시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 음식물 섭취와 에너지 대사를 조절한다는 것이 보고된 이후로, 최근 생쥐의 난소와 자궁에서도 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 그러나 생식기관에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떻게 조절되는지는 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 생쥐의 생식기관 중 자궁에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떠한 경로를 통하여 조절되는지를 알아보고자 난소를 제거한 암컷 생쥐에 성선자극호르몬과 $17{\beta}$-estradiol을 각각 투여한 후 nesfatin-1/NUCB2 발현 정도를 조사하였다. 먼저 자궁 내 NUCB2 mRNA 발현을 conventional PCR과 real-time PCR 방법으로 확인하였으며, 아울러 western blot 방법으로 nesfatin-1 단백질의 발현을 관찰하였다. Nesfatin-1 단백질 발현 위치 및 결합 부위를 조사하기 위하여 면역조직화학염색을 수행한 결과, nesfatin-1 단백질은 자궁내막과 자궁샘을 둘러싼 상피세포에서 발현되었으며, nesfatin-1 단백질 결합 부위는 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 호중구를 포함하는 특정 과립세포에서 관찰되었다. 난소를 제거한 암컷 생쥐에 성선자극호르몬을 투여한 결과, 자궁 내 NUCB2 mRNA 발현량은 대조군과 성선자극호르몬 투여군 사이에 차이가 없었으나, 같은 방법으로 난소를 제거한 암컷 생쥐에 $17{\beta}$-estradiol을 투여한 결과, 대조군보다 $17{\beta}$-estradiol 투여군에서 NUCB2 mRNA 발현량이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 자궁 내 nesfatin-1 단백질의 발현량 또한 NUCB2 mRNA 발현 양상과 유사하게 $17{\beta}$-estradiol 투여군에서 발현량이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과, 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬에 의해 조절 받기보다는 난소에서 분비되는 $17{\beta}$-estradiol에 의해 조절 받는다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과는 발정 주기에 따른 혈액 내 $17{\beta}$-estradiol 농도의 변화가 자궁 내 nesfatin-1 발현을 조절함으로써 nesfatin-1이 자궁내막 발달과 착상을 조절할 수 있는 국부조절인자로 작용할 수 있음을 제시하고 있다.
시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 음식물 섭취와 에너지 대사를 조절한다는 것이 보고된 이후로, 최근 생쥐의 난소와 자궁에서도 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 그러나 생식기관에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떻게 조절되는지는 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 생쥐의 생식기관 중 자궁에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떠한 경로를 통하여 조절되는지를 알아보고자 난소를 제거한 암컷 생쥐에 성선자극호르몬과 $17{\beta}$-estradiol을 각각 투여한 후 nesfatin-1/NUCB2 발현 정도를 조사하였다. 먼저 자궁 내 NUCB2 mRNA 발현을 conventional PCR과 real-time PCR 방법으로 확인하였으며, 아울러 western blot 방법으로 nesfatin-1 단백질의 발현을 관찰하였다. Nesfatin-1 단백질 발현 위치 및 결합 부위를 조사하기 위하여 면역조직화학염색을 수행한 결과, nesfatin-1 단백질은 자궁내막과 자궁샘을 둘러싼 상피세포에서 발현되었으며, nesfatin-1 단백질 결합 부위는 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 호중구를 포함하는 특정 과립세포에서 관찰되었다. 난소를 제거한 암컷 생쥐에 성선자극호르몬을 투여한 결과, 자궁 내 NUCB2 mRNA 발현량은 대조군과 성선자극호르몬 투여군 사이에 차이가 없었으나, 같은 방법으로 난소를 제거한 암컷 생쥐에 $17{\beta}$-estradiol을 투여한 결과, 대조군보다 $17{\beta}$-estradiol 투여군에서 NUCB2 mRNA 발현량이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 자궁 내 nesfatin-1 단백질의 발현량 또한 NUCB2 mRNA 발현 양상과 유사하게 $17{\beta}$-estradiol 투여군에서 발현량이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과, 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬에 의해 조절 받기보다는 난소에서 분비되는 $17{\beta}$-estradiol에 의해 조절 받는다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과는 발정 주기에 따른 혈액 내 $17{\beta}$-estradiol 농도의 변화가 자궁 내 nesfatin-1 발현을 조절함으로써 nesfatin-1이 자궁내막 발달과 착상을 조절할 수 있는 국부조절인자로 작용할 수 있음을 제시하고 있다.
