본 연구에서 미생물유래의 종양 예방 및 억제제 개발을 목적으로 우리나라 전통 발효식품인 젓갈에서 항암 활성이 우수한 미생물을 분리, 동정 하였다. 젓갈로부터 항암물질을 생산하는 균주 SW-1을 분리하여 형태학적, 생리학적 특성을 검토한 결과, 본 균주는 Bacillus subtillis SW-1으로 동정되었다. 본 균주로부터 항암물질은 실험에 사용한 두가지의 암세포에 강한 활성을 나타내었다. 그 중에서 폐암 세포인 A549에 가장 강한 활성을 나타내었다. 항암물질 생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과, 3.0% soluble starch, 1.0% yeast extract 였다. 무기염의 경우는 활성에는 그다지 영향을 미치지 않았다. 배지의 초기 pH 및 배양온도에 따른 항암물질의 생산성을 검토한 결과 초기 pH 5.0배양온도 3$0^{\circ}C$에서 25시 간배양 했을 때 최대 활성을 보였다. Chromosomal DNA단편화 실험에서 Bacillus subtilis SW-1의 배양상등액을 처리했을 때 DNA가 사닥다리모양으로 분해되는 Apoptosis(계획된 세포죽임)를 일으키는 것으로 확인되었다. 이 미생물이 생성하는 물질을 현재 HPLC, GC등을 이용하여 분리 중에 있으며 현재까지의 결과로는 당 중합체 인 것으로 분석된다.
본 연구에서 미생물유래의 종양 예방 및 억제제 개발을 목적으로 우리나라 전통 발효식품인 젓갈에서 항암 활성이 우수한 미생물을 분리, 동정 하였다. 젓갈로부터 항암물질을 생산하는 균주 SW-1을 분리하여 형태학적, 생리학적 특성을 검토한 결과, 본 균주는 Bacillus subtillis SW-1으로 동정되었다. 본 균주로부터 항암물질은 실험에 사용한 두가지의 암세포에 강한 활성을 나타내었다. 그 중에서 폐암 세포인 A549에 가장 강한 활성을 나타내었다. 항암물질 생산을 위한 최적 배양조건을 검토한 결과, 3.0% soluble starch, 1.0% yeast extract 였다. 무기염의 경우는 활성에는 그다지 영향을 미치지 않았다. 배지의 초기 pH 및 배양온도에 따른 항암물질의 생산성을 검토한 결과 초기 pH 5.0배양온도 3$0^{\circ}C$에서 25시 간배양 했을 때 최대 활성을 보였다. Chromosomal DNA단편화 실험에서 Bacillus subtilis SW-1의 배양상등액을 처리했을 때 DNA가 사닥다리모양으로 분해되는 Apoptosis(계획된 세포죽임)를 일으키는 것으로 확인되었다. 이 미생물이 생성하는 물질을 현재 HPLC, GC등을 이용하여 분리 중에 있으며 현재까지의 결과로는 당 중합체 인 것으로 분석된다.
A bacterum containing antitumor activity was isolated from traditional korean food, Jeotgal. Through the 16s rRNA sequence analysis, the bacterium was identitied as a strain of Bacillus subtilis SW-l. The best culture condition for antitumor activity of the bacterium is 3% of soluble starch and 1 % ...
A bacterum containing antitumor activity was isolated from traditional korean food, Jeotgal. Through the 16s rRNA sequence analysis, the bacterium was identitied as a strain of Bacillus subtilis SW-l. The best culture condition for antitumor activity of the bacterium is 3% of soluble starch and 1 % of yeast extract as corbon and nitrogen sources, respectively. Cytotoxicitic concentrations of the culture supernatant of B. subtilis SW-1 against cancer cell lines, A549 and SK-OV3 were 30 ul/ml and 40 ul/ml, respectively, as $IC_{50}$/ values. In DNA fragmentation assay, the culture supernatant showed the programmed cell death (apoptosis) to cause degrading the chromosomal DNA like ladder. Taken together, the culture supernatant of the B. subtilis SW-1 has some possibility to be used as an antitumor agent.
A bacterum containing antitumor activity was isolated from traditional korean food, Jeotgal. Through the 16s rRNA sequence analysis, the bacterium was identitied as a strain of Bacillus subtilis SW-l. The best culture condition for antitumor activity of the bacterium is 3% of soluble starch and 1 % of yeast extract as corbon and nitrogen sources, respectively. Cytotoxicitic concentrations of the culture supernatant of B. subtilis SW-1 against cancer cell lines, A549 and SK-OV3 were 30 ul/ml and 40 ul/ml, respectively, as $IC_{50}$/ values. In DNA fragmentation assay, the culture supernatant showed the programmed cell death (apoptosis) to cause degrading the chromosomal DNA like ladder. Taken together, the culture supernatant of the B. subtilis SW-1 has some possibility to be used as an antitumor agent.
