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문제 정의
- 한국산 인삼의 단백질의 용해성 및 전기영동패턴'" 과 인삼추출물의 질소성분의 변화'' 등이 조사된 바 있으며, 인삼의 단백성분이 방사능 보호능이 있다는 연구결과'이8)로 인삼단백질의 중요성이 인식되었다. 따라서 본 연구에서는 백삼단백질의 가열에 의한 내열특성을 알아보고 전기영동과 CM-cellose 컬럼 크 로마토그라피를 이용하여 내열성 단백질과 비내열성 단백질을 분리하고 분자량을 조사하였다.
- 이들 부위별 시 료중 주근 중심부와 주근 주피부를 각각 70메쉬로 분 쇄하여 공시재료로 하였다. 부위별 구분하여 시료로 사용한 이유는 현재까지 인삼의 특유성분은 인삼의 종류, 연근, 부위에 따라 많은 차이를 나타내고 있음이 밝혀지고 있는 바 본 실험에서도 부위의 차이점을 알 아보고자 구분하였다.
제안 방법
- Meyer)이 었다. 포장에서 수확한 신선한 인삼을 세척하고 주근 중심 부와 주근 주피부, 지근 중심부, 지근 주피부, 세근으 로 분리한 후 세절한 것을 55℃에서 7일간 열풍건조하여 백삼의 부위별 시료를 제조하였다. 이들 부위별 시 료중 주근 중심부와 주근 주피부를 각각 70메쉬로 분 쇄하여 공시재료로 하였다.
- 백삼의 주근 중심 및 주근 주피부에서의 내열성 단 백 질 추출방법은 다음과 같았다. 즉 시료 1 g에 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4) 100 ml를 첨가하고 70 rpm에서1시간 교반한 후 6번 여지로 여과하여 여과액을 얻고다시 그 잔사에 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.4) 100 ml를 첨가하여 추출하였으며 이와 같은 방법을 2회 반복 하여 얻은 상징 액을 모두 합하여 잘 혼합한 후 가열시 간대별로 15 ml 시험관에 각각 나누어 넣고 끓는 물에서 가열시간을 각각 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120분으로 달리하면서 가열한 다음 18℃에서 20분간 10, 000Xg로 원심분리(5810R, Eppendort)한 후 상징액을 내열성 단백질을 추출액으로 하였다.
- 내열성 단백질의 분리는 Takeda 등 의 방법을 적용하여 시행하였다. 즉 주근 중심과 주근 주피부를혼합한 백 삼분말 10 g에 0.05 M 인산염 완충액 (pH 7.2) 200 ml를 넣고 30분간 교반한 후 원심분리(8000Xg, 20분)하고 2번 여지로 여과하여 여과액을 모으고 그 침전물에 0.05 M 인산염 완충액(pH 7.2) 200ml를 가하여위 와 같은 방법으로 3회 반복 추출하여 여과액을 모은 다음 냉동건조하여 40 ml 증류수에 녹여 전체액을 40 m 로 만든 후 (NH4)2SC)4를 가하여 70% 까지 포화시켜 원심분리(8000Xg, 20분)하여 그침전물을 취하여 투석 을 하였으며 원심분리(8, 000xg, 25 min. 4℃)를 한 후상징액을 얻어서 냉동건조를 하였다. 위에서 냉동건하여 얻은 시료를 0.
- 4)으로 바꾸어 용출시켜 양이온성단백질 B분획을 얻었다. 이렇게 얻은 두 분획 에 대하여 각각 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백 질함량이 높은 부분만을 모아 음이온성 단백질과 양 이온성 단백질로 분리하였으며 각각을 0.5 N NaOH 용 액으로 중화시킨 후 비등 수욕상에서 2시간 동안 가열 하고 원심분리하여 그 상징액을 내열성 단백질로 하고 침전물을 비내열성 단백질로 분리하고 이를 냉동 건조하여 분자량을 측정하고 단백질을 정량하였다.
- 내열성 단백질의 분자량은 Laemmli 의 방법에 따라서 SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)를 사용하여 측정하였다. 즉 시료 100 ug 중에 단백질 100 ug이 함유되도록 2x treatmentbufier(0.125M Tris - cl pH 6.8, 4% SDS, 20% 잉ycerol, 10% 2-mercaptoethanol)를 가하여 용해시킨 후 90℃의수조에서 30초간 두었다가 꺼내어 냉각후 시료로 사용하였다. 13% separating gel과 stacking ge에 loading하여 20 mA로 4℃에서 2시간 전기영동하였으며 전극 조 완충액은 0.
- 125% Coomassie blue R 250으로 염색 후 메탄올 - 초산 - 증류수(1 : 1 : 8) 용액으로 탈색하였다. 이때 사용한 표준단백질은 시그마사의 제품으로 서 소의 혈청 알부민(분자량 66, 000), 계란알부민(분자량 45,000), glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (분자량 36, 000), 카보닉 안하이 드라제(carbonic anhydrase 분자량 29, 000), 트립시노겐(분자량 24, 000), 트립 신인히비터(분자량 20, 100), 알파락토알부민(분자량 14, 200)을 marker로 하여 이들과의 상대적 이동도를 비교하여 측정하였다.
