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문제 정의
- 이에 효소의 양에 따른 재구성 지질의 합성율을 살펴보았다. Fig.
가설 설정
- 2)Means with the same letter is not significantly different at 0.05 level.
- Other reaction conditions are in material and methods. 2)ND, not detectable. 3 Values are the means of two determinations with standard deviations.
제안 방법
- 지 방산 조성 분석은 flame-ionization detector(FID 자동주입기 가 장착된 Hewlett-Packard 6890 series gas chromatography ( Anondale, PA, USA)에 시료 1 "L를 주입하여 이루어졌다. 분석에 사용된 칼럼과 온도프로그램은 전보와 동일한 분석조건에서 실행하였다(11).
- 조성을 Table 1에 나타내었다. Chirazyme® L-2 lipase 는 반응조건에 따라 non-specific 혹은 sn-1, 3 specific 반응 특이성을 보이는 것으로 보고되고 있어(15), 본 실험에서 합성 된 재 구성 지 질의 각 위치 별 (sn-1, 3과 sn-2, TAG) 지 방산 조성 으로 Chirazyme® L-2 lipase의 반응특이 성 을 알아보았다. 먼저, 재구성지질의 TAG에서 capric acid의 조성은 4.
- Differential scanning calorimetry (TA Instruments, Model DSC 2010, New Castle, USA)를 이용하여 유지 의 결정화 온도(crystallization point)를 측정하였다. 분석 시 calibration 을 위한 baselinee 빈 cell에서 분석하였고, 각 분석 시료의 양은 5±0.
- 에서 24시 간 동안 반달 모양의의 길이와 폭이 각각 6 cm와 2 cm인 impeller를 사용하여 재구성지 질 (SL-soybean oil)을 합성하였다. Impellere- stirrer motor(Mtops MS-3060D, Korea)에 의하여 420 rpm을 유지하였으며, tank 의 높이와 내경은 각각 11 cm, 15 cm로 항온수조의 순환되는 물에 의하여 55℃로 유지하였다. 24시간 반응 후 여과를 통하여 lipase가 제거된 반응물은 0.
- 50 UL의 시료와 tributyrin 30 liL(internal standard)를 10 mL acetone에 녹여 10 11L 주입하였다. Partition number(PN)의 측정은 tributyrin, tricaprylin, trilaurin, trimyristin, tripalmitin, triolein, trilinolein을 사용하여 외 부표 준 곡선을 작성 한 후, TAG peak의 retention time(RT)과 PN 간의 관계식을 얻어 계산하였다(12).
- 대두유(2 g), capric acid(0.790 g)와 CLA( 1.284 g)를 1: 2: 2 몰 비율로 혼합하여 Chirazyme® L-2 lipase와 함께 screw-capped 25 mL vial에 취한 후, 마그네틱 바와 stirring plate(Coming, NY, USA)를 이용하여 500 rpm을 유지한 상태에서 24시간동안 반응하여 Chirazyme® L-2 lipase의 양에 따른 합성율을 살펴보았다. 이때 Chirazyme® L-2 lipase의 양은 총 기질 무게의 2%와 4%, 6%, 8%, 10%로 하여 반응하였고 각 반응은 항온수조를 이용하여 55℃를 유지하였다, 24 시 간반응 후, 반응물을 PTFE syringe filter(25 mm, 0.
- 분석에 사용된 칼럼과 온도프로그램은 전보와 동일한 분석조건에서 실행하였다(11). 이송기 체는 Nz이었고 split ratio는 50 : 1로 설정 하였으며, FAME는 internal standard를 이용하여 retention time(RT)을 비교함으로써 정량하였다
- 시료(60 mg)를 10 mL hexane에 녹여 10 μL 주입하여 얻은 크로마토그램의 peak를 활용하여 tocopherol을 정 량하였다. 색도 분석 은 Hunter 체계 에 근거 한색 차계 (Color Techno System Corp, Tokyo, Japan)에 의해 시료의 L*(0/100, lightness/darkness), a*(+A, redness/ greenness) 및 b*(+/-, yellowness/blueness) 값을 3회 반복 측정하여 평균값을 구함으로써 측정하였다.
