하고 둥근 플라스크에 hexane, ether 및 ethylacetate 등의 유기용매를 20。〜300i成 정도 넣어 80 ℃ 의 항온 수조 속에서 48시간 동안 환류 추출한 다음 0.3, 1.0, 3.0(mgM)의 농도로 농축하여 분석에 사용하였다.
유채꽃, 칡꽃, 장미꽃에 대해서 예비실험을 통해 생리활성 효과가 높은 것으로 나타난 3가지 유기 용매, hexane, ethylacetate, 그리고 ether를 사용하여 식용꽃 추출물을 얻었다. 그리고 각각의 추출물에 대해서 3T3-L1 세포를 이용하여 세포 성장에 대한 영향을 MTT법으로 조사하였다. 또 한 식용꽃 추출물을 세포 배양액에 처리할 때는 DMSO에 의한 효과를 최소화하기 위하여 DMSO의 최종농도가 0.
즉, 기하급수적으로 성장하는 3T3-L1 세포의 농도를 5xl04 cells/mL로 조정한 다음, 96well plate에 5xlO3 cell/100㎕/well로 loading하여 COi incubator(37℃, CO2 5%)에서 24시간 배양하였다. 배양액에 추출용매별로 식용꽃 추출액을 각각 10 ㎕씩 첨가하고 CO2 incubator(37℃, CO2 5%)에서 24시간 배양한 후 추출액을 제거하고 배지를 fresh medium으로 1회 세척한 후, 5mg/mL의 농도 로 제조한 MTT 용액 10㎕를 첨가하고 CO2 incubator(37℃, CO2 5%)에서 4시간 배양한 다음 formazan이 형성되면 isopropanol 혼합액 100㎕ (isopropanol 9.6m£ + IN HC1 0.4: 최종 0.04N HC1)를 첨가하여 formazan을 녹인 다음 595nm에 서 microplate reader를 이용하여 홉광도를 측정하 였다.
생리활성효과 측정을 위해 soxMet장치를 이용하여 식용꽃 건조분말 추출액을 제조하였다. 즉, 칡꽃, 장미꽃, 유채꽃 건조 분말 10g을 원통 여지에 취하고 둥근 플라스크에 hexane, ether 및 ethylacetate 등의 유기용매를 20。〜300i成 정도 넣어 80 ℃ 의 항온 수조 속에서 48시간 동안 환류 추출한 다음 0.
실험에 사용한 세포주는 3T3-L1 fibroblast cell 로서 한국생 명 공학연구원에서 구입 하여 사용하였다. 세포의 배양액은 DMEM (GIBCO Lab., Grand Island, NY) 에 10% Fetal bovine serum(FBS) 을 첨가하고, 페니실린 (100 units/㎖과 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)으로 보충하여 만들었다. 세포 는 5% C6로 조정된 배양기에서 37℃로 배양하였다.
유채꽃, 칡꽃, 그리고 장미꽃의 추출물을 제조하여 Rancimat방법에 의한 항산화력과 수소전자 공여능, 그리고 3T3-L1 fibroblast cell에 대한 생리활성 효과를 측정하였다.
유채꽃, 칡꽃, 장미꽃에 대해서 예비실험을 통해 생리활성 효과가 높은 것으로 나타난 3가지 유기 용매, hexane, ethylacetate, 그리고 ether를 사용하여 식용꽃 추출물을 얻었다. 그리고 각각의 추출물에 대해서 3T3-L1 세포를 이용하여 세포 성장에 대한 영향을 MTT법으로 조사하였다.
건조시료 1g에 75% methanol을 넣고 50℃의 항온수조에서 진탕하면서 추출한 후 여과액을 둥 근 플라스크에서 25ml까지 채운 후, 예비실험에 의해 적정 농도로 희석하여 분석에 사용하였다. 추출액 2niC(in ethanol)에 1.67×10-4M의 1, 1-diphenyl- 2-picryl hydrazyl (DPPH) solution(in methanol)을 0.5M첨가하고 암소에서 30분간 방치하여 반응시킨 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음 식에 의하여 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도로부터 수소전자공여능을 계산하였다.
