Objective: To evaluate the effects of recombinant FSH (rFSH) and urinary FSH (uFSH) on the gene expressions of human endometrial stromal cells in vitro. Methods: Endometrial tissue was obtained from a pre-menopausal women undergoing hysterectomy. Primary endometrial stromal cells were isolated and i...
Objective: To evaluate the effects of recombinant FSH (rFSH) and urinary FSH (uFSH) on the gene expressions of human endometrial stromal cells in vitro. Methods: Endometrial tissue was obtained from a pre-menopausal women undergoing hysterectomy. Primary endometrial stromal cells were isolated and in vitro cultured with FBS-free DMEM/F-12 containing 0, 10, 100, and 1, 000 mIU/ml of rFSH and uFSH for 48 hours, respectively. Total RNA was extracted from the cultured cells and subjected to real time RT-PCR for the quantitative analysis of progesterone receptor (PR), estrogen receptor $\alpha/\beta$ (ER-$\alpha/\beta$), cyclooxygenase 2 (Cox-2), leukemia inhibitory factor (LIF), homeobox A10-1 and -2 (HoxA10-1/-2). Results: Both hormone treatments slightly increased (< 3 folds) the expressions of PR, ER-$\beta$ and HoxA10-1/-2 gene. However, ER-$\alpha$ expression was increased up to five folds by treatments of both FSH for 48 hours. The LIF expression by the 10 mIU/ml of uFSH for 12 hours was significantly higher than that of rFSH (p<0.01). After 24 hours treatment of two kinds of hormones, the expression patterns of LIF were similar. The 100 and 1, 000 mIU/ml of rFSH induced significantly higher amount of Cox-2 expression than those of uFSH, respectively (p<0.05). Conclusion: This study represents no adversely effect of exogeneous gonadotropins, rFSH and uFSH, on the expression of implantation related genes. We suggest that rFSH is applicable for the assisted reproductive technology without any concern on the endometrial receptivity.
Objective: To evaluate the effects of recombinant FSH (rFSH) and urinary FSH (uFSH) on the gene expressions of human endometrial stromal cells in vitro. Methods: Endometrial tissue was obtained from a pre-menopausal women undergoing hysterectomy. Primary endometrial stromal cells were isolated and in vitro cultured with FBS-free DMEM/F-12 containing 0, 10, 100, and 1, 000 mIU/ml of rFSH and uFSH for 48 hours, respectively. Total RNA was extracted from the cultured cells and subjected to real time RT-PCR for the quantitative analysis of progesterone receptor (PR), estrogen receptor $\alpha/\beta$ (ER-$\alpha/\beta$), cyclooxygenase 2 (Cox-2), leukemia inhibitory factor (LIF), homeobox A10-1 and -2 (HoxA10-1/-2). Results: Both hormone treatments slightly increased (< 3 folds) the expressions of PR, ER-$\beta$ and HoxA10-1/-2 gene. However, ER-$\alpha$ expression was increased up to five folds by treatments of both FSH for 48 hours. The LIF expression by the 10 mIU/ml of uFSH for 12 hours was significantly higher than that of rFSH (p<0.01). After 24 hours treatment of two kinds of hormones, the expression patterns of LIF were similar. The 100 and 1, 000 mIU/ml of rFSH induced significantly higher amount of Cox-2 expression than those of uFSH, respectively (p<0.05). Conclusion: This study represents no adversely effect of exogeneous gonadotropins, rFSH and uFSH, on the expression of implantation related genes. We suggest that rFSH is applicable for the assisted reproductive technology without any concern on the endometrial receptivity.
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문제 정의
15 따라서, 본 연구에서는 폐경기 이전의 자궁에서 분리한 기질세포를 체외배양하면서 rFSH와 uFSH를 처리하여, 이들이 착상과 관련된 유전자의 발현 양상에 어떠한 영향을 미치는 가를 알아보았다.
본 연구에서는 자궁 기질세포를 체외배양하는 과정에서 rFSH와 uFSH를 처리하고 이들이 착상 관련 유전자의 발현 양상에 어떠한 영향을 주는 가를 살펴보았다. PR, ER-α/β, Cox-2, LIF, HoxA10-1/-2 등과 같이 착상과정과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 유전자들을 대상으로 하였다.
