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문제 정의
- 'F 또한 식품 산업에서는 보다 위생적인 식품의 보존과 유통을 위하여 각종 천연물의 항균 성분을 사용하여 식품의 변질을 방지하기 위한 연구가 진행되고 있다."" 본 연구에서도 이러한 목적의 연장선상에서 천연물을 이용하여 각종 식중독 세균의 증식을 억제시키고, 천연 보존료의 개발을 위한 기초자료를 얻고자 백두옹을 선택하였다.
- 본 연구에서는 식중독 유발세균에 대한 항균활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 예로부터 민간과 한방에서 널리 이용되어 온 백두옹을 각종 유기용매로 추출하여 식중독 유발세균에 대한 항균활성을 조사해 보았다. 백두옹을 methanol로 추출한 후, petroleum ether, chloro form, ethly acetate를 이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통 분획하고, 열수추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발세균 (.
- '" 최군 도시개발과 공업화 등에 의해 야산들이 파괴되므로 우리의 특산 식물인 할미꽃도 차츰 자취를 감추고 있으나 할미꽃과 같은 우리의 우수한 식물들에 대한 효능 및 약리 작용에 관한 더많은 연구가 필요하다. 본 연구에서는 이와 같은 백두옹을 petroleum ether, chloroform, ethly acetate, methanol 및 수용성 분획물로 추출하여 식중독을 유발하거나 식품 부패를 일으키는 각종 세균들에 대한 항균 활성을 조사해 보고자 하였다.
제안 방법
- 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 백두옹의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm 및 1, 000 ppm으로 희석하여 20 씩 천천히 흡수시켰다. Control로 백두옹 추출물이 들어 있지 않은 70% etha- nol을 실험군과 동일한 방법으로 점적 하였다. 준비된 모든 plate는 37 ℃ 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm) 의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- Paper disc 방법으로 백두옹의 각종 유기용매 분획물 및 열수추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활성을 실험해 본 바 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성 균에 대한 백두옹의 petroleum ether, chlo roform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수 추출물의 항균 활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 백두옹의 각종 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 크게 나타났다.
- 건조시킨 백두옹 500 g에 대해 백두옹 중량의 2배 분량인 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 을 사용하여 항균성 물질을 추출하였다. 추출관에 마쇄시킨 백두옹을 넣고 1 1의 methanol을 넣은 후 실온에서 6시간 방치한 후, Whatman No.
- Japan) 를 사용하여 45 ℃ 에서 감압 . 농축하였으며 농축한 methanol 추출물은 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및 methanol 을 각각 사용하여 용매 계통 분획 하였다. 이 때 methanol 추출물과 각종 유기용매를 분별깔대기에 넣고 5분간 수작업으로 흔들어 혼합한 후, 15분간 실온에 방치시킨 후 분리하였다.
- 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 쇠비름의 ethyl acetate 추출물과 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 250 ppm씩 섞고, 백두옹의 ethyl acetate 추출물 500 ppm 및 쇠비름의 ethyl acetate 추출물 500 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Stap hylococcus aureusS}- Shigella dysenteriae^: 사용하고 대조군으로 70% ethanol을 각 시료와 동일한 양인 20 1 씩분주하여 검증하였다.
- 백두옹 추출물을 다른 항균성 식물 추출물과 혼합했을 시항균력의 상승 여부를 확인하고자 쇠비름 추출물과의 혼합을 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 쇠비름의 ethyl acetate 추출물과 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 250 ppm씩 섞고, 백두옹의 ethyl acetate 추출물 500 ppm 및 쇠비름의 ethyl acetate 추출물 500 ppm과 항균력을 비교하였다.
- 백두옹을 methanol로 추출한 후, petroleum ether, chloro form, ethly acetate를 이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통 분획하고, 열수추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발세균 (.Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella enteri- tidis, Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhi- murium, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aruginosa, Shi gella)에 대하여 항균효과를 조사하였다. 백두옹 추출물의 농도별 항균 활성 검색에서는 백두옹의 ethyl ace tate 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였으며 Staphylococcus aureus^ Salmonella enteritidis 및 Shigella dysenteriae^\ 가장 민감하게 반웅하는 균주였다.
