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문제 정의
- 일반적으로 CGTase는 cyclization activity를 지니므로 전분으로부터 cyclodextrin 생산에 사용되고 있으나, 분자 진화적 기술을 활용하여 전분 노화 억제효소 및 제빵효모 개발에 활용된 바 있다(8-10). 본 연구에서는 선행연구에서 얻어진 CGTase와 이의 mutant를 이용하여 효과적인 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 방법을 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 7 mg/mL 시료를 2,5-dihydroxybenzoic acid(1 mg/mL)가 포함된 acetonitrile 용액과 동일한 비율로 혼합하여 2 μL 가량 stainless still plate에 loading 후 건조시켜 분석을 수행하였다(15).
- CGTase wild-type과 CGTase mutant는 각각 선행연구에서 얻은 유전자(pR2CGTI-5와 pR2CGT3-18)를 이용하여 발현하였다(9). 각각의 유전자는 CaCl2 처리된 E.
- SUGAR KS-804와 KS806 columns(8×300 mm; Shodex, Kawasaki, Japan)을 연결하여 상온에서 분석하였으며 이동상(0.15 M NaNO3, 0.02% NaN3)은 0.4 mL/min의 속도로 이동하였다.
- 각각의 유전자는 CaCl2 처리된 E. coli MC1061 competent cell[F±, araD139, recA13, D(araABCleu) 7696, galU, galK, DlacX74, rpsL, thi, hsdR2, mcrB]에 형질전환 하였다.
- Wild-type의 경우 mutant에 비하여 시료의 평균 분자량 감소가 상대적으로 빠르게 진행되었음을 알 수 있다(Table 2). 따라서 보다 명확한 설명과 반응액의 정확한 분석을 위하여 효소 반응 후 생성된 저분자 물질들에 대하여 MALDI-TOF/MS 분석을 수행하였다. CGTase wild-type과 mutant 효소반응액을 MALDI-TOF/MS 분석한 결과 wild-type에서는 m/z 1158(M+Na+), 1319, 1643 등 다양한 종류의 cyclic 형태의 cyclodextrin 및 cycloamylose들의 이온형에 대응하는 peak들이 검출되었으며, mutant 처리구에서는 linear 한 형태의 maltodextrin이 검출되었다(Fig.
- 발현된 두 효소의 최적온도를 확인하고자 30∼80℃ 범위의 다양한 온도에서 효소들의 가수분해능이 측정되었다.
- 세포 파쇄 후 원심분리기(9,000×g, 20 min, 4℃)를 이용하여 soluble 한 crude enzyme을 얻었고 이를 다시 β-CD column chromatography를 이용하여 정제하였다(11).
- 아밀로펙틴 클러스터 제조를 위한 효소를 생산하기 위하여 선행연구에서 개발된 CGTase wild-type과 mutant 효소를 coding 하는 유전자를 E. coli에 형질전환 후 발현하였다(9). 발현된 단백질을 β-CD column을 사용하여 정제한 결과 고순도의 재조합 효소를 얻었다(Fig.
- 1). 정제된 두 종류의 효소를 DNS 환원당 정량을 통하여 각각의 역가를 확인하였고 단백질 정량을 통하여 각각의 효소의 specific activity와 정제수율을 확인하였다(Table 1). 정제 table에서 보이는 바와 같이 2 L 배양에서 CGTase wild-type의 경우 15.
- 호화된 waxy rice starch에 CGTase wild-type과 mutant 효소를 각각 반응시켜 반응시간 동안 시료의 평균 분자량의 변화를 살펴보았다. 불투명하던 시료는 2분 이후 투명하게 변하는 것을 육안으로 관찰할 수 있었으며 점도도 낮아짐을 확인하였다(data not shown).