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문제 정의
본 연구에서는 한국고유의 전통 발효 식품인 젓갈로부터 항암 활성을 갖는 미생물을 순수 분리, 동정하고 항암활성 물질 생산을 위한 최적배양조건 및 항암제로서의 이용 가능성을 조사하였다.
제안 방법
균주의 분리를 위하여 한국전통식품, 젓갈을 멸균수로 시험관(180mmxl8mm) 에 순차적으로 희석하여 Luria Bertani (LB) plate에 도말하여 single colony를 유도한 다음 각각의 colony들을 LB broth 5ml에 접종하여 30℃ 에서 24시간 배양 하였다. 그 배양액을 항암활성이 높은 균주를 선발하기 위해 사용하였다.
균주의 분리를 위하여 한국전통식품, 젓갈을 멸균수로 시험관(180mmxl8mm) 에 순차적으로 희석하여 Luria Bertani (LB) plate에 도말하여 single colony를 유도한 다음 각각의 colony들을 LB broth 5ml에 접종하여 30℃ 에서 24시간 배양 하였다. 그 배양액을 항암활성이 높은 균주를 선발하기 위해 사용하였다.
또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 50% 억제하는 시료의 농도를 #Cm으로 나타내었다. 대조구는 시료 대신 대장균의 배양액을 첨가한 것으로 하였다.
0%로 첨가하여 생균수를 관찰하여 결정하였다. 또한 각각의 탄소원, 질소원 농도를 변화시키면서 균의 배양 상등액의 항암활성을 관찰하여 최적 배지조성을 결정하였다. 최적 배지 초기 pH는 위에서 결정된 최적 배지의 pH를 3.
멸균수로 희석한 한국전통 젓갈을 LB배지에 도말하여 24시간 동안 37℃에서 배양후 나타난 각 colony를 LB액체배지 에 접종하고 24시간 배양하여 그 상등액을 항암활성 측정에 이용하였다.
미생물 생육 최적 탄소원은 최소배지인 M9[Na2HPO4 0.6%, KH2PO4 0.3%, NH4C1 0.1%, NaCl 0.05%, MgSO4 . 7H2O solution (246.5g/L) 0.1%, Thiamine . HC1 solution (Ig/L) 0.1%, CaC12 solution (14.7g/L) 0.1%] 배지에 각종 탄소원을 1.0%로 첨가하였고, 최적 질소원은 각종 질소원을 1.0%로 첨가하여 생균수를 관찰하여 결정하였다. 또한 각각의 탄소원, 질소원 농도를 변화시키면서 균의 배양 상등액의 항암활성을 관찰하여 최적 배지조성을 결정하였다.
암세포는 95% 습도, 5% CO2, 37℃ 온도 조건에서 배양 하였으며, 배지는 10% FBS가 든 a-DMEM을 사용하였고 48시간 간격으로 배지를 교체하였다. 배양액 처리 전 24시간에 1% FBS로 바꿨으며 Cell 수는 5xl04 cell/ml일때 를 사용하였으며 농도별, 시간별 암세포의 사멸율을 typhan blue로 염색 후 counting 하였다.
배양온도에 따른 항암활성: 배양온도에 따른 항암활성의 변화를 보기 위하여 20, 25, 30, 35, 40, 45℃ 에서 각각 배양하여 비교해 본 결과는 Fig. 5와 같았다. 30℃ 에서 그 활성이 가장 우수하였다.
세포수의 측정에는 hemacytometer와 trypan blue 염색법을 이용하였다. 분리한 세포배양액 10 J11 와 trypan blue solution (0.4% trypan blue, 0.8% NaCl, 0.06% KH2PO4, 0.05% methyl-p-hydroxybenzoate, pH7.2) 10 Jll를 잘 혼합한 후 혼합액 의 10 J11 를 hemacytometer에 취해 inverted microscope를 이용해 세포수를 측정하였다.