- 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 농도별로 (0 ppm, 1, 000ppm, 2, 000 ppm 및 4, 000 ppm) TSB배지에 첨가하고, Gram 양성균인 Staphylococcus aureusS]- Gram 음성균인 Shigella dyseriae 에 각각 접종시켜 72시간 배양하면서일정 시간 간격으로 균주의 성장 정도를 측정해 본 바, Fig. 3 및 Fig. 4와 같은 증식곡선을 얻을 수 있었다. Staphylo coccus 의 경우, 백두옹의 ethyl acetate 주줄물을첨가하지 않은 control의 경우 배양 후 6시간 후부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고, 2, 000 ppm 농도를 첨가하였을 경우 균의 증식이 완만하게 이루어져 균의 성장이 12시간까지 억제됨을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 쇠비름의 ethyl acetate 추출물과 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 250 ppm씩 섞고, 백두옹의 ethyl acetate 추출물 500 ppm 및 쇠비름의 ethyl acetate 추출물 500 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Stap hylococcus aureusS}- Shigella dysenteriae^: 사용하고 대조군으로 70% ethanol을 각 시료와 동일한 양인 20 1 씩분주하여 검증하였다.
- 제균시키고, 액체배지에 각 추출물을 1, 000 ppm, 2, 000 ppm 및 4, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.D.값을 0.4로 맞춘 세균 배양액을 최종농도가 IO-이 되게 무균적으로 접종하여 37℃에서 72시간 배양하고, 12시간마다 세균 배양액의 증식정도를 620 run , spectrophotometer에서 측정하였다.
- 4로 흡광도를 조절하고 pour plate method에 따라 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지가 분주 된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 백두옹의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm 및 1, 000 ppm으로 희석하여 20 씩 천천히 흡수시켰다. Control로 백두옹 추출물이 들어 있지 않은 70% etha- nol을 실험군과 동일한 방법으로 점적 하였다.
- Japan) 3. 제균시키고, 액체배지에 각 추출물을 1, 000 ppm, 2, 000 ppm 및 4, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.
- Control로 백두옹 추출물이 들어 있지 않은 70% etha- nol을 실험군과 동일한 방법으로 점적 하였다. 준비된 모든 plate는 37 ℃ 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm) 의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 항균성 물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 paper disc 방법을 사용하였다 w Tryptic Soy Broth (TSB) 배지에 배양한 세균을 spectrophotometer (Nontron instruments. Italy) 620 nm에서 O.D.값 0.4로 흡광도를 조절하고 pour plate method에 따라 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지가 분주 된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 백두옹의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm 및 1, 000 ppm으로 희석하여 20 씩 천천히 흡수시켰다.
대상 데이터
- 백두옹 추출물의 항균실험에 사용한 균주는 Gram (+)세균 2종과 Gram (-)세균 7종으로 총 9종을 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 분양 받아 사용하였다 (Table 1). 균의 생육배지로는 모든 균주에 대하여 Tryptic Soy Broth (Difco, USA)를 사용하여 37℃, incubator에서 18~24 시간 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 항균성 시험 대상 식물인 백두옹은 한국산으로, 대구시 중구 남성로 약전 골목에서 2003년 10 월, 건조 상태의 것을 구입하였다. 불순물을 제거하기 위해 가볍게 2번 수세하여 건조시킨 후, 미세하게 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 건조 상태의 것을 구입하였다. 불순물을 제거하기 위해 가볍게 2번 수세하여 건조시킨 후, 미세하게 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
성능/효과
- 활성을 실험해 본 바 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성 균에 대한 백두옹의 petroleum ether, chlo roform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수 추출물의 항균 활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 백두옹의 각종 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhi bition zone의 크기가 증가하여 petroleum ether 추출물의 경우 Staphylococcus aureus^ 대해 1, 000 ppm 농도에서 25 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다 (Fig.