Since nesfatin-1/NUCB2 involved in the control of appetite and energy metabolism was discovered for the first time in hypothalamus, many reports have shown its expression in various tissues. We also recently demonstrated that nesfatin-1/NUCB2 was expressed in the reproductive organs of mouse. Howeve...
Since nesfatin-1/NUCB2 involved in the control of appetite and energy metabolism was discovered for the first time in hypothalamus, many reports have shown its expression in various tissues. We also recently demonstrated that nesfatin-1/NUCB2 was expressed in the reproductive organs of mouse. However, no data exist on nesfatin-1/NUCB2 expression, regulation, and secretion in the uterus. Therefore, we examined the expression of nesfatin-1/NUCB2 in mouse uterus and the effects of PMSG and estrogen on its expression. NUCB2 mRNA expression in the uterus was determined by conventional and real-time PCR and nesfatin-1 protein expression was detected by western blotting. In immunohistochemistry staining, nesfatin-1 protein was localized at the epithelial cells of the uterine glands and endometrium. Nesfatin-1 protein binding sites were displayed at the epithelial cells of uterine glands and specific granulocytes including neutrophils. Additionally, to examine if the nesfatin-1/NUCB2 expression in the uterus is regulated by gonadotropin or estrogen, ovariectomized mice were treated with PMSG or $17{\beta}$-estradiol. The expression levels of NUCB2 mRNA in the uterus was significantly increased in the control mice after PMSG treatment, but not in the ovariectomized mice. In contrast, NUCB2 mRNA expression was dramatically increased in the ovariectomized mice after treatment with $17{\beta}$-estradiol. We report here for the first time that nesfatin-1/NUCB2 mRNA and protein express in the mouse uterus and its expression is regulated by estrogen secreted from the ovary, but not gonadotropin from the pituitary.
Since nesfatin-1/NUCB2 involved in the control of appetite and energy metabolism was discovered for the first time in hypothalamus, many reports have shown its expression in various tissues. We also recently demonstrated that nesfatin-1/NUCB2 was expressed in the reproductive organs of mouse. However, no data exist on nesfatin-1/NUCB2 expression, regulation, and secretion in the uterus. Therefore, we examined the expression of nesfatin-1/NUCB2 in mouse uterus and the effects of PMSG and estrogen on its expression. NUCB2 mRNA expression in the uterus was determined by conventional and real-time PCR and nesfatin-1 protein expression was detected by western blotting. In immunohistochemistry staining, nesfatin-1 protein was localized at the epithelial cells of the uterine glands and endometrium. Nesfatin-1 protein binding sites were displayed at the epithelial cells of uterine glands and specific granulocytes including neutrophils. Additionally, to examine if the nesfatin-1/NUCB2 expression in the uterus is regulated by gonadotropin or estrogen, ovariectomized mice were treated with PMSG or $17{\beta}$-estradiol. The expression levels of NUCB2 mRNA in the uterus was significantly increased in the control mice after PMSG treatment, but not in the ovariectomized mice. In contrast, NUCB2 mRNA expression was dramatically increased in the ovariectomized mice after treatment with $17{\beta}$-estradiol. We report here for the first time that nesfatin-1/NUCB2 mRNA and protein express in the mouse uterus and its expression is regulated by estrogen secreted from the ovary, but not gonadotropin from the pituitary.