대상 데이터
본 실험에서는 식용꽃으로서 유채꽃, 장미꽃, 칡꽃 3종을 사용하였다. 유채는 제주도에서, 장미 는 경기도 수원시 농촌생활연구소 주변지역어〕서, 칡꽃은 경기도 가평군에서 각각 채취한 후 즉시 꽃잎만 분리한 후 세척하고 동결건조한 다음 -2 0℃의 냉동고에 분말을 저장하면서 분석에 사용하였다.
실험에 사용한 세포주는 3T3-L1 fibroblast cell 로서 한국생 명 공학연구원에서 구입 하여 사용하였다. 세포의 배양액은 DMEM (GIBCO Lab.
본 실험에서는 식용꽃으로서 유채꽃, 장미꽃, 칡꽃 3종을 사용하였다. 유채는 제주도에서, 장미 는 경기도 수원시 농촌생활연구소 주변지역어〕서, 칡꽃은 경기도 가평군에서 각각 채취한 후 즉시 꽃잎만 분리한 후 세척하고 동결건조한 다음 -2 0℃의 냉동고에 분말을 저장하면서 분석에 사용하였다. 분석에 사용된 모든 시약은 특급품 이상을 사용하였다.
이론/모형
실험조건은 3T3-L1 fibtoblast 세포 (DMEM media in 10% FBS)를 이용하여 P-100 dish에서 5xl05 cells/mL을 loading한 후 2일간 배양한 다음 2.0xl06 cell/mL (viability 90% 이상)로 하여 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-dipheyltetrazolium bromide (MTT) assay(Scudiero DA, 1988)로 식용꽃 추출물의 세포성장에 대한 생리활성 효과를 측정하였다. 즉, 기하급수적으로 성장하는 3T3-L1 세포의 농도를 5xl04 cells/mL로 조정한 다음, 96well plate에 5xlO3 cell/100㎕/well로 loading하여 COi incubator(37℃, CO2 5%)에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
Fig. 3과 같이 생리활성 효과가 높은 장미꽃 추출물에 대하여 cell에 toxic한 물질인 压。2를 처리한 다음 cell에 대한 독성을 억제시키는 효과가 있는지를 조사한 결과, Table 2와 같이 장미꽃 주출물의 첨가농도가 높아질수록 HQz에 의한 세포독성이 감소하는 효과가 있음이 나타났다. 즉, H2O2만을 처리한 cell의 경우는 31%의 생존율을 보인 반면, 장미꽃 추출물 10您/!戒을 함께 처리한 경우는 생존율이 61.
이상의 결과에서 보는 바와 같이, 식용꽃을 여러 가지 유기 용매로 추출했을 때, 식용꽃의 종류에 따라 각각 세포 성장에 대해서 서로 다른 효과를 나타냈다. 그리고 hexane과 ethylacetate, 그리고 ether 중에서 ether 추출물 속에 가장 강력한 생리 활성물질이 함유되어 있음을 알 수 있었다
꽃 종류별로 수소전자공여능을 조사한 결과, 장미꽃이 다른 꽃에 비하여 IC50 이 낮게 나타나 장미꽃의 free radical scavenging하는 능력이 우수함을 알 수 있었다. 즉, 장미꽃 추출물은 17.
산국꽃에서 Sesquiterpene Lactones과 같은 항암 성분이 들어 있어 복수암의 치료에 효과적이었다는(남상해 등 1997) 보고로 미루어보면 식물의 잎이나 뿌리, 열매 뿐 아니라, 꽃 속에도 cytotoxic한 생리활성을 나타내는 성분들이 들어 있다는 것을 알 수 있다. 본 실험의 결과에서도 추출물에 함유된 flavonoid 및 polyphenols 성분들이 항산화에 기여하고 세포의 성장 혹은 cytotoxic한 효과에도 작용할 것으로 판단된다.
식용꽃의 hexane, ethylacetate, 그리고 ether로 추출하여 3T3-L1 세포의 성장에 미치는 영향을 조사한 결과, 유채꽃의 추출물은 3T3-L1 fibroblast cell에 독성 효과를 나타냈는데, 특히 ether 추출물의 효과가 더 높았다. 유채꽃 추출물 3mg/㎖을 처리했을 경우, hexane 추출물 처리군은 대조군 대비 76.