- 백두옹 추출물의 농도별 항균 활성 검색에서는 백두옹의 ethyl ace tate 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였으며 Staphylococcus aureus^ Salmonella enteritidis 및 Shigella dysenteriae^\ 가장 민감하게 반웅하는 균주였다. Staphylococcus aureus 와 Shigella dysenteriae는 백두옹의 ethyl acetate 주줄 물뿐만 아니라 petroleum ether 및 chloroform 추출물에도 생존이 억제되었다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물과 쇠비름의 ethyl acetate 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 시 보다 상숭효과를 나타내었다.
- 백두옹의 ethyl acetate 추출물과 쇠비름의 ethyl acetate 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 시 보다 상숭효과를 나타내었다. 또한 백두옹의 ethyl acetate 추출물이 식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Staphylococcus aureus 및 Shigella dy- senteriae^] 배양액에 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 2, 000 ppm 농도로 첨가했을 시, Staphylococcus aureus 의 생육을 12시간 이상까지 지연시킬 수 있었고, Shigella jy/의 생육도 9시간까지 억제시킬 수 있었다. 이상의 결과 백두옹 추출물은 각종 식중독 유발세균에 대한 항균력을 지니고 있어 새로운 천연 식품보존제 개발을 위한 신소재로서 활용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella enteri- tidis, Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhi- murium, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aruginosa, Shi gella)에 대하여 항균효과를 조사하였다. 백두옹 추출물의 농도별 항균 활성 검색에서는 백두옹의 ethyl ace tate 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였으며 Staphylococcus aureus^ Salmonella enteritidis 및 Shigella dysenteriae^\ 가장 민감하게 반웅하는 균주였다. Staphylococcus aureus 와 Shigella dysenteriae는 백두옹의 ethyl acetate 주줄 물뿐만 아니라 petroleum ether 및 chloroform 추출물에도 생존이 억제되었다.
- 1). 백두옹 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 백두옹의 petroleum ether 추출물은 Staphylococcus 에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 백두옹의 chlo roform 추출물은 Shigella 에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물은 Bacillus cereus 를 제외한 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었고 특히 Salmonella enteritidis에 대해 큰 항균활성을 보였다.
- Staphylococcus aureus 와 Shigella dysenteriae는 백두옹의 ethyl acetate 주줄 물뿐만 아니라 petroleum ether 및 chloroform 추출물에도 생존이 억제되었다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물과 쇠비름의 ethyl acetate 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 시 보다 상숭효과를 나타내었다. 또한 백두옹의 ethyl acetate 추출물이 식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Staphylococcus aureus 및 Shigella dy- senteriae^] 배양액에 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 2, 000 ppm 농도로 첨가했을 시, Staphylococcus aureus 의 생육을 12시간 이상까지 지연시킬 수 있었고, Shigella jy/의 생육도 9시간까지 억제시킬 수 있었다.
- 백두옹 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 백두옹의 petroleum ether 추출물은 Staphylococcus 에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 백두옹의 chlo roform 추출물은 Shigella 에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물은 Bacillus cereus 를 제외한 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었고 특히 Salmonella enteritidis에 대해 큰 항균활성을 보였다. 갓의 ethyl acetate 주줄물은 Staphylococcus aureus6^ 대해서 가장 높은 항균활성이 있음이 보고된 넙 있는데, 본 실험에서 사용한 백두옹의 경우 ethyl acetate 추출물이 Sal monella에 대해 가장 강한 항균효과를 나타내었다.
- 본 실험에 사용한 백두옹 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력은 Table 4와 같이 나타나, 백두옹의 petroleum ether 주줄물은 Shigella 에 대해 가장 큰 항균효과를 나타냈고, chloroform 주줄물은 Shigella y/em에대해 가장 큰 항균력을 보였다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물은 Bacillus cereus^ 제외한 모든 균주에 대해 광범위한 항균력을 나타내었는데, 이 중 Salmonella ritidis가가장 민감하게 반응해 백두옹의 ethyl acetate 추출물 1, 000 ppm에서 22 mm의 clear zone을 나타내었다. 이처럼 백두옹의 ethyl acetate 추출물은 Gram 양성균과 Gram 음성균에 대해 폭넓은 항균력을 지니고 있음을 알 수 있었는데 산초의 methanol 추출물의 경우 Gram 양성균주보다 Gram 음성균주인 E.