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문제 정의
더 나아가 본 연구에서는 암컷 생쥐의 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떠한 호르몬에 의하여 조절되는지 알아보고자 하였다. 난소를 제거한 암컷 생쥐에 PMSG와 17 βestradiol을 각각 투여한 후, 자궁을 획득하여 nesfatin-1/NUCB2 발현을 조사하였다.
따라서 본 연구에서는 자궁에서 nesfatin-1 발현 여부를 조사하고, nesfatin-1의 결합 부위가 존재하는지를 확인하고자 하였다. 아울러 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬과 난소에서 분비되는 17 β-estradiol을 각각 투여함으로써 어떠한 호르몬이 자궁 내 nesfatin-1 발현을 조절하는지 알아보고자 하였다.
이에 본 연구에서는 ICR 계열 암컷 생쥐의 생식기관인 자궁에서 nesfatin-1/ NUCB2 발현을 확인하고, 자궁 내 nesfatin-1 단백질의 발현 위치와 결합 부위를 확인하였다. 또한 자궁 내 nesfatin-1 발현이 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬에 의해 조절 받는지, 난소에서 분비되는 에스트로겐에 의해 조절 받는지를 조사함으로써 nesfatin-1이 암컷 생쥐의 생식 기능에 미칠수 있는 가능성을 확인하고자 하였다.
아울러 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬과 난소에서 분비되는 17 β-estradiol을 각각 투여함으로써 어떠한 호르몬이 자궁 내 nesfatin-1 발현을 조절하는지 알아보고자 하였다.
, 2010). 이와 관련하여, 본 연구에서 확인된 자궁 내 NUCB2 mRNA의 발현이 어떠한 의미를 가지고 있는지를 알아보기 위하여, 자궁내 nesfatin-1 단백질의 발현 부위를 조사하였다. Nesfatin-1항체를 이용하여 면역조직화학염색법으로 자궁 내 nesfatin-1단백질의 발현 부위를 조사한 결과, 자궁내막과 자궁샘을 둘러싼 상피세포에서 주로 관찰되었다.
제안 방법
3개월령 ICR 암컷 생쥐의 난소제거수술을 시행하였다. 각 생쥐의 체중에 따른 마취제를 투여한 후 수술을 시행하였으며, 이틀 후 PMSG 5 unit/100 ㎕(Pregnant mare serum gonadotropin, Sigma, St.
, Burlingame, CA)를 떨어뜨리고 조직의 색 변화를 관찰하면서 10분간 처리하였다. Hematoxlin(Sigma, St. Louis, MO)으로 염색한 후, 탈수를 위해 70%, 80%, 95%, 100% ethanol과 xylene을 처리하였다. Permount(Thermo Fisher Scientific Inc.
ICR 계열 암컷 생쥐에서 획득한 자궁을 4% Paraformaldehyde 용액에 넣어 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 자궁 조직을 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에 각각 30분씩 순차적으로 담가둔 후, 100% ethanol에 넣어 24시간 동안 보관하였다.
Membrane을 ponceau-S로 염색하고 헹궈낸 다음, 3% Casein/PBS Blocking Solution(KOMABIOTECH, Korea)으로 실온에서 2시간 처리한 후 rabbit anti-rat nesfatin-1 antibody(Phoenix Pharmaceuticals, INC., Burlingame, CA)와 anti-mouse βactin antibody(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Paso Robles, CA)로 실온에서 한 시간 처리하였다.
Louis, MO)(1 ㎍/㎖) 염색을 진행하였다. Mounting(Vector laboratories, INC., Burlingame, CA) 용액을 떨어뜨린 후 커버글라스로 덮고, 형광현미경(Axioskop2, CarlZeiss, Germany)으로 자궁 내 nesfatin-1 단백질의 결합 부위 존재 여부 및 위치를 관찰하였다.
Louis, MO)으로 염색한 후, 탈수를 위해 70%, 80%, 95%, 100% ethanol과 xylene을 처리하였다. Permount(Thermo Fisher Scientific Inc., Watham, MA) 용액을 떨어뜨린 후 커버글라스로 덮고, 광학현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 nesfatin-1 단백질이 자궁의 어느 위치에서 발현하는지를 관찰하였다.
