본 연구에서는 천마(Gastrodia elata)추출물의 분획과 butanol 분획층의 연속적인 silicagel column chromatography를 통하여 유효성 분인 4-hydroxybenzyl alcohol 1. bis(4-hydroxyphenyl) methane 2. gastrodin(4-$\beta$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3을 분리하였다. 4-Hydroxybenzyl alcohol 1과 gastrodin(4-$\beta$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3은 tyrosinase에 대한 저해작용은 없으나 B16 melanoma 세포의 melanin 새성을 억제한다는 것을 발견하였다. Bis(4-hydroxyphenyl)methane 2 ($IC_{50}$/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL)은 arbutin ($IC_{50}$/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL) 보다 약 $\frac{1}{4}$의 tyrosinase 활성 저해작용을 나타내었지만 B16 melanoma 세포의 melanin 생성 억제는 오히려 arbutin 보다 높게 나왔다. 또한 butanol 분획층 ($IC_{50}$/ = 46$\mu\textrm{g}$/mL)의 tyrosinase에 대한 활성 저해 작용이 arbutin ($IC_{50}$/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL)보다 높은 억제 작용을 나타내었고 B16 melanoma 세포의 melanin 생성 억제도 arbutin 보다 높게 나왔다. 특히 butanol 분획층으로부터 분리된 페놀성 혼합물 ($IC_{50}$/ = 2.37 $\mu\textrm{g}$/mL)은 arbutin 보다 약 50배 가까운 매운 높은 tyrosinase 활성 억제 작용을 나타내었다. 이러한 결과로부터 천마추출물로부터 분리된 유효성분들이 tyrosinase에 대한 저해작용 뿐만 아니라 B16 melanoma 세포의 melanin 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 천마(Gastrodia elata)추출물의 분획과 butanol 분획층의 연속적인 silicagel column chromatography를 통하여 유효성 분인 4-hydroxybenzyl alcohol 1. bis(4-hydroxyphenyl) methane 2. gastrodin(4-$\beta$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3을 분리하였다. 4-Hydroxybenzyl alcohol 1과 gastrodin(4-$\beta$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3은 tyrosinase에 대한 저해작용은 없으나 B16 melanoma 세포의 melanin 새성을 억제한다는 것을 발견하였다. Bis(4-hydroxyphenyl)methane 2 ($IC_{50}$/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL)은 arbutin ($IC_{50}$/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL) 보다 약 $\frac{1}{4}$의 tyrosinase 활성 저해작용을 나타내었지만 B16 melanoma 세포의 melanin 생성 억제는 오히려 arbutin 보다 높게 나왔다. 또한 butanol 분획층 ($IC_{50}$/ = 46$\mu\textrm{g}$/mL)의 tyrosinase에 대한 활성 저해 작용이 arbutin ($IC_{50}$/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL)보다 높은 억제 작용을 나타내었고 B16 melanoma 세포의 melanin 생성 억제도 arbutin 보다 높게 나왔다. 특히 butanol 분획층으로부터 분리된 페놀성 혼합물 ($IC_{50}$/ = 2.37 $\mu\textrm{g}$/mL)은 arbutin 보다 약 50배 가까운 매운 높은 tyrosinase 활성 억제 작용을 나타내었다. 이러한 결과로부터 천마추출물로부터 분리된 유효성분들이 tyrosinase에 대한 저해작용 뿐만 아니라 B16 melanoma 세포의 melanin 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다.
Melanin pigmentation in human skin is a major defense mechanism against ultraviolet light of the sun, but abnormal pigmentation such as freckles, liver spot could be a serious aesthetic problem. Nearly all studies are mainly concentrated on searching for the materials that have inhibitory activities...