- fyphimurium의 생육 억제를 36시간까지 지속시킨다고 보고한 바 있어, 천연물에서 분리되는 각종 항균성 물질을 섞어 활용하면 식중독균의 성장을 효율적으로 억제할 수 있을것으로 사료된다. 백두옹의 ethyl acetate추출물이 Shigella dyseEeziae에 대해 미치는 생육 저해 정도를 동일한 방법으로 72시간 동안 살펴본 바 Fig. 4와 같은 결과를 얻을 수있었다 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control 배지에서 배양했을 시 6시간 이후부터 급격한 증가를 보여빠른 성장이 일어남을 관찰할 수 있었으나 백두옹의 ethyl acetate추출물 2, 000 ppm을 첨가한 배지에서는 균의 증식이 9시간까지 지연되었다.
- 백두옹의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 분획물 및 열수추출물은 각각 0.8%, 1.2%, 1.7%, 2.9% 및 5.3%로 나타나, petroleum ether의 수율이 가장 낮았고 열수추출물의 수율이 가장 높았다.
- 갓의 ethyl acetate 주줄물은 Staphylococcus aureus6^ 대해서 가장 높은 항균활성이 있음이 보고된 넙 있는데, 본 실험에서 사용한 백두옹의 경우 ethyl acetate 추출물이 Sal monella에 대해 가장 강한 항균효과를 나타내었다. 본 실험에 사용한 백두옹 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력은 Table 4와 같이 나타나, 백두옹의 petroleum ether 주줄물은 Shigella 에 대해 가장 큰 항균효과를 나타냈고, chloroform 주줄물은 Shigella y/em에대해 가장 큰 항균력을 보였다. 백두옹의 ethyl acetate 추출물은 Bacillus cereus^ 제외한 모든 균주에 대해 광범위한 항균력을 나타내었는데, 이 중 Salmonella ritidis가가장 민감하게 반응해 백두옹의 ethyl acetate 추출물 1, 000 ppm에서 22 mm의 clear zone을 나타내었다.
- 나타났다. 본 실험에서 가장 민감한 항균효과를 보였던 Staphylococcus 에 대한 두 식물 주출물의 항균력은백두옹 추출물과 쇠비름 추출물을 혼합했을 경우 더 크게나타나, 백두옹의 ethyl acetate 추출물만을 단독으로 500 ppm 준 경우 (15 mm) 보다 백두옹의 ethyl acetate 추출물 250 ppm에 쇠비름의 ethyl acetate 추출물 250 ppm 을 섞어 준 경우가 더 큰 항균력을 보였다 (26 mm). Shi gella dysemeriae균에 대해서도 두 주촐물을 각각 250 ppm 씩 섞어 투여한 경우가 백두옹의 ethyl acetate 추출물 500 ppm을 단독으로 준 경우보다 높은 항균력을 보였다 (Fig.
- 또한 백두옹의 ethyl acetate 추출물이 식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Staphylococcus aureus 및 Shigella dy- senteriae^] 배양액에 백두옹의 ethyl acetate 추출물을 각각 2, 000 ppm 농도로 첨가했을 시, Staphylococcus aureus 의 생육을 12시간 이상까지 지연시킬 수 있었고, Shigella jy/의 생육도 9시간까지 억제시킬 수 있었다. 이상의 결과 백두옹 추출물은 각종 식중독 유발세균에 대한 항균력을 지니고 있어 새로운 천연 식품보존제 개발을 위한 신소재로서 활용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- Gram 양성 균에 대한 백두옹의 petroleum ether, chlo roform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수 추출물의 항균 활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 백두옹의 각종 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhi bition zone의 크기가 증가하여 petroleum ether 추출물의 경우 Staphylococcus aureus^ 대해 1, 000 ppm 농도에서 25 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다 (Fig. 1). 백두옹 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 백두옹의 petroleum ether 추출물은 Staphylococcus 에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 백두옹의 chlo roform 추출물은 Shigella 에서 가장 큰 활성을 나타내었다.
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