그림에서와 같이 유채꽃의 경우는 처리 농도가 높을수록 3T3-L1 세포에 대한 cytotoxic한 효과를 나타내고 있다. 용매별로 보면 hexane과 ethylacetate 추출물보다 ether 추출물이 훨씬 더 세포 독성 효과가 높은 것으로 나타났다 특히 유채꽃 추출물 %回成를 처리했을 경우, hexane 추출물 처리군은 대조군에 비해 76.2%, ethylacetate 처리군은 78.6%인데 비해, ether 추출물 처리군에서는 대조군에 비해 12.2%만 생존하였다. 이것은 유채꽃의 ether 추출물 속에 cytotoxic한 효과가 높은 생리 활성 물질이 존재하기 때문인 것으로 판단된다.
식용꽃의 hexane, ethylacetate, 그리고 ether로 추출하여 3T3-L1 세포의 성장에 미치는 영향을 조사한 결과, 유채꽃의 추출물은 3T3-L1 fibroblast cell에 독성 효과를 나타냈는데, 특히 ether 추출물의 효과가 더 높았다. 유채꽃 추출물 3mg/㎖을 처리했을 경우, hexane 추출물 처리군은 대조군 대비 76.2%, ethylacetate 처리군은 78.6% 의 생존율을 보인데 비하여, ether 추출물 처리군 의 경우는 12.2%의 낮은 생존율을 보였다. 반면에 칡꽃의 경우 ether 추출물은 세포 성장을 촉진 시키는 효과를 나타냈는데, 특히 세포의 성장을 촉진시키는 효과는 장미꽃에서 더욱 두드러지게 나타났다.
4였다. 이러한 결과와 같이 장미꽃은 무첨가 대조구에 비하여 기질인 lard의 산화를 2.6배 지연시켰으며, 유채꽃과 칡꽃에 비해서도 2배 정도 항산화력이 높은 것으로 나타났다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 유채꽃 추출물은 cell에 대해서 독성효과를 나타내는 반면, 칡꽃과 장미꽃 추출물은 세포 성장을 촉진하는 효능을 지니고 있으며, 이러한 생리효과를 나타내는 성분을 주줄하는 용매로는 ether가 다른 유기용매보다 훨씬 효과적인 것으로 나타났다.
0mg/mC의 농도로 처리한 구에서는 모 든 용매 추출물에서 cytotoxic한 효과를 나타냈다. 이상의 결과에서 보는 바와 같이, 식용꽃을 여러 가지 유기 용매로 추출했을 때, 식용꽃의 종류에 따라 각각 세포 성장에 대해서 서로 다른 효과를 나타냈다. 그리고 hexane과 ethylacetate, 그리고 ether 중에서 ether 추출물 속에 가장 강력한 생리 활성물질이 함유되어 있음을 알 수 있었다
이상의 결과와 같이 장미꽃이나 칡꽃에는 세 포의 성장을 촉진시키는 성분이 들어 있는 것으 로 나타났다. Perez et al.
(2002)은 Calendula officinalis 추출물을 rat liver cell 배양액에 추리했을 때 농도가 낮은 농도에서 어느 정도 증가할 때까지는 세포에 대한 anti-genotoxic한 특성을 보이다가 농도가 높아지면 genotoxic한 효과를 보였음을 보고한 바 있으며, 이를 추출물에 함유된 flavonol의 성분이 antioxidant한 특성을 갖으면서 도 한편으로는 prooxidant 한 특성을 갖기 때문인 것으로 해석하였다. 이와 같은 결과로 본 실험에 서도 농도가 높을 때는 식용꽃 추출물 모두에서 cell 수가 감소하는 경향을 보였다. Abdullav et al.