3개월령 ICR 암컷 생쥐의 난소제거수술을 시행하였다. 각 생쥐의 체중에 따른 마취제를 투여한 후 수술을 시행하였으며, 이틀 후 PMSG 5 unit/100 ㎕(Pregnant mare serum gonadotropin, Sigma, St. Louis, MO)을 복강 투여하고, 약 24시간 후의 자궁을 획득하였다. 한편, 난소제거수술 2주 후에 난소를 제거한 생쥐와 난소제거수술을 하지 않은 생쥐에 17 β-estradiol 30 ng/100 ㎕(Sigma, St.
5주령 ICR 계열 암컷 생쥐에서 시상하부, 뇌하수체, 위, 난소, 자궁을 획득하였다. 각 조직에 RNA isoplus(TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 300 ㎕를 첨가하고 조직분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 조직은 상온에서 5분간 방치하고 원심분리한 다음(14,000 rpm, 4℃, 20분), 상등액을 새 시험관에 옮겼다.
각 조직으로부터 RNA를 추출하여 RT PCR(reverse transcription PCR) 방법으로 cDNA를 합성한 다음, β-actin(forward 5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'; reverse 5'-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3')과 NUCB2(forward 5'-TTTGAACACCTGAACCACCA-3'; reverse 5'-TGGTCTTCGTGCTTCCTCTT-3') primer(BIONICS, Korea)를 이용한 conventional PCR을 실시하여 NUCB2 mRNA 발현 여부를 확인하였다.
ICR 계열 암컷 생쥐에서 획득한 자궁을 4% Paraformaldehyde 용액에 넣어 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 자궁 조직을 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에 각각 30분씩 순차적으로 담가둔 후, 100% ethanol에 넣어 24시간 동안 보관하였다. 보관한 자궁 조직을 1차 xylene, 2차 xylene에 각각 1시간씩 담아두고, 이어 xlyene과 파라핀(50%:50%) 혼합 용액에 2시간, 100% 파라핀 용액에 2시간 동안 담가두었다.
난소를 제거한 암컷 생쥐에 PMSG와 17 βestradiol을 각각 투여한 후, 자궁을 획득하여 nesfatin-1/NUCB2 발현을 조사하였다.
, 2007), 아직까지 nesfatin-1 수용체의 정확한 구조와 기능은 밝혀지지 않고 있다. 따라서 현재로써는 nesfatin-1 단백질 수용체의 항체를 이용하여 nesfatin-1의 결합 부위를 확인하는 것은 불가능하므로, 본 연구에서는 이를 대신하여 FITCconjugated nesfatin-1을 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색 결과, 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 특정 과립세포에 nesfatin-1이 결합되는 것을 확인할 수 있었다.
2). 또한 자궁 내에서 nesfatin-1 단백질이 결합하는 부위가 어디인지를 확인하기 위하여 자궁 조직 절편에 형광 표식자가 부착된 nesfatin-1을 이용하여 염색을 수행하였다. 염색 결과, 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 호중구를 포함하는 특정 과립세포에서 nesfatin-1 단백질 결합 부위가 존재함을 확인할 수 있었다(Fig.
, Burlingame, CA)를 떨어뜨리고 필름으로 덮어 1시간 동안 반응시켰다. 반복 세척 후, biotinylated goat anti-rabbit IgG(Vector laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 떨어뜨리고 필름으로 덮어 30분 동안 반응시킨 다음, ABC Elite(Strepavidin-HRP)(Vector laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 떨어뜨리고 조직의 색 변화를 관찰하면서 10분간 처리하였다. Hematoxlin(Sigma, St.
생쥐 자궁에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 먼저 conventional PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현 여부를 조사하였다. 자궁을 포함한 분석한 모든 기관, 즉 시상 하부, 뇌하수체, 위, 난소에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인할 수 있었다(Fig.
