[논문]지구자의 Glutathione S-transferase 활성과 알코올 분해효과

차배천; 이은희; 이은; 박행호

지구자의 Glutathione S-transferase 활성과 알코올 분해효과
Activity of Glutathione S-transferase and Effect of Alcohol Decomposition on the Fruit of Hovenia dulcis Thunb 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.48 no.3, 2004년, pp.213 - 217

차배천 (상지대학교 생명자원과학대학 생명산업학과) , 이은희 (상지대학교 생명자원과학대학 생명산업학과) , 이은 (상지대학교 생명자원과학대학 생명산업학과) , 박행호 ((주)한얼식품)

Abstract ▼ AI-Helper

For the determination of glutathione S-transferase activity, a new method was established by using HPLC system. Moreover, amount of enzyme for a optimum reaction was determined by a comparative study with a variety concentration of enzyme. Using a established method, activity of glutathione S-transferase that is alcohol metabolizing enzyme was investigated on the fruit of Hovenia dulcis Thunb. As the result of experiment, EtOH and $H_2O$ extracts of the fruit of Hovenia dulcis Thunb showed visible a synergistic effect of glutathione S-transferase activity. On a continuous experiment, EtOH and $H_2O$ extracts of the fruit of Hovenia dulcis Thunb showed alcohol decomposition activity on the in vivo test using rat. These results suggest that the fruit of Hovenia dulcis Thunb may be useful in the prevention of hangover.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 알코올을 섭취한 후 간에서 알코올의 해독 및 분해를 촉진시키는 물질에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으나, 아직까지 알코올의 분해속도를 촉진시키는 약제는 발견되지 않고 있다. 따라서 본 연구는 기존에 연구 개발되어 진 숙취해소제보다 보다 우수한 효과를 나타내는 알코올 해독 및 알코올 분해 작용을 나타내는 물질을 생약재로부터 탐색하기 위한 연구의 일환으로 현재 알코올 해독 및 알코올 분해 효과가 있는 것으로 알려진 지구자나무(Ho*, 滋 dulcis Thunb)의 다양한 부위 중 가장 효과가 좋은 것으로 알려진 열매 부위인 지구자에 대하여 간에서 약물의 해독에 관여하고 있는 glutathione S-transferase(GST)10)의 활성을 HPLC로 분석하는 새로운 활성 분석법에 의해 지구자의 알코올 해독 효과를 검토하고 동시에 흰쥐를 사용한 in vivo 실험을 통해서 알코올 분해능을 검토하였다.
미약하다. 본 연구는 HPLC를 사용한 새로운 GST 활성 검색 측정법을 개발하여 이를 이용한 지구자 엑스의 GST 활성 상승효과를 확인하고, in vivo 실험에서 혈중 알코올 분해 효과를 입증하였다.
천연자원으로부터 음주 후 발생하는 숙취를 해소하기 위한 기능성 물질 개발 연구의 일환으로 민간에서 숙취 해소 효과가 있는 것으로 알려진 지구자에 대하여 숙취 해소 효과의 작용 기전으로 생각되어지는 간 해독에 관여하는 GST 활성효과와 흰쥐를 사용한 in 勿初에서의 혈중 알코올 분해 작용에 대하여 검토한 결과 다음과 같은 지견을 얻었다.