반면에 칡꽃의 경우 ether 추출물은 세포 성장을 촉진 시키는 효과를 나타냈는데, 특히 세포의 성장을 촉진시키는 효과는 장미꽃에서 더욱 두드러지게 나타났다. 장미꽃 추출물은 모든 농도의 추출물에서 3T3-L1 fibroblast cell의 성장을 촉진하는 효과를 나타냈는데, 특히 ether 주줄물을 0.3mg/mC를 처리했을 경우, 대조군에 비해 168.6%의 높은 세 포 성장 촉진 효과를, lmg/㎖에서는 148.3%의 세 포 성장 촉진 효과를 나타내었다.
3). 즉, 모든 주출 용매 처리구에서 처리 농도가 낮은 0.3mg/m£ 일 때 세포성장 촉진 효과가 나타났으며 이러한 효과는 특히 ether 추출물에서 현저하게 나타났다. 장미꽃 ether 추출물을 0.
이 낮게 나타나 장미꽃의 free radical scavenging하는 능력이 우수함을 알 수 있었다. 즉, 장미꽃 추출물은 17.6 (ig/rni 의 낮은 농도에서도 50%의 free radical scavenging activity를 나타냄으로써 유채꽃의 IC5o 481.1/zg/mC 와 칡꽃 380.2㎍/㎖에 비하여 항산화능이 높은 것으로 조사되었다(Table 1).
그림에서와 같이 식용꽃의 종류별로는, 유채꽃 추출물의 경우는 강력한 cytotoxic한 효과를 나타냈고, 장미꽃 추출물은 세 포 성장 촉진 효과를 나타냈으며, 칡꽃 추출물의 경우도 장미꽃보다는 약했지만 세포 성장을 촉진 시켰다. 추출물의 농도별로는 세가지 종류의 꽃 모두 추출물의 농도가 03询1戒에서 LO, 3.0mg/m£ 로 증가함에 따라 세포의 수도 감소하는 경향을 보였다.
항산화지수는 장미꽃이 무첨가구에 비해 24배로 산화유도기간을 연장시키는 효과를 보였으며, 추출물의 수소전자공여능 조사 결과, 장미꽃 추출물의 Kg은 17.6㎍/㎖로서 유채꽃, 칡꽃에 비해 낮은 농도에서도 free radical scavenging 효과가 높게 나타남으로써 매우 항산화 효과가 높은 것으로 나타났다.
후속연구
이 실험의 결과를 통해 노화가 쉬운 피부에 장미꽃 향수 등 향의 소재로 뿐만이 아니라 장미 추출물을 기능성 소재로 식용 . 비식용 제품에 사용한다면 노화억제, free radical의 scavenging 효과가 높을 것으로 판단되며, 더 나아가서는 이러한 성분의 구명까지 필요할 것으로 보인다.
은 20—50 您/mC였다는 보고와 비교할 때, 장미꽃은 매우 낮은 농도에서도 free radical scavenging 효과가 높은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 볼 때, 장미꽃은 항산화력이 매우 높은 것으로 판단되며, 이러한 효과를 지닌 기능성 성분의 분리 등 체계적이고 지속적인 연구가 필요하다고 하겠다.
이상의 결과에서 장미꽃 추출물은 항산화 효과 및 세포 성장 증진 효과가 있으며, 외부의 독성물질이 침투했을 때 cell을 보호하는 효과를 함 유하고 있으므로 식용제품으로 활용시에 생리활성효과가 높을 것으로 예상되며, 또한 화장품 등의 기능성제품으로의 활용도가 높을 것으로 판단 된다. 이 실험의 결과를 통해 노화가 쉬운 피부에 장미꽃 향수 등 향의 소재로 뿐만이 아니라 장미 추출물을 기능성 소재로 식용 .
2 园畝의 강한 cytotoxic activity를 보였다고 보고하였다. 이와 같은 결과를 통해서 볼 때 용매에 따라, cell에 첨가한 농도에 따라 미치는 영향이 어떻게 다른지에 대한 연구가 추가로 필요하리라고 판단된다.
항산화력이 높은 장미꽃 추출물에 함유된 성분에 대한 더 많은 연구와 더불어, 낮은 농도에 서는 세포성장을 촉진시키지만 높은 농도에서는 genotoxic한 효과가 있음을 볼 때 꽃의 종류별로 추출용매와 농도를 달리한 후속실험이 필요할 것으로 생각된다.
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