위 방법으로 준비한 자궁의 조직 절편을 가지고 면역조직 화학염색 방법으로 nesfatin-1 단백질의 발현 위치를 조사하였다. 조직 절편을 100% xlyene, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol로 3분씩 처리한 후 흐르는 물로 세척하였다.
, Paso Robles, CA)로 실온에서 한 시간 처리하였다. 이어 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Paso Robles, CA)와 donkey anti-mouse IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Paso Robles, CA)로 각각 한 시간 동안 처리한 후, ECL plus Western Blotting Detection Reagents(Amersham; GE health-care, Buckinghamshire, England)를 이용하여 상대적인 단백질 발현량을 확인하였다.
, 2011). 이에 본 연구에서는 ICR 계열 암컷 생쥐의 생식기관인 자궁에서 nesfatin-1/ NUCB2 발현을 확인하고, 자궁 내 nesfatin-1 단백질의 발현 위치와 결합 부위를 확인하였다. 또한 자궁 내 nesfatin-1 발현이 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬에 의해 조절 받는지, 난소에서 분비되는 에스트로겐에 의해 조절 받는지를 조사함으로써 nesfatin-1이 암컷 생쥐의 생식 기능에 미칠수 있는 가능성을 확인하고자 하였다.
위 방법으로 준비한 자궁의 조직 절편을 가지고 면역조직 화학염색 방법으로 nesfatin-1 단백질의 발현 위치를 조사하였다. 조직 절편을 100% xlyene, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol로 3분씩 처리한 후 흐르는 물로 세척하였다. 세척된 자궁 조직은 증류수와 PBS buffer에 각각 5분씩 넣어둔 다음, peroxidase Blocking Reagent(Dako, Glostrup, Denmark)로 10분간 반응시켰다.
시험관에 남아있는 ethanol을 제거하고 DEPC(TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 20 ㎕를 넣어준 상태로 약 1분간 섞은 후 냉동 보관하였다. 추출한 total RNA의 양은 Nano-drop(Thermo Fisher Scientific Inc., Watham, MA)을 이용하여 측정하였다. 각 조직으로부터 RNA를 추출하여 RT PCR(reverse transcription PCR) 방법으로 cDNA를 합성한 다음, β-actin(forward 5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'; reverse 5'-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3')과 NUCB2(forward 5'-TTTGAACACCTGAACCACCA-3'; reverse 5'-TGGTCTTCGTGCTTCCTCTT-3') primer(BIONICS, Korea)를 이용한 conventional PCR을 실시하여 NUCB2 mRNA 발현 여부를 확인하였다.
한편, 난소제거수술 2주 후에 난소를 제거한 생쥐와 난소제거수술을 하지 않은 생쥐에 17 β-estradiol 30 ng/100 ㎕(Sigma, St. Louis, MO)을 투여하고, 약 24시간 후 자궁을 획득하였다.
한편, 자궁 조직 절편을 가지고 nesfatin-1 단백질의 결합 부위를 조사하였다. 파라핀을 제거한 후, 증류수와 PBS buffer에 각각 5분씩 넣어둔 다음 FITC-conjugated nesfatin-1(Phoenix Pharmaceuticals, INC.
대상 데이터
5주령 ICR 계열 암컷 생쥐에서 시상하부, 뇌하수체, 위, 난소, 자궁을 획득하였다. 각 조직에 RNA isoplus(TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 300 ㎕를 첨가하고 조직분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
대조유전자로는 18S(forward 5'-GT CTGTGATGCCCTTAGATG-3'; reverse 5'-AGCTTATGACCCGCACTTAC-3')를 사용하였고, 18S 유전자의 발현 정도를 기준으로 NUCB2 유전자의 상대적인 발현량을 계산하였다.
데이터처리
각 실험군 당 다섯 마리의 생쥐를 사용하였으며, 모든 유전자의 발현 정도는 평균±표준오차로 표시하였다.