제안 방법
16,17 자궁의 이상이 아닌 다른 원인으로 자궁적출술을 시행하는 환자의 자궁 조직에서 일부의 조직 (2×3 cm)을 절개한 후 기본배양액 (M199/F-12 medium; Gibco Life Technologies, MD, USA)으로 수세하였다. 자궁 조직을 멸균된 해부기구를 사용하여 1~2 mm2로 조각낸 후 기본배양액에 collagenase (2 mg/ml; Sigma, MO, USA)를 첨가하여 2~3시간 동안 처리하였다.
, NJ, USA)를 이용하여 선별하였다. 기본배양액으로 수세하는 과정에서 sieve를 통과한 세포를 포함한 배양액을 원심분리하여 기질세포를 수획하였다. 이렇게 분리된 세포들은 기본배양액에 10% fetal bovine serum (FBS), insulin, transferring, selenium, bovine serum albumin, linoleic acid 등을 첨가하여 배양하였으며, 배양액은 2~3일 주기로 교체하였다.
혈청에 존재하는 여러 가지 물질들의 영향을 배제하기 위해 FBS를 첨가하지 않은 기본배양액에 insulin, estradiol, progesterone을 첨가하여 4~5일 정도 배양한 후에 FSH를 처리하였다. 대조군은 FSH를 첨가하지 않은 배양액에서 배양하였으며, 실험군은 rFSH (Puregon; Organon, Netherlands)와 uFSH (Metrodin HP; Serono, Switzerland)을 각각 10, 100, 1,000 mIU/ml의 농도로 첨가하여 12, 24, 48시간 동안 배양하였다. 실험군의 배양액은 FSH의 반감기를 고려하여 24시간을 주기로 교체하였다.
각각의 배양 중인 시료에서 Qiagen RNeasy kit(Qiagen, WA, USA)를 사용하여 RNA를 추출하여, 분석하기 전까지 -70℃에 보관하였다. 동량의 RNA 를 사용하여 M-MLV kit (Promega Co., WI, USA)로 역전사 반응을 수행한 후, 이들을 대상으로 착상 관련 유전자들의 발현 양상을 Dynamo kit (Finnzyme, Finland)와 DNA engine Opticon 2 fluorescence detection system (MJ Research, MA, USA)를 이용하여 real time RT-PCR 방법으로 분석하였다. 착상 관련 유전자들에 대한 정보와 primer들의 염기 서열은 Table 1에 나타내었다.
이들의 특성을 확인하기 위해 기질세포에 특이적인 vimentin에 대한 세포면역화학 염색법을 실시하여 95% 이상의 세포들이 기질세포임을 확인하였다 (Figure 1). 또한, 배양 중인 기질세포에서 FSH-R와 LH-R의 발현을 RTPCR 방법으로 확인하였다 (data not shown).
배양 중인 기질세포의 분리 효율성을 확인하기 위해 상피세포 특이적인 cytokeratin과 기질세포 특이적인 vimentin에 대한 세포면역화학 염색 (immunocytochemical staining)을 실시하였다. 세포를 고정하기 위해 3.
4% Triton X-100-PBS를 10분 동안 처리하여 세포막을 연화시켰다. 비특이적인 염색을 방지하기 위해 2% goat serum과 4% bovine serum albumin이 첨가된 PBS를 1시간 동안 처리하였다. 일차 항체로는 cytokeratin 8/18 (Santa Cruz Biotech.
배양 중인 기질세포의 분리 효율성을 확인하기 위해 상피세포 특이적인 cytokeratin과 기질세포 특이적인 vimentin에 대한 세포면역화학 염색 (immunocytochemical staining)을 실시하였다. 세포를 고정하기 위해 3.7% formaldehyde-PBS를 10분 동안 처리하고, 100% methanol과 100% acetone으로 각각 10분과 5분 처리한 후, 0.4% Triton X-100-PBS를 10분 동안 처리하여 세포막을 연화시켰다. 비특이적인 염색을 방지하기 위해 2% goat serum과 4% bovine serum albumin이 첨가된 PBS를 1시간 동안 처리하였다.
, CA, USA)을 1:100으로 희석하여 1시간 동안 처리하였다. 염색된 시료는 anti-fade mounting medium (Fisher Scientific, PA, USA)을 이용해 봉입하고 형광현미경으로 관찰하였다.