Melanin pigmentation in human skin is a major defense mechanism against ultraviolet light of the sun, but abnormal pigmentation such as freckles, liver spot could be a serious aesthetic problem. Nearly all studies are mainly concentrated on searching for the materials that have inhibitory activities on tyrosinase. In this work, to isolate phenolic compounds from Gastrodia elata, we purified the extract through solvent fractionation, column chromatography, and recrystallization. They were identified as 4-hydroxybenzyl alcohol 1, bis(4-hydroxyphenyl)methane 2, gastrodin (4-${\beta}$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3 on the base of spectroscopic evidences. In order to investigate their depigmentation effect, inhibitory activity against mushroom tyrosinase and inhibitory activity of melanin synthesis in B16 melanoma cells were evaluated in vitro. We have found that 4-hydroxybenzyl alcohol 1 and gastrodin (4- ${\beta}$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3 have no tyrosinase inhibitory activity, but inhibit the melanin synthesis in B16 melanoma cells. Tyrosinase inhibitory activities of bis(4-hydroxyphenyl)methane 2 (IC$\_$50/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL) and butanol fraction (IC$\_$50/ = 46 $\mu\textrm{g}$/mL) were lower/higher than that of arbutin (IC$\_$50/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL), but inhibitory activities of melanin synthesis in B16 melanoma cells were much higher than that of arbutin. Especially, tyrosinase inhibitory activities of isolated phenolic fraction (IC$\_$50/ = 2.37 $\mu\textrm{g}$/mL) from butanol fraction was very higher than that of arbutin (IC$\_$50/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL). Therefore, these results suggest that isolated phenolic compounds from Gastrodia elata have inhibitory activity against mushroom tyrosinase and inhibitory activity of melanin synthesis in 816 melanoma cells in vitro.
Melanin pigmentation in human skin is a major defense mechanism against ultraviolet light of the sun, but abnormal pigmentation such as freckles, liver spot could be a serious aesthetic problem. Nearly all studies are mainly concentrated on searching for the materials that have inhibitory activities on tyrosinase. In this work, to isolate phenolic compounds from Gastrodia elata, we purified the extract through solvent fractionation, column chromatography, and recrystallization. They were identified as 4-hydroxybenzyl alcohol 1, bis(4-hydroxyphenyl)methane 2, gastrodin (4-${\beta}$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3 on the base of spectroscopic evidences. In order to investigate their depigmentation effect, inhibitory activity against mushroom tyrosinase and inhibitory activity of melanin synthesis in B16 melanoma cells were evaluated in vitro. We have found that 4-hydroxybenzyl alcohol 1 and gastrodin (4- ${\beta}$-D-glucopyranosyloxybenzyl alcohol) 3 have no tyrosinase inhibitory activity, but inhibit the melanin synthesis in B16 melanoma cells. Tyrosinase inhibitory activities of bis(4-hydroxyphenyl)methane 2 (IC$\_$50/ = 400 $\mu\textrm{g}$/mL) and butanol fraction (IC$\_$50/ = 46 $\mu\textrm{g}$/mL) were lower/higher than that of arbutin (IC$\_$50/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL), but inhibitory activities of melanin synthesis in B16 melanoma cells were much higher than that of arbutin. Especially, tyrosinase inhibitory activities of isolated phenolic fraction (IC$\_$50/ = 2.37 $\mu\textrm{g}$/mL) from butanol fraction was very higher than that of arbutin (IC$\_$50/ = 114 $\mu\textrm{g}$/mL). Therefore, these results suggest that isolated phenolic compounds from Gastrodia elata have inhibitory activity against mushroom tyrosinase and inhibitory activity of melanin synthesis in 816 melanoma cells in vitro.
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문제 정의
또한 미백 메카니즘에 대한 보다 완전한 이해는 유전자 및 분자수준에서 이루어져야 할 것이다. 본 연구에서 규명하지 못했던 페놀성 혼합물의 유효성분에 대한 분리가 현재 진행 중이며 더 나아가 천마 추출물로부터 분리된 유효성분들의 작용 기작을 밝혀내기 위하b 유전자수준에서의 연구가 진행 중에 있으며 그 결과는 다음 논고에 보고하고자 한다.
있었다. 본 연구에서는 멜라닌 생성억제에 대한 천마 추출물의 유효성분들의 효과를 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 밝혀내고자 하였다. 이러한 유효성분들이 세포에서는 강하게 멜라닌 합성을 억제하였지만 in 에서 tyrosinase에 대한 억제효과가 낮은 것으로 나타났으며 이를 통해 유효성분들이 tyrosinase 억제작용에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.