각 실험군 당 다섯 마리의 생쥐를 사용하였으며, 모든 유전자의 발현 정도는 평균±표준오차로 표시하였다. 통계학적 유의성 검정은 student t-test와 one-way ANOVA, Tukey test 방법을 사용하였으며, 대조군과 실험군을 비교하여 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
Nesfatin-1/NUCB2 발현이 생식선자극호르몬과 17 β-estradiol에 영향을 받는지 알아보기 위하여 난소를 제거한 쥐에 각각 PMSG와 17 β-estradiol을 투여하고 24시간 후 자궁에서 NUCB2 mRNA 발현을 real-time PCR 방법으로 조사하였으며, nesfatin-1 단백질 발현을 western blot 방법으로 관찰하였다.
먼저 난소와 자궁을 포함한 생쥐의 다양한 기관에서 conventional PCR과 real-time PCR 방법으로 NUCB2 유전자의 발현을 확인한 결과, 분석한 모든 기관에서 NUCB2 mRNA가 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 각 기관에서 발현되는 nesfatin-1/NUCB2 양을 conventional PCR 방법으로 정확히 분석하기에는 문제가 있으므로, 이를 해결하기 위하여 real-time PCR 방법과 western blot 방법으로 각 기관에서 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질 발현을 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 자궁에서 뇌하수체만큼 다량의 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
036 g EDTA, 100 ㎕ Tween20, 100mM PMSF) 300 ㎕를 넣고 분쇄 후, 원심분리하였다(14,000 rpm, 4℃, 20분). 추출한 단백질 양은 BCA 단백질 정량법을 통해 SpectraMax M3 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 측정하였다. 정량한 단백질은 5% mercaptoethanol, 5X SDS sample loading buffer와 섞어 95℃에서 5분간 끓였다.
이와 관련하여, 본 연구에서 확인된 자궁 내 NUCB2 mRNA의 발현이 어떠한 의미를 가지고 있는지를 알아보기 위하여, 자궁내 nesfatin-1 단백질의 발현 부위를 조사하였다. Nesfatin-1항체를 이용하여 면역조직화학염색법으로 자궁 내 nesfatin-1단백질의 발현 부위를 조사한 결과, 자궁내막과 자궁샘을 둘러싼 상피세포에서 주로 관찰되었다. 자궁 내 상피세포에서 발현되는 nesfatin-1 단백질이 자궁 기능에 어떠한 영향을 미치는 지는 아직 알 수 없으나, nesfatin-1이 자궁 전반에 걸쳐 발현되는 것으로 보아 자궁의 기능 조절에 국부조절인자로 관여할 것으로 사료된다.
난소를 제거한 암컷 생쥐에 PMSG와 17 βestradiol을 각각 투여한 후, 자궁을 획득하여 nesfatin-1/NUCB2 발현을 조사하였다. 그 결과, 난소를 제거한 다음 PMSG를 투여한 암컷 생쥐의 경우에는 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 대조군과 비교하였을 때 거의 변화하지 않음을 확인할 수 있었다. 동일한 방법으로 난소를 제거한 암컷 생쥐에 17 β-estradiol을 투여한 후 자궁의 nesfatin-1/NUCB2 발현을 확인한 결과, 난소를 제거한 암컷 생쥐의 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가하는 것을 관찰하였다.
그러나 각 기관에서 발현되는 nesfatin-1/NUCB2 양을 conventional PCR 방법으로 정확히 분석하기에는 문제가 있으므로, 이를 해결하기 위하여 real-time PCR 방법과 western blot 방법으로 각 기관에서 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질 발현을 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 자궁에서 뇌하수체만큼 다량의 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 앞선 연구에서 보고된 바와 같이, 암컷 생쥐의 생식기관인 난소와 자궁에서 nesfatin-1/NUCB2가 발현되고, 그 결합부위가 난소 내에 존재한다는 사실을 통하여 nesfatin-1이 생식기능을 조절할 수 있는 국부조절인자로써 중요한 역할을 할 것이라고 판단할 수 있었다(Kim et al.