대상 데이터
- 선행연구에서 얻은 alkalophilic Bacillus I-5 유래의 CGTase wild-type과 가수분해능이 강화된 mutant 효소를 활용하여 waxy rice starch로부터 아밀로펙틴 클러스터를 제조하였다. SEC-MALLS-RI 분석법으로 CGTase wild-type과 mutant 효소가 처리된 시료의 평균 분자량을 확인한 결과 10분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 104∼105 Da으로 급격히 감소하였음을 확인하였으며, 일정 반응 시간이 경과한 이후에는 더 이상 분자량의 감소가 일어나지 않음으로 미루어 시료가 아밀로펙틴 클러스터 단위로 분해되었으며 그 분자량은 104∼105 Da 정도임을 알 수 있다.
데이터처리
- 불투명하던 시료는 2분 이후 투명하게 변하는 것을 육안으로 관찰할 수 있었으며 점도도 낮아짐을 확인하였다(data not shown). 구체적인 관찰을 위하여 시료를 시간대별로 sampling 하여 100℃에서 5분간 처리하여 효소반응을 정지하였고 각각의 시료를 SEC-MALLSRI 분석법으로 평균 분자량을 확인하였다(Table 2). 효소반응 전 waxy rice starch의 평균 분자량은 약 108 Da이었으나, 5분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 104∼105 Da으로 급격히 감소하였음을 알 수 있었고 5분 이후의 반응에서는 분자량의 감소 진행이 현저히 줄었다(Fig.
- 시료의 분자량 측정을 위하여 MALDI-TOF MS(Voyager TM-DE Perceptive Biosystems, Framingham, MA, USA)를 사용하였고, 분석은 linear mode에서 수행하였다. 7 mg/mL 시료를 2,5-dihydroxybenzoic acid(1 mg/mL)가 포함된 acetonitrile 용액과 동일한 비율로 혼합하여 2 μL 가량 stainless still plate에 loading 후 건조시켜 분석을 수행하였다(15).
이론/모형
- CGTase wild-type과 mutant의 역가 측정을 위하여 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 환원당 정량법을 사용하였다(14). 1% soluble starch를 sodium acetate buffer(50 mM, pH 6.
- 세포 파쇄 후 원심분리기(9,000×g, 20 min, 4℃)를 이용하여 soluble 한 crude enzyme을 얻었고 이를 다시 β-CD column chromatography를 이용하여 정제하였다(11). 단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 측정하였고(12), 정제된 효소는 10%의 sodium-dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 통하여 확인하였다(13).
- 분석시료는 이동상에 녹인 후 autoclave(121℃, 20 min)를 이용하여 호화시켰다. 시료의 평균 분자량은 ASTRA(ver. 4.90.07, Wyatt Technology) 프로그램에서 Berry extrapolation법으로 계산하였고 dn/dc 값은 0.146 mL/g으로 하였다(6,7).
- 아밀로펙틴 클러스터의 제조 방법은 Lee 등(6)의 방법을 따랐다. 200 mL의 5% waxy rice starch를 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.
- 효소적 처리된 아밀로펙틴의 평균 분자량을 측정하기 위하여 MALLS(multiangle laser light scattering, Dawn DSP, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)를 이용하였고, 이때 size-exclusion chromatography(SEC)와 refractive index(RI) detector(Waters 410, Waters Co., Milford, MA, USA)를 활용하였다. SUGAR KS-804와 KS806 columns(8×300 mm; Shodex, Kawasaki, Japan)을 연결하여 상온에서 분석하였으며 이동상(0.
성능/효과
- 따라서 보다 명확한 설명과 반응액의 정확한 분석을 위하여 효소 반응 후 생성된 저분자 물질들에 대하여 MALDI-TOF/MS 분석을 수행하였다. CGTase wild-type과 mutant 효소반응액을 MALDI-TOF/MS 분석한 결과 wild-type에서는 m/z 1158(M+Na+), 1319, 1643 등 다양한 종류의 cyclic 형태의 cyclodextrin 및 cycloamylose들의 이온형에 대응하는 peak들이 검출되었으며, mutant 처리구에서는 linear 한 형태의 maltodextrin이 검출되었다(Fig. 5). 선행연구에서 CGTase mutant는 cyclodextrin(CD)을 생산하는 cyclization activity가 크게 감소하였는데, 이로 인하여 본 실험에서도 cyclic 한 형태의 maltodextrin을 생산하지 않고 환원성 말단을 지닌 linear 형태의 maltooligosaccharide들을 생산한 것으로 생각된다(Fig.