- 제시된 방법으로 측정하였다(9). 유지의 r-, 8-tocopherol 분석은 검출기가 장착되어 있는 normal-phase high performance liquid chromatography(NP-HPLC)에 의하여 이루어졌다 각 tocopherol 함량은 任 ~, 7 8-tocopherol 표준 물질로 얻은 외부표준 곡선을 작성하여 정량하였다. HP-LC는 Yonglin SP930D dual pump와 Yonglin UV380 검 출기 (Anyang, Korea)가 장착되 었고 홉광도는 295 nm에서 측정하였 다.
- 유지의 물성 중 crystallization point는 유지를 식 품에 응용하는데 있어 중요하므로 재구성 지질의 crystallization point 를 측정하였다. 대 두유의 crystallizatione 비교적 넓은 온도 범위에서 일어났고 -57.
- 284 g)를 1: 2: 2 몰 비율로 혼합하여 Chirazyme® L-2 lipase와 함께 screw-capped 25 mL vial에 취한 후, 마그네틱 바와 stirring plate(Coming, NY, USA)를 이용하여 500 rpm을 유지한 상태에서 24시간동안 반응하여 Chirazyme® L-2 lipase의 양에 따른 합성율을 살펴보았다. 이때 Chirazyme® L-2 lipase의 양은 총 기질 무게의 2%와 4%, 6%, 8%, 10%로 하여 반응하였고 각 반응은 항온수조를 이용하여 55℃를 유지하였다, 24 시 간반응 후, 반응물을 PTFE syringe filter(25 mm, 0.2 pm, Whatman, US A) 로 lipase를 제거하여 hexane : diethyl ether : acetic acid(50:50: 1, v/v/v)를 전개 용매로 한 thin layer chromatography(silica gel 60 F254, 20 x 20 cm, Merck KGaA, Germany)분석 한 결과, UV254 lamp로 확인된 TAG band는 methylation하여 가스크로마토그래피 (GC) 로 분석하였다.
- 이후 냉각한 다음 n-hexane (HPLC grade) 2 mL를 첨가한 후 vortex중卜여 상층(hexane 층)만 취 궁H 서 anhydrous sodium sulfate column으로 수분을 제거 하고 얻은 fatty acid methyl ester(FAME)를 1 mL vial에 옮겨 GC 분석하였다. 이때 분석된 sa2 position의 mol% 를 활용하여 Xu 등(1。)이 제시한 식을 활용하여 sn-1, 3 posi-Eion의 지방산 조성을 구하였다.
- 분석에 사용된 칼럼과 온도프로그램은 전보와 동일한 분석조건에서 실행하였다(11). 이송기 체는 Nz이었고 split ratio는 50 : 1로 설정 하였으며, FAME는 internal standard를 이용하여 retention time(RT)을 비교함으로써 정량하였다
- 4 mol%의 결합량을 보였다. 이에 scale-up 실험에서는 비교적 고가인 고정화 효소의 경제적 인이 용을 위해 Chirazyme® L-2 lipase의 양을 총 기 질 무게의 4%로 반응하여 , 24시 간 동안 1 : 2 : 2의 몰 비율에서 약 10% 미만의 CLA와 capric acid의 결합량을 기대할 수 있도록 하였다.
- 한편, MCFA는 장쇄 지 방산(long chain fatty acid; LCFA) 에비 해 물에 대한 용해도가 상대적으로 높아서 chylomicroiT을 형성 하지 않고 간문맥(portal vein)을 통해 혈관으로 이송, 간에서 산화되어 빠른 에너지원으로써 이용이 가능하다고 알려져 있다(7, 8). 이에 고정화 효소를 이용하여 1 L 용량의 stirred-batch type reactor에서 재구성지 질을 합성한 후 이화학적 특성을 살펴보았다.
대상 데이터
- 대두유(300 g), capric acid(119 g)와 CLA(193 g)를 1 : 2 - 2의 몰 비율로 용매는 사용하지 않고 ChiTazym* L-2 lipase 24.5 g(4% by w/w of total substra心)을 1 L용량의 stirredbatch type reactor.에서 24시 간 동안 반달 모양의의 길이와 폭이 각각 6 cm와 2 cm인 impeller를 사용하여 재구성지 질 (SL-soybean oil)을 합성하였다.