제안 방법

GST 활성은 환원형 GSH를 포합물질로 하고 CDNB을 기질로 하는 포합 반응을 기초로 하여 실시하였다.u)GST 활성 상승의 기준이 되는 GSH와 기질인 CDNB2] 포합체인 dinitrophenylglutathione(DNP-SG)을 확인하기 위하여 다음과 같이 반응시킨 후 반응물에 대하여 HPLC 분석을 검토하였다.
HPLC 분석은 Zang & Won#의 CDNB 분석 조건을 기초로하여 역상 HPLC용 columm(Nova-pak C₁₈ : 4.6 mm X150 mm, 5 呻)을 사용하였고, 이동상은 H₂₀ : MeOH 및 0.01 M NaH₂PO₄ : MeOH을 5 : 5에서 7 : 3 비율과 까지 변화 또는 gradient를 사용하여 최적의 용매 조건을 검토하였다. 주입용량은 20 岬 하고, 용매 이동 속도는 0.
하는 포합 반응을 기초로 하여 실시하였다.u)GST 활성 상승의 기준이 되는 GSH와 기질인 CDNB2] 포합체인 dinitrophenylglutathione(DNP-SG)을 확인하기 위하여 다음과 같이 반응시킨 후 반응물에 대하여 HPLC 분석을 검토하였다. 5mZ의 반응용 용기에 200mM potassium phosphate 500pZ와 GST 용액 10p/ 넣고 대조군에는 증류수 290W와 glutathione용액 100 B를 가한다.
그러나, 이전의 본 연구실의 연구24)에서 GST 효소 활성 생약을 탐색하는 과정에서 생약 자체가 340nm에서 흡광도를 나타내는 생약이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 따라서 340nm에서 생약이나 다른 시약의 방해 없이 포합체만의 변화를 정확히 측정할 수 있는 새로운 GST 활성 측정법이 필요하였고, 연구 결과 포합체 피크만을 정확히 분리하여 이의 면적 변화로 활성을 측정하는 HPLC법을 다음과 같이 새롭게 확립하였다.
8 m〃min으로 하였으며, 검출은 UV 340nm에서 실시하였다. 또한 내부표준물질은 CDNB와 DNP-SG와 겹치지 않는 화합물을 검토하였다.
상기 실험에서 확립된 HPLC 분석법과 GST 효소 반응을 이용하여 GST 활성 증가 반응을 명확히 파악할 수 있는 최적 반응을 확립하기 위하여 효소를 2.5pgg(0.25 unit)에서 25卩以 m/(2.5 unit)까지 양을 변화시켜 활성 증가 반응을 검토하여 효소의 최적 농도를 확정하였다.
적응시켜 실험에 사용하였다. 실험 1&시간 전에 절식시킨 후 대조군은 50% 알코올 5m//kg를, 실험군은 50% 알코올 5 m//kg와 지구자의 H₂O 또는 EtOH 엑스 100 및 200 mg을 죤대에 의해 경구 투여한 후 매 1, 2 및 4시간째에 심장 천자법에 의해 각 개체당 1.5 m/ 정도의 채혈하여 kit에 의해 혈액을 분석하였다. 실험결과는 mean土S.
반면 실험군은 증류수 289 B와 glutathione용액 100J1Z와 시료 1B를 가한다. 이들 대조군과 실험군을 25°c 에서 2분간 preincubation 시킨 후, 각각의 용기에 l-chloro-2, 4-dinitrobezene 100p/를 가한 후 25°C에서 1분간 반응 시킨 후 20% TCA 100B를 가하여 효소반응을 종결 시킨 후 원심분리하고 상등액을 HPLC로 분석하였다.
01 M NaH₂PO₄ : MeOH을 5 : 5에서 7 : 3 비율과 까지 변화 또는 gradient를 사용하여 최적의 용매 조건을 검토하였다. 주입용량은 20 岬 하고, 용매 이동 속도는 0.8 m〃min으로 하였으며, 검출은 UV 340nm에서 실시하였다. 또한 내부표준물질은 CDNB와 DNP-SG와 겹치지 않는 화합물을 검토하였다.
지구자 H₂₀ 엑스와 EtOH 엑스를 DMSO 1 m/에 녹인 후 최종농도가 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5mg/i血가 되도록 시료를 가한 후 GST 반응 및 HPLC 분석에 의해 지구자 엑스의 GST 활성 상승 효과를 실시하였다. 활성치는 대조군의 DNP-SG 피크의 면적을 내부 표준물질의 피크 면적 대비율을 0으로 하고, 실험군의 DNP-SG 피크의 면적을 내부 표준물질의 피크 면적 대비율 수치를 대조군 수치와 비율로 계산하여 GST 활성을 50% 상승하는 농도를 내삽에 의해 구하고, 이를 EC₅₀ 값으로 하였다.
확립된 HPLC 분석법과 효소 반응을 이용하여 CDNB와 GSH와의 포합 반응을 활성화시켜 포합체 DNP-SG의 생성을 촉진하는 GST 효소의 활성 증가 여부를 명확히 파악할 수 있는 최적반응을 확립하기 위하여 효소의 량을 변화시킨 효소반응을 검토한 결과 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 효소 활성 효과를 가장 명확히 파악할 수 있는 효소의 최적 농도는 5 ng/m/(0.5 unit)로 확정하였다.
5, 1, 2, 3, 4, 5mg/i血가 되도록 시료를 가한 후 GST 반응 및 HPLC 분석에 의해 지구자 엑스의 GST 활성 상승 효과를 실시하였다. 활성치는 대조군의 DNP-SG 피크의 면적을 내부 표준물질의 피크 면적 대비율을 0으로 하고, 실험군의 DNP-SG 피크의 면적을 내부 표준물질의 피크 면적 대비율 수치를 대조군 수치와 비율로 계산하여 GST 활성을 50% 상승하는 농도를 내삽에 의해 구하고, 이를 EC₅₀ 값으로 하였다.

