심혈관질환과 관련이 있다고 보고되고 있는 치주질환 원인 세균들 Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia 및 Actinobacillus actinomycetemcomitans의 검출빈도를 조사하였다. 조선대학교 치과대학병원 보철과에 내원한 상하악 중 한 악에 잔존 치아가 1개 이상 있고, 그 반대편 악에 의치를 장착하고 있는 11명의 환자와 잔존치아가 전혀 없는 4명의 총의치 환자를 대상으로 의치의 관리 정도와 의치 표면 세균막에 심혈관 질환과 관련 이 있다고 보고된 치주질환 원인균의 검출 빈도를 조사하였다. 연구 결과 상악과 하악 한쪽만 총의치이고, 반대편 악에는 치아가 있는 환자의 의치 표면세균막에서 치면세균막 및 의치 표면 세균막에서 P. gingivalis와 T. forsythia가 91％(10/11)검출되었다. 또한 무치악 환자의 의치 표면 세균막에서 P. gingivalis와 T.forsythia가 각각 25％(1/4), 75％(3/4)색 검출되었다. 하지만, 총의치의 장착 정도, 1일 세척횟수 및 세척방법에 따른 4가지 치주질환 원인세균종에 대한 검출빈도를 조사한 결과 이들 간의 별다른 상관관계를 찾을 수 없었다. 이상의 연구결과로 의치 표면 세균막에도 혐기성 세균인 P. gingivalis 및 T.forsythia가 존재함을 알 수 있었으며, 면역력이 약화되어 있거나, 기존의 심혈관 질환을 가지고 있는 환자의 경우, 의치의 부적절한 관리 및 구강 연조직 손상으로 인한 심혈관 질환의 유발 또는 악화가 초래될 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.
심혈관질환과 관련이 있다고 보고되고 있는 치주질환 원인 세균들 Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia 및 Actinobacillus actinomycetemcomitans의 검출빈도를 조사하였다. 조선대학교 치과대학병원 보철과에 내원한 상하악 중 한 악에 잔존 치아가 1개 이상 있고, 그 반대편 악에 의치를 장착하고 있는 11명의 환자와 잔존치아가 전혀 없는 4명의 총의치 환자를 대상으로 의치의 관리 정도와 의치 표면 세균막에 심혈관 질환과 관련 이 있다고 보고된 치주질환 원인균의 검출 빈도를 조사하였다. 연구 결과 상악과 하악 한쪽만 총의치이고, 반대편 악에는 치아가 있는 환자의 의치 표면세균막에서 치면세균막 및 의치 표면 세균막에서 P. gingivalis와 T. forsythia가 91％(10/11)검출되었다. 또한 무치악 환자의 의치 표면 세균막에서 P. gingivalis와 T.forsythia가 각각 25％(1/4), 75％(3/4)색 검출되었다. 하지만, 총의치의 장착 정도, 1일 세척횟수 및 세척방법에 따른 4가지 치주질환 원인세균종에 대한 검출빈도를 조사한 결과 이들 간의 별다른 상관관계를 찾을 수 없었다. 이상의 연구결과로 의치 표면 세균막에도 혐기성 세균인 P. gingivalis 및 T.forsythia가 존재함을 알 수 있었으며, 면역력이 약화되어 있거나, 기존의 심혈관 질환을 가지고 있는 환자의 경우, 의치의 부적절한 관리 및 구강 연조직 손상으로 인한 심혈관 질환의 유발 또는 악화가 초래될 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.
The aim of this study is to investigate the detection rate of putative periodontopathogens, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Actiobacillus actinomycetemcomitans, related to cardiovascular diseases(CVD). Plaques were sampled from 15 subjects (4 sites of denture base and/or tooth) w...
The aim of this study is to investigate the detection rate of putative periodontopathogens, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Actiobacillus actinomycetemcomitans, related to cardiovascular diseases(CVD). Plaques were sampled from 15 subjects (4 sites of denture base and/or tooth) with sterilized explorers and were transported in IX PBS. The detection of periodontopathogens was performed by polymerase chain reaction with species-specific primers based on 16S rDNA. The PCR products were cloned into pGEM-T easy vector and its nucleotides were sequenced in order to confirm the specificity. Our data showed that the detection rate of P. gingivalis and T forsythia in denture base of edentulous patients was 25％ and 75％, respectively. And the detection rate of P. gingivalis and T.forsythia in denture base of patient having one more tooth was 91％. The results indicate that plaque of denture base may serve as reservoirs of oral bacteria related to CVD.
The aim of this study is to investigate the detection rate of putative periodontopathogens, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Actiobacillus actinomycetemcomitans, related to cardiovascular diseases(CVD). Plaques were sampled from 15 subjects (4 sites of denture base and/or tooth) with sterilized explorers and were transported in IX PBS. The detection of periodontopathogens was performed by polymerase chain reaction with species-specific primers based on 16S rDNA. The PCR products were cloned into pGEM-T easy vector and its nucleotides were sequenced in order to confirm the specificity. Our data showed that the detection rate of P. gingivalis and T forsythia in denture base of edentulous patients was 25％ and 75％, respectively. And the detection rate of P. gingivalis and T.forsythia in denture base of patient having one more tooth was 91％. The results indicate that plaque of denture base may serve as reservoirs of oral bacteria related to CVD.
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문제 정의
nucleatunri: 매개로 하여 집락화될 수 있을 것이며, 의치의 관리 상태에 따라 서식하는 세균 종의 차이도 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 본 연구에서는 의치의 관리상태에 따른 의치 표면 세균막에 심혈관질환과 관련이 있다고 보고되고 있는 P. gingivalis, T. forsythia 및 A. actinomy- cetemcondtans의 검줄빈도를 조사하여 의치 세균막이 이들 세균의 저장소로의 역할을 할 수 있는 지를 알아보고자 한다.