- Louis, MO)로부터 구입하였다. 대두유는 대형 할인점(E사, 대전, 유성^서 구입하였고 반응 촉매로는 Candida antarctica6^^-| 유래된 Chirazyme①L-2 lipase(immobilized lipase B, Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, IN, US A) 를 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 conjugated linoleic acid(CLA) 이성체 (70 CLA™, Livemax Co., Sungnam, Korea)는 ds~9, trans-11 (CLA I ) 33.0%, trans-10, czs-12(CLAn)32.5%, cis-9, cis-Hi transell, trans-13(CLAIH) 1.7%, trans-8, transit, trans-9, trans-ll'f trans-10, frczns-12(CLAIV) 1.7%로구성되 었고 홍화유로부터 합성되었다. Capric acid와 지방산 조성 을 분석하기 위한 pancreatic lipase(Type U, crude)는 Sigma Chemical Co.
- 효소적 에스테르화 반옹에 의한 재구성 지질의 합성은 효소의 반응 위치 특이성에 의하여 기능성 지방산을 TAG의 특정 위치에 결합(incormoration)할 수 있으며 (2), 특히 고정화된 효소(immobilized lipase)는 재사용이 가능하여 경제적으로 산업적 이용이 가능하다(1, 3). 본 실험에서는 낙농 및 축산(반추동물) 관련식품 등에 존재한다고 알려진 conjugate linoleic acid(CLA)와 중쇄 지 방산(medium chain fatty acid; MCFA)의 하나인 capric acid(C10:0)를 기능성 지질소재로 이용하여 재구성 지질을 합성하였다. CLA는 체중감소와 암세포 증식 억 제 효과 등의 생리활성올 지닌다고 알려져 있다(4-6).
데이터처리
- 실험 별 결과는 2000 Statistical Analysis System S/W Package(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 95% 신뢰구간에서 Duncan's multiple range test(DMRT)로 각 군별 유의성을 검증하였다(13).
이론/모형
- 대두유와 재구성 지질의 산가, 요오드가, 비누화가는 AOCS에 제시된 방법으로 측정하였다(9). 유지의 r-, 8-tocopherol 분석은 검출기가 장착되어 있는 normal-phase high performance liquid chromatography(NP-HPLC)에 의하여 이루어졌다 각 tocopherol 함량은 任 ~, 7 8-tocopherol 표준 물질로 얻은 외부표준 곡선을 작성하여 정량하였다.
- 1은 기질 (soybean oil: capric acid: CLA)들의 몰비 율을 1 : 2 : 2로 하여 25 mL vial에서 24시간 반응하였을 때 Chirazyme® L-2 lipase의 양에 따른 결 합(incorporation) 율을 보여준다. 사용된 몰비 율과 반응 시 간은 선행 실험 과 Lee 와 Akoh(14)에 의하여 보고된 결과에 준하여 선정하였다. Capric acid의 결합량의 경우, lipase의 양이 총 기 질무게의 4%와 6%일 때 각각 3.
성능/효과
- 05). Reversed-phase HPLC 분석 결과, 재구성지질에서 capric acid를 함유하고 있는 TAG 형태의 partition number (PN)는 25~37로 약 12.57 area%이 었음을 확인하였다. 대두유의 주된 crystallization peak는 -57.
- 재구성 지질과 대두유의 요오드가는 각각 126와 114이 었고, 비누화가 는 각각 190과 194로 측정 됨으로써, 재구성지질의 TAG에서 capric acid의 함유를 확인할 수 있었다. 대두유와 재구성 지질의 tocopherol 함량은 각각 74.6 mg/100 g과 18.2 mg/100 g으로, 재구성 지질의 tocopherol 함량은 대두유보다 약 76% 감소하였다. 색도 분석 결과, 재구성 지질과 대두유간에 백색도 L*)와 적색 도(a*)에서는 유의적 차이가 없었으나(p<0.