대상 데이터

기타시약은 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였고, HPLC용 용매는 Burdick & Jackson사의 HPLC용 용매를 사용하고 추출 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다. HPLC는 Varina ProStar polaris 200 LC를 사용하였고, pump는 ProStar 210, autosampler는 ProStar 400, Detector는 ProStar 320 UV-VIS 검출기를 사용하였다.
기타시약은 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였고, HPLC용 용매는 Burdick & Jackson사의 HPLC용 용매를 사용하고 추출 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다. HPLC는 Varina ProStar polaris 200 LC를 사용하였고, pump는 ProStar 210, autosampler는 ProStar 400, Detector는 ProStar 320 UV-VIS 검출기를 사용하였다.
본 실험에 사용한 지구자는 강원도 원주시 소재 (주)한얼 식품에서 제공한 지구자나무의 열매 부위만 채취한 후 음건하고 세절하여 사용하였다. 이 식물들의 표본은 상지대학교 생명 산업학과 응용천연물표본실에 보관중이다.
실험동물은 체중 160~180g 내외의 건강한 Sprague-Dawley종의 수컷 흰쥐를 시중에서 구입한 동물사료(삼양유지사제품)로 1주일간 적응시켜 실험에 사용하였다. 실험 1&시간 전에 절식시킨 후 대조군은 50% 알코올 5m//kg를, 실험군은 50% 알코올 5 m//kg와 지구자의 H₂O 또는 EtOH 엑스 100 및 200 mg을 죤대에 의해 경구 투여한 후 매 1, 2 및 4시간째에 심장 천자법에 의해 각 개체당 1.
효소 반응을 위한 GST, l-chloro-2, 4-dinitrobenzene(CDNB), 완충용액용 시약 및 환원형 glutathione(GSH)와 혈중 알코올 농도 분석을 위한 EtOH kit는 Sigma사 제품을 사용하였다. 기타시약은 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였고, HPLC용 용매는 Burdick & Jackson사의 HPLC용 용매를 사용하고 추출 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다.

데이터처리

5 m/ 정도의 채혈하여 kit에 의해 혈액을 분석하였다. 실험결과는 mean土S.D으로 표시하였으며 유의성 검정은 Duncan의 다중검증에 의하여 계산하였다.