/ml)을 사용하여 활성을 비교하였다. 암세포는 95% 습도, 5% CO2, 37℃ 온도 조건에서 배양 하였으며, 배지는 10% FBS가 든 a-DMEM을 사용하였고 48시간 간격으로 배지를 교체하였다. 배양액 처리 전 24시간에 1% FBS로 바꿨으며 Cell 수는 5xl04 cell/ml일때 를 사용하였으며 농도별, 시간별 암세포의 사멸율을 typhan blue로 염색 후 counting 하였다.
암세포는 폐암세포(A549)와 난소암(SK-OV3) 및 백혈구 암세포(HL-60)를 사용하였으며 항암제 Contro로 현재 병원 에서 사용중인 taxol (1 #/ml)을 사용하여 활성을 비교하였다. 암세포는 95% 습도, 5% CO2, 37℃ 온도 조건에서 배양 하였으며, 배지는 10% FBS가 든 a-DMEM을 사용하였고 48시간 간격으로 배지를 교체하였다.
암세포에 대한 항암활성미생물의 apoptosis(계획된 세포죽임)를 조사하기 위하여 암세포배양액에 항암 활성 미생물의 배양 상등액을 농도별 0, 10 ul/ml, 30 ul/mlz 50 ul/ml되 게 처리하고 24시간 후 간uomosomal DNA를 분리하여 agarose gel electrophoresis를 실시하여 DNA분해 양상을 조사하였다.
여기에 인산생리 식염수에 5 mg/ml의 농도로 제조한 MTT 용액 20#를 첨가하고 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였다. 이를 2,000rpm 에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 각 well당 DMSO 150 ill를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader (Molecular Device Co.)로 550nm에서 흡광도를 측정하여 성 장억제효과(Growth inhibitory effect(%)=[(대조구의 흡광도- 시료처리구의 흡광도)/대조구의 흡광도)]X100)를 구하여 세포독성 활성의 지표로 하였다. 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 50% 억제하는 시료의 농도를 #Cm으로 나타내었다.
또한 각각의 탄소원, 질소원 농도를 변화시키면서 균의 배양 상등액의 항암활성을 관찰하여 최적 배지조성을 결정하였다. 최적 배지 초기 pH는 위에서 결정된 최적 배지의 pH를 3.0~ 11.0으로 변화 시키면서 결정하였고, 최적 배양온도는 온도를 20℃에서 45℃ 까지 변화시키면서, 그 활성을 측정하여 결정하였다.
항암활성을 갖는 미생물의 동정을 위하여 균의 형태학적, 생리학적 특성을 조사하였다. 형태학적 특성은 Scanning Electron Microscope (SEM)로 표면형태, 크기, sclerotia의 형태 유무등으로 관찰하였고, 정확한 동정을 위해 한국 미생물보 존센터에 의뢰하여 16s rRNA sequence를 분석하여 유전자 간의 상동성을 비교하여 동정하였다.
항암활성을 갖는 미생물의 동정을 위하여 균의 형태학적, 생리학적 특성을 조사하였다. 형태학적 특성은 Scanning Electron Microscope (SEM)로 표면형태, 크기, sclerotia의 형태 유무등으로 관찰하였고, 정확한 동정을 위해 한국 미생물보 존센터에 의뢰하여 16s rRNA sequence를 분석하여 유전자 간의 상동성을 비교하여 동정하였다.
대상 데이터
세포독성 측정을 위해 사용한 인체암세포인 A549 (lung cancer cell line, ATCC CLL-185), SK-OV3 (ovarian cancer cell line, ATCC HTB-77) 그리고 HL60 (promyelocytic leukemia, ATCC CCL-240)를 ATCC에서 구입하여 사용하였고, 이들 세포주는 Dulbecco's Modifide Eagles Medium (DMEM) (Gibco, Rockville, MD, USA)에 10%(v/v) Fetal Bovine Serum (Gibco), 0.37% sodium bicarbonate (Sigma, St. louis, MO, USA)을 혼합한 배지에 lOOunit의 streptomycin/penicillin 을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포를 배양용기에서 분리하기 위한 trypsin 용액[16]은 Hank's balanced salts solution (HBSS)[12]에 0.
louis, MO, USA)을 혼합한 배지에 lOOunit의 streptomycin/penicillin 을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포를 배양용기에서 분리하기 위한 trypsin 용액[16]은 Hank's balanced salts solution (HBSS)[12]에 0.05% (w/v)trypsin과 0.53mM EDTA가 첨가된 것을 사용하였고 배양세포의 세척 등에는 HBSS를 사용하였다.