더 나아가 난소제거수술을 한 암컷 생쥐에게 성선자극호르몬과 17 β-estradiol을 투여한 결과, 성선자극호르몬은 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현에 영향을 미치지 못했으나, 17 β-estradiol을 투여한 경우 nesfatin-1/ NUCB2의 발현이 유의하게 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
동일한 방법으로 난소를 제거한 암컷 생쥐에 17 β-estradiol을 투여한 후 자궁의 nesfatin-1/NUCB2 발현을 확인한 결과, 난소를 제거한 암컷 생쥐의 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가하는 것을 관찰하였다.
먼저 난소와 자궁을 포함한 생쥐의 다양한 기관에서 conventional PCR과 real-time PCR 방법으로 NUCB2 유전자의 발현을 확인한 결과, 분석한 모든 기관에서 NUCB2 mRNA가 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 각 기관에서 발현되는 nesfatin-1/NUCB2 양을 conventional PCR 방법으로 정확히 분석하기에는 문제가 있으므로, 이를 해결하기 위하여 real-time PCR 방법과 western blot 방법으로 각 기관에서 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질 발현을 정량적으로 분석하였다.
본 연구 결과, ICR 계열 암컷 생쥐의 생식기관인 자궁에서 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 것을 처음으로 밝혔으며 또한, nesfatin-1 단백질과 그 결합 부위가 자궁 내에 존재한다는 것을 확인하였다. 더 나아가 난소제거수술을 한 암컷 생쥐에게 성선자극호르몬과 17 β-estradiol을 투여한 결과, 성선자극호르몬은 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현에 영향을 미치지 못했으나, 17 β-estradiol을 투여한 경우 nesfatin-1/ NUCB2의 발현이 유의하게 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
1B). 아울러, real-time PCR 방법으로 각 기관에서 NUCB2 mRNA 발현량을 분석한 결과에서도 nesfatin-1 단백질 발현 양상과 유사함을 확인하였다(Fig. 1C).
따라서 현재로써는 nesfatin-1 단백질 수용체의 항체를 이용하여 nesfatin-1의 결합 부위를 확인하는 것은 불가능하므로, 본 연구에서는 이를 대신하여 FITCconjugated nesfatin-1을 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색 결과, 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 특정 과립세포에 nesfatin-1이 결합되는 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 이러한 특정 과립세포를 확대 관찰한 결과, 이들이 호중구임을 확인할 수 있었다(본 연구 결과에 포함되지 않았음).
또한 자궁 내에서 nesfatin-1 단백질이 결합하는 부위가 어디인지를 확인하기 위하여 자궁 조직 절편에 형광 표식자가 부착된 nesfatin-1을 이용하여 염색을 수행하였다. 염색 결과, 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 호중구를 포함하는 특정 과립세포에서 nesfatin-1 단백질 결합 부위가 존재함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
, 2001). 이러한 발정주기에 따른 자궁 내 nesfatin-1/ NUCB2 발현량의 변화를 분석한 결과, 각 시기에 따라 nesfatin-1의 발현이 유의하게 차이가 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 에스트로겐이 높은 시기인 발정기에서 nesfatin-1/NUCB2 발현량이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다(본 연구 결과에 포함되지 않았음).
더 나아가 난소제거수술을 한 암컷 생쥐에게 성선자극호르몬과 17 β-estradiol을 투여한 결과, 성선자극호르몬은 자궁 내 nesfatin-1/NUCB2 발현에 영향을 미치지 못했으나, 17 β-estradiol을 투여한 경우 nesfatin-1/ NUCB2의 발현이 유의하게 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 자궁에서 nesfatin-1/NUCB2의 발현은 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬에 의해 조절 받기보다는 난소에서 분비되는 17 β-estradiol에 의해 직접적인 영향을 받는다는 사실을 밝혔다. 이러한 결과는 발정 주기에 따른 혈액 내 17 β-estradiol 농도의 변화가 자궁 내 nesfatin-1 발현을 조절함으로써 nesfatin-1이 자궁내막 발달과 착상을 조절할 수 있는 국부조절인자로 작용할 수 있음을 제시하고 있다.