연구는 진행되지 않았다. 본 연구에서는 천마 추출물로부터 유효 성분인 4-hydroxybenzyl alcohol 1, bis (4-hy- droxyphenyDmethane 2, gastrodin (4-β-D-glucopyra-nosyloxybenzyl alcohol) 3을 분리하였고(Figure 1), 이러한 유효성분과 butanol 분획층으로부터 분리된 페놀성 혼합물을 in vivo와 in vitro 실험법을 통해 tyrosinase 억제 효과 및 B16 melanoma cell에서의 멜라닌 생합성 억제 효과에 대해 논의 하였다.
있는 형태의 화합물을 얻을 수 있었다. 이 혼합물이 어떤 종류의 물질인지 알아보기 위한 UV spectrum을 얻었다. 또한, 색 변화로써 알 수 있는 여러 가지 정색 반응을 실시하였다.
제안 방법
멜라닌 생성량과 세포수를 동시에 측정하기 위하여 두 set를 준비하였으며 모든 농도에 따른 well 수는 triplet으로 준비하였다. B16 melanoma 세포(ATCC CRL6323)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium)에 lxl05 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO2, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 a-MSH(0.
B16 melanoma 세포를 이용한 melanogenesis 저해 효과는 Maeda와 Fukuda[14]의 방법을 변형하여 측정하였다. 멜라닌 생성량과 세포수를 동시에 측정하기 위하여 두 set를 준비하였으며 모든 농도에 따른 well 수는 triplet으로 준비하였다.
정제수에 분산시킨 후 n-hexane, ethylacetate, butanol로 연속적으로 분획하였다. Butanol 분획층을 취하여 감압농축하고 silicagel column chromatography (CH2CI2: MeOH = 10: 3)를 실시하고 반복적 인 silicagel column chromatography (CH2CI2: MeOH = 9:1)를 실시하여 4-hydroxybenzyl alcohol 1과 bis(4-hydroxypheny)methane 2 및 gastrodin(4- β -D-Gluco- pyranosyloxybenzyl alcohol) 3을 분리 하였다(Figure 1).
건조된 천마를 95% EtOH에서 7일간 상온숙성 하였고, 여과 후 진공건조 하였다. 정제수에 분산시킨 후 n-hexane, ethylacetate, butanol로 연속적으로 분획하였다.
이 혼합물이 어떤 종류의 물질인지 알아보기 위한 UV spectrum을 얻었다. 또한, 색 변화로써 알 수 있는 여러 가지 정색 반응을 실시하였다. UV spectrum 결과, 280 run에서 최대 흡광을 나타내었고 이것으로 aromatic-ring을 가진 혼합물임을 추정할 수 있었다.
후 진공건조 하였다. 정제수에 분산시킨 후 n-hexane, ethylacetate, butanol로 연속적으로 분획하였다. Butanol 분획층을 취하여 감압농축하고 silicagel column chromatography (CH2CI2: MeOH = 10: 3)를 실시하고 반복적 인 silicagel column chromatography (CH2CI2: MeOH = 9:1)를 실시하여 4-hydroxybenzyl alcohol 1과 bis(4-hydroxypheny)methane 2 및 gastrodin(4- β -D-Gluco- pyranosyloxybenzyl alcohol) 3을 분리 하였다(Figure 1).
천마추출물로부터 분리된 유효성분들이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 mushroom tyrosinase 저해 효과와 melanoma 세포에서의 멜라닌 합성저해 효과를 측정하였다. 유효성분들의 멜라닌 합성저해 효과를 비교할 수 있는 화합물로서는 이미 효과가 알려져 있는 arbutin을 사용하였다.
대상 데이터
나타내었다. UV 흡광도는 Hewlett Packard HP-8453을 사용하여 측정하였다.
그 외의 시약은 모두 특급으로 사용하였으며, 활성실험에 사용된 시약들은 배지 이외의 것들은 Sigma-Aldrich 사의 것을 구입하여 그대로 사용하였으며 배지는 DIFCO의 것을 사용하였다.