- 대두유와 재구성 지질의 Hunter 체계에 근거한 색도 분석은 Table 3에 나타내었다. 대두유와 재구성지질의 L*(백색도, lightness/ darkness)값은 각각 94.75와 92.88의 밝기 를 보였으며 a*(적색도, redness/greenness)값은 각각 1.95와 1.98로 서로 간에 유의적 차이가 없었다(p<0.05). 반면에 b*(황색도, yeUowness/ bilueness)값은 재구성지질은 21.
- 대두유와 재구성지질의 산가(acid valued 모두 0.5 이하로 측정되 었고, 불포화 정도를 설명 하는 요오드가는 각각 126 과 114이었다(Table 2). 재구성지질의 경우 포화 지방산인 capric acid가 4.
- Chirazyme® L-2 lipase 는 반응조건에 따라 non-specific 혹은 sn-1, 3 specific 반응 특이성을 보이는 것으로 보고되고 있어(15), 본 실험에서 합성 된 재 구성 지 질의 각 위치 별 (sn-1, 3과 sn-2, TAG) 지 방산 조성 으로 Chirazyme® L-2 lipase의 반응특이 성 을 알아보았다. 먼저, 재구성지질의 TAG에서 capric acid의 조성은 4.9 mol%이 였고, CLA의 함량은 4.1 mol%를 나타내었으며, 기농성 지방산들이 비슷한 비율로 대두유에 함유되어 시험관에서 반응하였을 때보다 CLA가 약 2배 증가된 결과를 보였다. 이는 반응방법 및 조건의 차이 에서 기 인된 것으로 사료된다.
- 1 mg/100 g으로 가장 높은 수치를 나타내어 기존에 보고된 것과 같은 결과를 얻었다 (17). 반면, 재구성지 질의 총 tocopherol 함량은 18.2 mg/100 g으로 대두유보다 약 76% 줄어든 결과를 얻었다. 대두유와 재구성 지질의 Hunter 체계에 근거한 색도 분석은 Table 3에 나타내었다.
- 2는 탈산 공정을 거쳐 자유 지방산이 제거된 TAG 형태의 재구성지질을 reversed-phase(RP) HPLC로 분리한 결과이다. 반응하지 않은 TAG, 즉 대두유의 PN값은 39~57 사이에 존재하였으며, 반면에 capric acid를 함유하고 있는 재구성 지질(TAG 형태)은 PN25~37의 값 사이에 존재하며 전제의 약 12.6 area%를 차지하였다(Fig. 2).
- 2 mg/100 g으로, 재구성 지질의 tocopherol 함량은 대두유보다 약 76% 감소하였다. 색도 분석 결과, 재구성 지질과 대두유간에 백색도 L*)와 적색 도(a*)에서는 유의적 차이가 없었으나(p<0.05), 황색 도(b*)에서 재구성지질이 대두유보다 좀더 yellowness를 보이며 유의적 차이를 보였다 (p<0.05). Reversed-phase HPLC 분석 결과, 재구성지질에서 capric acid를 함유하고 있는 TAG 형태의 partition number (PN)는 25~37로 약 12.
- 기능성 지방산인 capric acid와 CLA는 주로 TAG의 sn-1, 3 position에 분포하였고, sn-2 position에는 linoleic acid가 대부분을 차지하였다. 재구성 지질과 대두유의 요오드가는 각각 126와 114이 었고, 비누화가 는 각각 190과 194로 측정 됨으로써, 재구성지질의 TAG에서 capric acid의 함유를 확인할 수 있었다. 대두유와 재구성 지질의 tocopherol 함량은 각각 74.
- 9 mol%를 나타내어 sn-2 position에는 필수 지방산인 linoleic acid가 주로 분포하고 기능성 지방산인 capric acid와 CLA는 주로 sn-1, 3 position에 분포하였다. 즉, 이 실험에서 Chirazyme® L-2 lipase 는 기질들과 snT, 3 selective하게 반응 특이성을 보였다. 재구성 지질의 sn-2 position 지방산 조성 에서도 일부 capric hcid와 CLA가 분석 되 었는데 이는 반응 도중 수분함량, 반응시간, 반응온도, 반응 system의 요인에 의해 일어나는 acyl migration에 의한 것으로 여겨진다(16).
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