- SEC-MALLS-RI 분석법으로 CGTase wild-type과 mutant 효소가 처리된 시료의 평균 분자량을 확인한 결과 10분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 104∼105 Da으로 급격히 감소하였음을 확인하였으며, 일정 반응 시간이 경과한 이후에는 더 이상 분자량의 감소가 일어나지 않음으로 미루어 시료가 아밀로펙틴 클러스터 단위로 분해되었으며 그 분자량은 104∼105 Da 정도임을 알 수 있다.
- 반면 wild-type은 환원성 말단이 없는 형태의 cyclic form의 maltooligosaccharide들을 주로 생산하여 환원당 정량인 DNS 역가 측정에 검출되지 않아 CGTase wild-type이 전분기질에 대하여 상대적으로 약하게 작용하는 것과 같은 현상을 나타낸다. 그러므로 본 실험에서 CGTase wild-type 효소가 다소 높은 반응속도를 보이는 것처럼 나타났으나, 효소양을 기준으로 CGTase mutant가 wild-type에 비해 15배가량 적은 양을 사용하여 비슷한 수준의 결과를 보였으므로 더욱 경쟁력 있는 것으로 생각된다. 또한 유럽연합 국가들에서는 cyclodextrin이 식품의 첨가물로 인정되지 않으므로(9) CGTase mutant를 사용하는 것이 바람직하다.
- SEC-MALLS-RI 분석법으로 CGTase wild-type과 mutant 효소가 처리된 시료의 평균 분자량을 확인한 결과 10분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 104∼105 Da으로 급격히 감소하였음을 확인하였으며, 일정 반응 시간이 경과한 이후에는 더 이상 분자량의 감소가 일어나지 않음으로 미루어 시료가 아밀로펙틴 클러스터 단위로 분해되었으며 그 분자량은 104∼105 Da 정도임을 알 수 있다. 또한 MALDI-TOF/MS 분석을 통하여 CGTase wild-type은 다양한 종류의 cyclic 형태의 maltodextrin을 생성하고 있으며 mutant 효소는 주로 소량의 maltooligosaccharide들을 생산함을 확인하였다.
- 재료 및 방법에서 언급한 바와 같이 DNS법을 사용한 가수분해 역가 기준으로 동일한 unit의 효소를 사용하였음에도 불구하고 CGTase wild-type과 mutant 효소의 waxy rice starch에 대한 반응 양상에는 차이가 있었다. Wild-type의 경우 mutant에 비하여 시료의 평균 분자량 감소가 상대적으로 빠르게 진행되었음을 알 수 있다(Table 2).
- 효소반응 전 waxy rice starch의 평균 분자량은 약 108 Da이었으나, 5분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 104∼105 Da으로 급격히 감소하였음을 알 수 있었고 5분 이후의 반응에서는 분자량의 감소 진행이 현저히 줄었다(Fig. 3).
- 흥미롭게도 급격한 분자량의 감소에도 불구하고 DNS법을 이용한 시료의 환원성 말단의 생성량도 낮았으며(100 μmol 미만) MALLS graph 상에서도 거대분자의 peak 이동은 확인되었으나 소당류의 증가는 미미하였다(Fig. 4).
후속연구
- 기존연구에서는 아밀로펙틴 클러스터 생산을 위하여 4-α-GTase를 사용하였으며, 이때 사용되는 효소의 양은 일반 CGTase의 10배 이상이며 반응시간도 1시간 이상이 소요된다(6,7). 본 연구에서는 분자량별로 다양한 식품 소재가 될 수 있는 아밀로펙틴 클러스터의 효율적인 생산법을 제시하였고 이 결과들은 식품 및 전분 소재 산업에서 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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