천마는 국내산(경동시장에서 구입)을 사용하였고, NMR 용매는 Sigma-Aldrich사의 DMSO-d6, CDCI3, D2O 등을 사용하였으며 내부기준물질로는 TMS를 사용하였다. 그 외의 시약은 모두 특급으로 사용하였으며, 활성실험에 사용된 시약들은 배지 이외의 것들은 Sigma-Aldrich 사의 것을 구입하여 그대로 사용하였으며 배지는 DIFCO의 것을 사용하였다.
이론/모형
Tyrosinase의 저해활성은 일반적으로 분광학적인 방법으로 측정되며 본 실험에서는 Vanni 등의 방법에 따라 측정하였다[13]. 0.
성능/효과
116~117℃)은 methanol과 chloroform에서 재결정하여 백색결정을 얻었다. 4-Hydroxybenzyl alcohol 1 과 bis(4-hydroxyphenyl)methane 2의 IR, 1H- NMR 그리고 13C~NMR spectra는 이미 발표된 data와 비교 분석하였고 일치함을 보였다[17,18].
B16 melanoma 세포에서의 펠라닌 합성 저해 효과에 대한 영향을 조사한 결과 gastrodin 3과 butanol 분획물은 arbutin에 상응하는 저해 효과를 보이며 4-hydro xybenzyl alcohol 과 bis(4-hydroxypheny)methane 2은 arbutin보다 더욱 강한 멜라닌 저해 작용을 나타냈다 (Figure 3). 특히 bis(4-hydroxypheny)methane 2은 100 μg/mLz의 농도에서 세포독성을 보이기는 하나 1 μg/rnl 에서 50 μg/ml까지는 매우 높은 멜라닌 생성 저해 효과를 보여주었다(FiguiB 4).
또한, 색 변화로써 알 수 있는 여러 가지 정색 반응을 실시하였다. UV spectrum 결과, 280 run에서 최대 흡광을 나타내었고 이것으로 aromatic-ring을 가진 혼합물임을 추정할 수 있었다. 또한 가시광선 파장에서도 약간의 흡수를 나타냈는데 이것은 혼합물의 색이 갈색을 띠고 있는 것을 설명해 줄 수 있다(data not shown).
유효성분들의 멜라닌 합성저해 효과를 비교할 수 있는 화합물로서는 이미 효과가 알려져 있는 arbutin을 사용하였다. 먼저 tyrosinase 효소에 의한 tyro-sine의 산화에 대한 영향을 조사한 결과, 천마 butanol 분획 층(50%억제 농도, 즉 IC50 = 46 μg/mL)은 arbutin (IC50 = 114 Mg/mD보다 높은 억제 작용을 나타냄을 알 수 있었다(Table 1). Butanol 분획 층에서 분리된 bis(4-hy- droxyphenyDmethane 2(IC50 = 400 μg/mL) 은 arbutin (IC50 = 114 μg/mL)보다 약 1/4의 tyrosinase 활성 저해작용을 나타내었다.
천마추출물의 유효성분들은 in vitro에서 tyrosinase 활성 저해 효과가 낮았으나(Table 1) B16 melanoma 세포에서는 높은 미백 효과를 보였다(Figure 3). 이 결과들로 미루어 볼 때 이러한 유효성분들은 멜라닌 생성과정에서 직접적인 tyrosinase 활성이 아닌 TRP-1 또는 TRP-2의 작용을 억제함으로써 세포에서의 미백 효과를 보이는 것으로 추정할 수 있다. 또한 tyrosinase의 활성이 아닌 tyrosinase 유전자 발현에 관련된 메카니즘에 대한 가능성도 배제 할 수 없다.
그래서 이 혼합물로 ninhydrin 반응[19]을 실시하였고 nin hydrin 반응에서는 아미노산이 존재할 경우 자색으로 정색 되는데, 시험 결과 색 변화 없이 음성 반응임을 관찰하였다. 이 결과로부터 혼합물은 아미노산이나 단백질이 아님을 확인할 수 있었다. 플라보노이드나 탄닌을 포함한 페놀성 물질은 2.