이상의 결과에서 NUCB2 mRNA와 nesfatin-1 단백질이 자궁 내에서 발현된다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 nesfatin-1단백질이 자궁에 기능적으로 작용하기 위해서는 nesfatin-1 단백질이 그 수용체와 결합할 수 있어야 한다.
자궁 내 nesfatin-1 단백질 발현 부위를 확인하기 위하여 자궁 조직 절편을 이용하여 면역조직화학염색법으로 염색을 수행한 결과, nesfatin-1 단백질은 자궁내막과 자궁샘을 둘러싼 상피세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 또한 자궁 내에서 nesfatin-1 단백질이 결합하는 부위가 어디인지를 확인하기 위하여 자궁 조직 절편에 형광 표식자가 부착된 nesfatin-1을 이용하여 염색을 수행하였다.
생쥐 자궁에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 먼저 conventional PCR 방법으로 NUCB2 mRNA 발현 여부를 조사하였다. 자궁을 포함한 분석한 모든 기관, 즉 시상 하부, 뇌하수체, 위, 난소에서 NUCB2 유전자의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 1A). 한편, western blot 방법으로 자궁에서 nesfatin-1 단백질의 발현을 확인한 결과, 뇌하수체와 난소 및 자궁을 포함하는 생식기관에서 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, 특히 난소에서보다 자궁에서 뇌하수체만큼 다량의 nesfatin-1 단백질이 발현하고 있음을 관찰할 수 있었다(Fig.
1A). 한편, western blot 방법으로 자궁에서 nesfatin-1 단백질의 발현을 확인한 결과, 뇌하수체와 난소 및 자궁을 포함하는 생식기관에서 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, 특히 난소에서보다 자궁에서 뇌하수체만큼 다량의 nesfatin-1 단백질이 발현하고 있음을 관찰할 수 있었다(Fig. 1B). 아울러, real-time PCR 방법으로 각 기관에서 NUCB2 mRNA 발현량을 분석한 결과에서도 nesfatin-1 단백질 발현 양상과 유사함을 확인하였다(Fig.
염색 결과, 자궁샘을 둘러싼 상피세포와 특정 과립세포에 nesfatin-1이 결합되는 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 이러한 특정 과립세포를 확대 관찰한 결과, 이들이 호중구임을 확인할 수 있었다(본 연구 결과에 포함되지 않았음). 호중구는 자궁내막의 붕괴와 회복에 중요한 기능을 하는 세포로써(Kaitu'u-Lino et al.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
nesfatin-1/NUCB2는 무엇을 조절하는가?
시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 음식물 섭취와 에너지 대사를 조절한다는 것이 보고된 이후로, 최근 생쥐의 난소와 자궁에서도 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 그러나 생식기관에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떻게 조절되는지는 알려져 있지 않다.
nesfatin-1/NUCB2는 어디서 생성되는가?
시상하부에서 생성되는 nesfatin-1/NUCB2가 음식물 섭취와 에너지 대사를 조절한다는 것이 보고된 이후로, 최근 생쥐의 난소와 자궁에서도 다량의 nesfatin-1/NUCB2가 발현된다는 사실이 새롭게 밝혀졌다. 그러나 생식기관에서 nesfatin-1/NUCB2 발현이 어떻게 조절되는지는 알려져 있지 않다.
nucleobindin 단백질 NUCB2의 특징은 무엇인가?
, 1992). NUCB2는 전사 후 과정을 거치면서 pro-hormone convertase (PC)-1/3에 의해 nesfatin-1, nesfatin-2, nesfatin-3가 만들어지며, 현재까지는 nesfatin-1에 대한 생리학적 기능만이 밝혀져 있다(Oh-I et al., 2006).
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