젓갈로부터 분리한 약 2,000개의 colony 중에 1차적으로 항암활성이 강한 6균주를 선발하였고, 그 중 암세포 A549에 강한 세포독성을 나타내는 균주(Fig. 1)를 선별하여 이 균주를 SW-1 이라고 명명하였다.
이론/모형
세포수의 측정에는 hemacytometer와 trypan blue 염색법을 이용하였다. 분리한 세포배양액 10 J11 와 trypan blue solution (0.
성능/효과
Bacillus subtilis SW-1의 항암활성을 검토한 결과 A549, SK-0V3 세포의 경우 전반적으로 배양시간과 농도 의존적으로 세포생육을 억제하는 것으로 나타났다(Table 1). A549인 경우 30 ul/ml(SW-l 배양상등액/암세포 배양배지)의 배양상등액의 농도에서 IGo를 나타내었으며 SK-OV3인 경우 50 jil/ml 의 농도에서 그리고 HL60 cell인 경우 거의 세포독성을 나타내지 않았다.
질소원에 따른 항암 활성: 항암 활성에 미치는 질소원의 영향을 검토하기 위하여 기본 배지에 질소원의 종류를 달리하여 첨가한 후 30℃에서 24시간 진탕 배양하여 항암활성에 미치는 영향을 검토한 결과 Table 2에 제시하였다. Yeast extract를 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6%에서 검토한 결과 Yeast extract 의 최적 농도는 1.0%이었다.
일반적으로 암세포가 항암제에 의해 사멸할 때 apoptosis(계획된 세포죽음)의 현상으로 chromosomal DNA의 사닥다리모양으로 단편화가 주로 일어나며 이 관찰로 항암제로서의 이용 가능성을 확인한다. 본 미 생물에서 분비된 항암활성물질은 본 실험에서 Fig. 7에서 보여주듯이 Bacillus subtilis SW-1 배양상등액의 50 μ1/ml의 처리시 ladder모양으로 chromosome이 분해된 것이 확인되었으며 따라서 B. subtilis SW-1 이 분비하는 항암활성물질은 항암제로써의 이용가능성이 있는 것으로 판단된다.
6과 같다. 위에서 조사한 최적조건에서 배양하는 동안 균의 생육과 항암 활성을 검토한 결과, 접종 후 7시간이 경과하면서 대수증식기에 들어갔으며 18시간이 지나면서 정지기 및 사멸기에 도달하였고, 항암물질의 생산은 14시간이 지나면서 증가하기 시작하여 25시간이 경과한 후 최대 활성을 보였다(Fig. 6).
분 열의 특성을 가진다는 점에서 항암물질의 개발에 많이 사용되고 있다고 밝히고 있다. 이런 방법으로 개발된 250개 항암 물질의 82%가 in #에서도 활성이 있다고 밝혀, 현재 많이 밝혀지지 않은 미생물로부터 항암물질을 screening 하는 예비 방법으로 in vitro system을 사용할 수 있음을 시사하고 있다.
30℃ 에서 그 활성이 가장 우수하였다. 젓갈류에서 분리된 균주는 중온 발효시키기때문에 대부분의 균주가 30~45℃에서 생육과 활성이 좋은 것으로 나타났고, Bacillus subtilis SW-1은 멸치 젓에서 분리된 균주로써 중온인 30℃가 최적으로 나타났다.
또한 호기성의 불규칙한 cream형태의 흰색 colony를 생성하였다. 정확한 동정을 위해 16s rRNA se- quence를 결정하여 기존의 알려진 미생물과의 비교 결과 Bacillus subtilis와 99% 유사성을 나타냈다.(Fig.
초기 pH에 따른 항암 활성: 초기 pH를 2.0, 3.0, 40, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0으로 조정된 배양 배지에 SW-1 균주를 접종하여 배양하였을 때 초기 pH가 4~6인 배지에서 항암활성이 가장 우수하였다. 이 결과로 볼때 본 균주는 약산성 쪽에서 활성을 나타내는 호산성 균주인 것으로 생각된다.
이상의 실험 결과로부터 젓갈류에서 분리한 항암 활성을 갖는 미생물을 Bacillus subtilisS. 최종 동정하여, Bacillus subtilis SW-1로 명명하였다.
최종 분리 선정한 미생물 SW-1의 형태학적 규명을 위해 현미경 관찰 및 SEM 촬영 결과를 살펴볼 때, 그람양성으로 써 rod의 형태를 보였으며, 크기는 0.6x19 ]im였고, 운동성이 있었다(Fig. 2). 또한 호기성의 불규칙한 cream형태의 흰색 colony를 생성하였다.
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