5% FeCh 용액을 가하면 짙은 녹색, 자주색, 청색 또는 흑색으로 정색되는데, 이 혼합물은 암녹색으로 변화하고 농도가 높을 경우에는 암녹색의 침전물을 형성했다. 이것으로 이 혼합물이 페놀성 물질임을 확인할 수 있었고 triterpenoid나 saponin인 경우는 무수 초산을 가한 다음 황산을 가하면 적갈색을 나타내는데, 이 실험 결과에서는 색 변화가 없어 혼합물이 triterpenoid 나 sapaiin은 아님을 확인할 수 있었다. 이와 같은 것들로부터 페놀성 물질들이 혼합되어 있는 형태의 화합물임을 알 수 있었다.
이러한 결과로부터 천마추출물의 유효성분들이 비록 tyrosinase에 대한 저해 작용은 낮았으나 B16 melanoma 세포에서는 강하게 멜라닌 생성을 억제한다는 사실을 알 수 있었다. 본 연구에서는 멜라닌 생성억제에 대한 천마 추출물의 유효성분들의 효과를 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 밝혀내고자 하였다.
본 연구에서는 멜라닌 생성억제에 대한 천마 추출물의 유효성분들의 효과를 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 밝혀내고자 하였다. 이러한 유효성분들이 세포에서는 강하게 멜라닌 합성을 억제하였지만 in 에서 tyrosinase에 대한 억제효과가 낮은 것으로 나타났으며 이를 통해 유효성분들이 tyrosinase 억제작용에 의한 것이 아님을 알 수 있었다. 멜라닌 합성 과정은 크게 tyrosinase[3] 와 TRPT (tyrosinase-related protein 1 : DHICA oxidase)[6] 그리고 TRP 2 (tyrosinase-related protein 2 : dopachrome tautrmerase)[기에 의해 진행되어진다.
뜨한 tyrosinase에 의해 생성된 dopaquinone0] dopachrome으로 산화되어 eu-melanin't; 생성하는 과정에서 dopachrome을 DHICA (5J6-dihydroxyindole^2-car- boxyHc acid)로 만드는 최초가 TRP-2이며, DHICA는 다시 TRPT에 의해 산화되어 eu-melanin을 생성시킨다. 천마추출물의 유효성분들은 in vitro에서 tyrosinase 활성 저해 효과가 낮았으나(Table 1) B16 melanoma 세포에서는 높은 미백 효과를 보였다(Figure 3). 이 결과들로 미루어 볼 때 이러한 유효성분들은 멜라닌 생성과정에서 직접적인 tyrosinase 활성이 아닌 TRP-1 또는 TRP-2의 작용을 억제함으로써 세포에서의 미백 효과를 보이는 것으로 추정할 수 있다.
후속연구
수 있을 것으로 사료된다. 새로운 미백물질의 개발은 미백 효과의 증가와 동시에 독성에 대한 고려가 동시에 이루어져야 할 것이다. 또한 미백 메카니즘에 대한 보다 완전한 이해는 유전자 및 분자수준에서 이루어져야 할 것이다.
또한 가시광선 파장에서도 약간의 흡수를 나타냈는데 이것은 혼합물의 색이 갈색을 띠고 있는 것을 설명해 줄 수 있다(data not shown). 이 혼합물의 UV spectrum 결과로부터 280 nm에서의 흡광이 tyrosine, trytophan, phenylalanine과 같은 방향족 아미노산에 의한 것인지를 확인해 볼 필요가 있었다. 그래서 이 혼합물로 ninhydrin 반응[19]을 실시하였고 nin hydrin 반응에서는 아미노산이 존재할 경우 자색으로 정색 되는데, 시험 결과 색 변화 없이 음성 반응임을 관찰하였다.
이상의 결과에서 천마추출물의 유효성분들은 색소침착의 방지와 개선에 효과 있는 원료로써 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 새로운 미백물질의 개발은 미백 효과의 증가와 동시에 독성에 대한 고려가 동시에 이루어져야 할 것이다.
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