착상 관련 유전자들에 대한 정보와 primer들의 염기 서열은 Table 1에 나타내었다. 예비 실험을 통해 각각의 primer에 대한 real time PCR 조건을 최적화하였으며, internal control 유전자로는 β-actin을 이용하여 2-∆∆Ct 방법으로 대조군에 대한 상대적인 정량분석을 실시하였다.18 통계적인 분석은 Student's t-test를 이용하여 p 값이 0.
자궁 조직을 멸균된 해부기구를 사용하여 1~2 mm2로 조각낸 후 기본배양액에 collagenase (2 mg/ml; Sigma, MO, USA)를 첨가하여 2~3시간 동안 처리하였다. 이렇게 효소를 처리하여 분리한 세포들을 두 종류의 wire sieve (140 µm, 37 µm; Newark Wire Co., NJ, USA)를 이용하여 선별하였다. 기본배양액으로 수세하는 과정에서 sieve를 통과한 세포를 포함한 배양액을 원심분리하여 기질세포를 수획하였다.
비특이적인 염색을 방지하기 위해 2% goat serum과 4% bovine serum albumin이 첨가된 PBS를 1시간 동안 처리하였다. 일차 항체로는 cytokeratin 8/18 (Santa Cruz Biotech., CA, USA)과 vimentin (chemicon, CA, USA)을 1:100으로 희석하여 1시간 동안 처리하였으며, PBS로 수세한 후에 이차 항체로는 FITC conjugated antimouse IgG (Zymed Lab. Inc., CA, USA)을 1:100으로 희석하여 1시간 동안 처리하였다. 염색된 시료는 anti-fade mounting medium (Fisher Scientific, PA, USA)을 이용해 봉입하고 형광현미경으로 관찰하였다.
배양 중인 기질세포들 가운데 증식 능력이 확인되고 기질세포의 비율이 95% 이상인 세포주를 선별하여 본 실험에 사용하였다. 혈청에 존재하는 여러 가지 물질들의 영향을 배제하기 위해 FBS를 첨가하지 않은 기본배양액에 insulin, estradiol, progesterone을 첨가하여 4~5일 정도 배양한 후에 FSH를 처리하였다. 대조군은 FSH를 첨가하지 않은 배양액에서 배양하였으며, 실험군은 rFSH (Puregon; Organon, Netherlands)와 uFSH (Metrodin HP; Serono, Switzerland)을 각각 10, 100, 1,000 mIU/ml의 농도로 첨가하여 12, 24, 48시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
본 연구에서는 자궁 기질세포를 체외배양하는 과정에서 rFSH와 uFSH를 처리하고 이들이 착상 관련 유전자의 발현 양상에 어떠한 영향을 주는 가를 살펴보았다. PR, ER-α/β, Cox-2, LIF, HoxA10-1/-2 등과 같이 착상과정과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 유전자들을 대상으로 하였다. 대부분의 유전자들의 발현 양은 FSH의 처리 시간에 따라 증가하였으며, 농도와는 크게 관련이 없는 것으로 나타났다.
배양 중인 기질세포들 가운데 증식 능력이 확인되고 기질세포의 비율이 95% 이상인 세포주를 선별하여 본 실험에 사용하였다. 혈청에 존재하는 여러 가지 물질들의 영향을 배제하기 위해 FBS를 첨가하지 않은 기본배양액에 insulin, estradiol, progesterone을 첨가하여 4~5일 정도 배양한 후에 FSH를 처리하였다.
데이터처리
예비 실험을 통해 각각의 primer에 대한 real time PCR 조건을 최적화하였으며, internal control 유전자로는 β-actin을 이용하여 2-∆∆Ct 방법으로 대조군에 대한 상대적인 정량분석을 실시하였다.18 통계적인 분석은 Student's t-test를 이용하여 p 값이 0.05 보다 작은 경우에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
자궁 조직으로부터의 기질세포의 분리 및 배양은 Julia 등과 홍 등이 보고한 방법을 이용하였다.16,17 자궁의 이상이 아닌 다른 원인으로 자궁적출술을 시행하는 환자의 자궁 조직에서 일부의 조직 (2×3 cm)을 절개한 후 기본배양액 (M199/F-12 medium; Gibco Life Technologies, MD, USA)으로 수세하였다.