성능/효과

1. GST의 활성 증가에 따른 해독 효과를 확인하기 위하여 기존에 널리 알려진 UV 측정법 대신에 시료나 시약의 간섭없이 GST 활성을 측정할 수 있는 HPLC 분석법을 새롭게 확립하였고, 동시에 GST 활성 실험에 적합한 GST 농도를 결정하였다.
2. 지구자에 대한 GST 활성 실험 결과 지구자의 H₂₀ 및 EtOH 엑스가 GST를 활성화하였고, 이는 지구자가 알코올 해독 효과를 가지고 있음을 시사하고 있다.
3. 지구자에 대한 in vivo 실험에서도 지구자의 H₂₀ 및 EtOH 엑스가 혈중의 알코올 농도를 낮추는 효과가 있으므로 지구자가 알코올 분해 효과가 있음이 판명되었다.
또한 내부표준물질은 CDNB와 포합체인 DNP-SG가이 겹치지 않는 화합물을 검토한 결과 p-nitrophenol。] 가장 적합흐V였다. 그 결과 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 내부표준물질 피크는 retention time이 4.0 min, 포합체 DNP-SG는 피크는 2.4 min 에서, 기질인 CDNB의 피크는 10.0 min에서 확인할 수 있었다.
즉 CDNB를 기질로 하는 GSH와의 포합 반응을 기초로 하여 GST를 이용하여 효소 반응을 시킨 후 생성된 포합체 DNP-SG 에 대하여 HPLC 분석법을 검토한 결과 CDNB와 DNP-SG의 분석을 위한 이동상은 0.01 M NaH₂PO₄ : MeOH의 비율을 0~2분까지 6 : 4, 2~3분까지 7 :3, 3〜20분까지는 3 : 7의 gradient가 최적의 용매 조건을 보였다. 또한 내부표준물질은 CDNB와 포합체인 DNP-SG가이 겹치지 않는 화합물을 검토한 결과 p-nitrophenol。] 가장 적합흐V였다.
지구자 H₂₀ 엑스와 EtOH 엑스에 대하여 시료의 최종농도가 0~5mg/m/ 범위의 7개 농도에서 GST 반응 및 HPLC 분석에 의해 지구자 엑스의 GST 활성 상승 ECm를 구한 결과, Table I 에 나타낸 것과 같이 비교물질인 silymarin의 2.3 mg/m/ 보다는 약하나 지구자의 EtOH 엑스가 H₂₀ 엑스보다는 GST 활성이 우수한 보문'°)과 동일하게 지구자의 H₂O 엑스는 3.3 mg/mZ에서, EtOH 엑스 2.9 m她에서 EC^를 보임으로서 지구자는 GST의 활성을 증가시키는 효과가 있음이 입증되었다. 이는 GST가 다 소 hydrophilic한 nucleophile^ 탄소 원자를 가진 물질간의 포합반응을 매개시켜 해독작용을 나타낸다는 기전25)에 의거할 때 지구자의 HQ과 EtOH 엑스가 이 GST의 포합 반응을 활성화시킴을 시사하고 있다.
흰쥐를 사용하여 50% 알코올에 지구자 엑스를 혼합하여 경구투여한 후 채혈하여 kit에 의해 혈액을 분석한 결과 Table II에 나타낸 것과 같이 지구자의 H₂₀ 엑스와 EtOH 엑스는 유의성은 인정되지 않았으나 혈중의 알코올 농도를 감소시킴에 의해 지구자 엑스는 혈중 알코올을 분해시키는 효과가 있음이 확인되었다. 이는 최근에 헛개나무 과병의 물과 메탄올 엑스가 혈중 알콜 농도를 저하시키는 실험결과26)와 유사한 경향을 보였다.

후속연구

이상의 실험결과 본 연구의 재료로 사용한 지구자는 숙취해소에 작용하는 기전의 하나인 GST 활성 및 알코올 분해 효과를 가짐으로서 숙취해소용 기능성 물질로 개발 및 활용이 가능하리라 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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