- 전 실험의 결과에서 백삼의 주근 중심 및 주근 주피 부의 가열시간에 따른 내열성단백질의 분자량은 같은 양상을 보여 주어 CM-cellose 컬 럼 크로마토그라피 에 의한 분리는 백삼의 주근 중심과 주근 주피부를 혼합하여 시료로 사용하였다. 즉 백삼의 분말을 50 mM 인산 염 완충액 (pH 7.4)으로 추출하고 70% 황산 암모늄 염 석을 거쳐 투석한 후 얻어진 성분을 CM-Cellulose 컬 럼크로마토그라피로 분리하였다. 이 결과는 Fig.
- 양이온성 단백질 B분획이 인삼단백질에서 중요한 의미를 가지는 것으로 생각되어 단백질 함량과 분자 량을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 인삼은 충북음성시험장에서 수확한 6년근의 수삼(Pamzx ginseng C. A. Meyer)이 었다. 포장에서 수확한 신선한 인삼을 세척하고 주근 중심 부와 주근 주피부, 지근 중심부, 지근 주피부, 세근으 로 분리한 후 세절한 것을 55℃에서 7일간 열풍건조하여 백삼의 부위별 시료를 제조하였다.
- 포장에서 수확한 신선한 인삼을 세척하고 주근 중심 부와 주근 주피부, 지근 중심부, 지근 주피부, 세근으 로 분리한 후 세절한 것을 55℃에서 7일간 열풍건조하여 백삼의 부위별 시료를 제조하였다. 이들 부위별 시 료중 주근 중심부와 주근 주피부를 각각 70메쉬로 분 쇄하여 공시재료로 하였다. 부위별 구분하여 시료로 사용한 이유는 현재까지 인삼의 특유성분은 인삼의 종류, 연근, 부위에 따라 많은 차이를 나타내고 있음이 밝혀지고 있는 바 본 실험에서도 부위의 차이점을 알 아보고자 구분하였다.
- 8, 4% SDS, 20% 잉ycerol, 10% 2-mercaptoethanol)를 가하여 용해시킨 후 90℃의수조에서 30초간 두었다가 꺼내어 냉각후 시료로 사용하였다. 13% separating gel과 stacking ge에 loading하여 20 mA로 4℃에서 2시간 전기영동하였으며 전극 조 완충액은 0.912 M glycerol과 0.1% SDS를 포함한 0.025 M Tris(pH 8.3) 완충액을 사용하였다. 전기영동 이 끝난 겔은 0.
- 전 실험의 결과에서 백삼의 주근 중심 및 주근 주피 부의 가열시간에 따른 내열성단백질의 분자량은 같은 양상을 보여 주어 CM-cellose 컬 럼 크로마토그라피 에 의한 분리는 백삼의 주근 중심과 주근 주피부를 혼합하여 시료로 사용하였다. 즉 백삼의 분말을 50 mM 인산 염 완충액 (pH 7.
이론/모형
- 단백질의 정량은 Lowry 등의 방법에 따라 측정하 였으며 이때 표준단백 질로는 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 사용하였다. 즉 앞에서 얻은 내 열성 단백질 분획을 각각 700 ul씩 분취하여 50% 티씨 에 이 (TCA)를 300 id 가하고 8, 000Xg에서 15분간 원심 분리하여 얻은 침전물에 O.
- 내열성 단백질의 분자량은 Laemmli 의 방법에 따라서 SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)를 사용하여 측정하였다. 즉 시료 100 ug 중에 단백질 100 ug이 함유되도록 2x treatmentbufier(0.
- 50 mM 인산염 완충액으로 백삼의 주근 중심 및 주 근 주피부를 추출한 원액을 가열시간별로 가열하여 내열성 단백질의 단백질 함량을 Lowry법으로 측정한 결과는 Fig. 1과 같다.
- 내열성 단백질의 분리는 Takeda 등 의 방법을 적용하여 시행하였다. 즉 주근 중심과 주근 주피부를혼합한 백 삼분말 10 g에 0.
성능/효과
- 따라서 전체적으로 볼 때 주근 중심, 주근 주피부의 내열성 단백질의 함량은 가열시간이 90분 이후부터는 감소하는 경향이 커지므로 90분간 가열로서는 인삼단 백질은 비교적 안정하다고 볼 수 있다.
- 주근 중심 및 주근 주피부의 가열시간에 따른 내열 성 단백질의 분자량은 같은 양상을 보여주었다. 즉 가 열시간이 길어짐에 따라 단백질의 밴드는 희미하게 나타났으며 가열시간 30분까지는 5개의 선명한 밴드66, 29, 24, 22, 20KD와 두 개의 희미한 밴드 45, 12KD를 확인할 수 있어서 모두 7개가 분리되었다. 가열시간이 60분부터는 전반적으로 단백질 밴드가 희미하게 보였으며 특히 22KD는 소실되었음이 확인되었다.