성능/효과
본 연구에서는 세포의 체외배양액에 일반적으로 첨가하는 혈청 성분인 FBS를 첨가하지 않았기 때문에 보다 직접적인 FSH의 영향을 관찰할 수 있었지만, 자궁 기질세포의 계대배양 과정에서 관찰된 형태적인 변화와 유전자 발현 또는 생리학적 특성의 변화와의 관련성을 배제하기는 어려운 것 같다. 결론적으로, rFSH와 uFSH의 처리에 의해 체외 배양 중인 자궁 기질세포에서 착상 관련 유전자 발현 양상이 변화되었으며, 이러한 변화는 착상 과정에 좋지 않은 영향을 주지는 않을 것으로 사료된다. 본 연구를 기초로 in vivo 상태에서 과량의 FSH에 의한 자궁의 변화에 대한 연구가 수행되면, 인간 배아의 착상과정에서 발생할 수 있는 여러 가지 문제점을 해결하는데 중요한 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
PR, ER-α/β, Cox-2, LIF, HoxA10-1/-2 등과 같이 착상과정과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 유전자들을 대상으로 하였다. 대부분의 유전자들의 발현 양은 FSH의 처리 시간에 따라 증가하였으며, 농도와는 크게 관련이 없는 것으로 나타났다. 그리고 rFSH와 uFSH의 처리군에서 대부분 유사한 발현 양상의 변화를 보여주었다 (Figure 2).
Real time RT-PCR 방법으로 분석한 FSH 처리에 따른 착상 관련 유전자 발현 양상은 Figure 2에 나타내었다. 대조군에 비해 1,000 mIU/ml의 FSH 처리군을 제외한 모든 실험군에서 착상 관련 유전자 들의 발현 양이 증가하였으며, 그 양상은 rFSH와 uFSH에서 유사하게 나타났다. 그 증가가 3배 이하인 양상을 나타낸 유전자로는 PR, ER-β와 HoxA10-1/-2가 있었으며, 5배 이상 증가한 유전자로는 Cox2가 관찰되었다.
시간이 지남에 따라 그 효과가 감소한 것은 LH-R의 발현양이 상대적으로 낮기 때문에 대부분의 LH-R들이 포화되어 이러한 경향이 나타난 것으로 생각된다. 본 연구에서 관찰된 rFSH에 의한 Cox-2 유전자의 발현 증가는 자궁 기질세포에 CG를 처리하면 progesterone과의 상승작용으로 탈락막 현상과 Cox-2 유전자의 발현이 증가한다는 보고와 유사한 기작을 통해 유발된 것으로 생각된다.10,11
분석 대상 유전자 중에서 PR 유전자의 발현 양은 거의 증가하지 않았는데, 이는 일반적인 FSH의 특징 중의 하나인 난포 성장 및 성숙과정에서의 estrogen 관련 대사의 활성화와 ER 유전자의 발현 증가와 관련이 있을 것으로 생각된다. 착상과정에서 가장 중요한 유전자 중의 하나로 알려져 있는 LIF의 발현이 10 mIU/ml의 uFSH 12시간 처리군에서 통계적으로 유의하게 증가하였는데, 이는 uFSH에 포함되어 있는 LH성분에 의해 나타난 현상으로 사료된다.
자궁 조직으로부터 분리한 자궁 기질세포는 계대 배양 과정에서 초기에는 다각형의 형태를 나타내다가 계대가 지남에 따라 방추사형의 세포들로 그 형태가 변화되었다 (Figure 1). 이들의 특성을 확인하기 위해 기질세포에 특이적인 vimentin에 대한 세포면역화학 염색법을 실시하여 95% 이상의 세포들이 기질세포임을 확인하였다 (Figure 1). 또한, 배양 중인 기질세포에서 FSH-R와 LH-R의 발현을 RTPCR 방법으로 확인하였다 (data not shown).
후속연구
결론적으로, rFSH와 uFSH의 처리에 의해 체외 배양 중인 자궁 기질세포에서 착상 관련 유전자 발현 양상이 변화되었으며, 이러한 변화는 착상 과정에 좋지 않은 영향을 주지는 않을 것으로 사료된다. 본 연구를 기초로 in vivo 상태에서 과량의 FSH에 의한 자궁의 변화에 대한 연구가 수행되면, 인간 배아의 착상과정에서 발생할 수 있는 여러 가지 문제점을 해결하는데 중요한 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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