- 즉 가 열시간이 길어짐에 따라 단백질의 밴드는 희미하게 나타났으며 가열시간 30분까지는 5개의 선명한 밴드66, 29, 24, 22, 20KD와 두 개의 희미한 밴드 45, 12KD를 확인할 수 있어서 모두 7개가 분리되었다. 가열시간이 60분부터는 전반적으로 단백질 밴드가 희미하게 보였으며 특히 22KD는 소실되었음이 확인되었다. 이러한 경향은 가열시간이 길어짐에 따라서 인삼의 단 백질이 변성된다는 것을 의미한다.
- 단백질의 회수율은 인산염 완충액으로 추출한 백삼 추출물의 단백질량을 100%로 하였을 때 70% 황산 암 모늄 염석을 거쳐 얻어진 단백질은 63.12%이었으며 CM-A 분획은 1.72%, CM-B 분획은 51.79%의 회수율을 얻어 양이온성 단백성분인 CM-B 분획이 음이온성 단백성분인 CM-A 분획보다 단백질 함량이 매우 높음을 알 수 있었다. Kim 등이 항방사선 작용이 있는 인삼단백성분을 분리하는 과정에서 보고한 것과
- 비교하면 CM-A 분획이 14.05%, CM-B 분획이 15.09%의 회 수율을 보여 CM-B가 약간 높은 회 수율을 보이는 것으로 나타났고 두 분획간의 회수율은 별 차이가 없는 것으로 나타났으나 본실험에서는두 분획간의 차이를 보였다.
- 또한 CM-A, CM-B 분획 을 비등수용액상에서 2시간 동안 가열한 후 분리한 내열성 단백질은 비내열성 단 백질보다 단백질 함량이 두 분획에서 높게 나타났으 며 내열성 단백질 함량은 양이온성 단백성분 CM-B 분 획이 28.24%로 음이온성 단백성분 CM-A 분획 0.80%보다 훨씬 높게 나타났다.
- 7 kD의 4개의 밴드를 얻은 결과와는 달랐다. 음이온성 내열성 단백질은 66, 55, 36, 29kD(a~d)의 4개의 희미한 밴드를 나타냈고 음이온성 비내열성 단백질은 29, 24, 12kD(a ~c)의 희미한 밴드로 나타났으며 이들 내열성 단백질 과 비내열성 단백질의 분자량은 29 kD를 제외하면 서로 다른 양상을 보였다.
- 한편 양이온성 내열성 단백질은 66, 55, 36, 29, 24, 20, 10 kD의 7개의 밴드를 나타냈고 그 중 66, 55, 36 kD(a, b, c)의 3개는 뚜렷한 밴드를 보였으며 양이온성 비내열성 단백질은 29, 24, 22, 20 kD(a~d)의 4개의 약한 밴드를 보였다.
- 이러한 결과는 전술한 가열시간에 따른 내열성 단 백질의 분자량을 조사한 결과에서 22 kD가 가열시간 60분부터 소실됨이 관찰되었던 바 위의 결과로 미루 어 인삼단백질중 분자량 22 kD는 양이온성 비내열성 단백질로 확인되었다. 따라서 Yonezawa 등'*이 실험 한 열에 안정 한 분획인 CM-B 분획추출물이 방사능 보 호능이 있음을 밝힌 것을 토대로 본실험에서는 CM-B 분획의 분자량을 확인하게 되었다.
- 이러한 결과는 전술한 가열시간에 따른 내열성 단 백질의 분자량을 조사한 결과에서 22 kD가 가열시간 60분부터 소실됨이 관찰되었던 바 위의 결과로 미루 어 인삼단백질중 분자량 22 kD는 양이온성 비내열성 단백질로 확인되었다. 따라서 Yonezawa 등'*이 실험 한 열에 안정 한 분획인 CM-B 분획추출물이 방사능 보 호능이 있음을 밝힌 것을 토대로 본실험에서는 CM-B 분획의 분자량을 확인하게 되었다. 그 결과 양이온성분획물이 66, 55, 36 kD로 확인되었다.
- 따라서 Yonezawa 등'*이 실험 한 열에 안정 한 분획인 CM-B 분획추출물이 방사능 보 호능이 있음을 밝힌 것을 토대로 본실험에서는 CM-B 분획의 분자량을 확인하게 되었다. 그 결과 양이온성분획물이 66, 55, 36 kD로 확인되었다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 내열성 단백질은 비 내열성 단백질과 분자량 별 차이를 보이며, 내열성 단 백질은 주로 분자량 66, 55, 36 KES 확인할 수 있었고 비내 열성 단백질은 주로 29, 24, 22, 20 KD의 분자량을확인할 수 있었다.
- 가열시간에 따른 내열성 단백질의 함량은 주근 중 심이 주근 주피보다 전체적으로 높았다. 주근 중심부 는 120분 가열시 78%가 손실되었으며 90분부터는 급격히 감소하였다.
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