제안 방법
universal PCR primer (27F; 5-AGA GTT TGA TC [A/ C] TGG CTC AG-3', 1492R; 5-TAC GG[C/T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3')와 Seq-Fl (5'-ggA TTA gAT ACC CTg g-3') 프라이머를 이용하여 결정하였고, 그 결과는 SeqMan 프로그램 (Version 5.00; DNASTAR, Madison, USA)으로 염기서열을 분석하였다. 분석된 핵산염기서열은 GenBank 등의 데이터 베이스를 통하여 상동성 검색을 하여 기존에 알려진 4가지 치주질환 원인균들에 대한 각각의 16S rDNA의 염기서열과 98%이상 상동성을 보일 경우 같은 세균 종이라 판정하였다.
forsythia를 검출하기 위해서는 초기 변성은 95℃에서 2분간 시행하고, 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 1분간 재결합, 72℃에서 1분간 핵산 합성의 3 단계를 36회 반복시행하고, 마지막 핵산 합성단계를 72℃에서 10분간 시행하였다. 또한 F. nucleatum 의 검출은 초기 변성은 94℃에서 2분간 시행하고, 94℃에서 1 분간 변성, 65℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 45초간 핵산 합성의 3 단계를 30회 반복시행하고, 마지막 핵산 합성단계를 72℃에서 10분간 시행하였다. 중합효소연쇄반응의 시행 후에 그 반응물을 1.
본 연구에서 사용된 프라이머는 Table 1과 같았고, 중합 효소 연쇄반응은 PCR premix (Bioneer, Daejeon, Korea)와 중합 효소 연쇄 반응기(Model PTC-100, MJ Research Inc., Watertown, U.S.A)를 사용하여 시행하였다. 이때 반응조건은 다음과 같았다.
이때 구강점막조직과 닿는 부분의 치면 세균막을 채취할 때 연조직과 먼저 닿는 부분의 주위가 꼭 포함되도록 하였으며, 최소 4군데 이상에서 채취하였다. 샘플은 실험실로 운반하여 bead beater와 0.1 mm glass bead을 이용하여 phenol/ chloroform/isoamyl alcohol 법을 이용하여 DNA를 주출하였고, 이를 바탕으로 중합효소연쇄반응법을 시행하였다.
중합효소연쇄 반응 증폭물들을 pGEM-T easy vector (Promega, Madison, USA)에 제조회사의 지시에 따라 직접 클로닝하였다. E.
nucleatum 의 검출은 초기 변성은 94℃에서 2분간 시행하고, 94℃에서 1 분간 변성, 65℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 45초간 핵산 합성의 3 단계를 30회 반복시행하고, 마지막 핵산 합성단계를 72℃에서 10분간 시행하였다. 중합효소연쇄반응의 시행 후에 그 반응물을 1.5% 아가로스 젤 상에서 전기영동을 시행하여 예상되는 증폭물의 크기(Table 1)와 비교하여 치주질환 원인균의 존재유무를 결정하였다.
핵산염기서열 결정은 바이오니아사(Bioneer)에 의뢰하여 결정하였다. universal PCR primer (27F; 5-AGA GTT TGA TC [A/ C] TGG CTC AG-3', 1492R; 5-TAC GG[C/T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3')와 Seq-Fl (5'-ggA TTA gAT ACC CTg g-3') 프라이머를 이용하여 결정하였고, 그 결과는 SeqMan 프로그램 (Version 5.
이론/모형
클로닝하였다. E. coll DH5a에 transformation시킨 각각의 재조합된 플라스미드 DNA는 통상의 alkaline lysis법(15)으로 AccuPrep® Plasmid Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 제조회사의 지시대로 추출하였다.
이에 비해 종-특이 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응법은 짧은 시간에 특정 세균의 존재 유무를 알아낼 수 있는 장점이 있다. 이러한 이유에서 본 연구에서도 중합효소연쇄반응법을 4가지 치주질환 원인균의 검출에 이용하였다.
성능/효과
nucleatum이 검출되었지만 의치 표면 세균막에서는 검출이 되지 않았다. A. actinomycetemcomitans의 경우는 1명의 환자에서 검줄되었으며, 이때 치면세균막과 의치 표면 세균막 모두에서 검출되었다.
actinomycetemcomitans에 강한 양성(+) 반응을 보인 샘플을 임의로 선택하여 중합 효소 연쇄 반응 증폭 물을 클로닝하고, 핵산염기서열을 분석한 결과 각각의 세균 종이 맞게 검출된 것을 알 수 있었다(Table 6). 본 연구에서 사용된 두 세균 종에 대한 중합효소연쇄반응 프라이머는 Ashimoto 등(1)에 의해 개발된 것으로써 두 세균 종의 검출 및 동정에 널리 사용되는 것으로 본 연구에서도 두 프라이머 각각의 세균 종에 대한 특이도가 뛰어남을 알 수 있었다.
00; DNASTAR, Madison, USA)으로 염기서열을 분석하였다. 분석된 핵산염기서열은 GenBank 등의 데이터 베이스를 통하여 상동성 검색을 하여 기존에 알려진 4가지 치주질환 원인균들에 대한 각각의 16S rDNA의 염기서열과 98%이상 상동성을 보일 경우 같은 세균 종이라 판정하였다.
상하악 중 한쪽만 의치이고, 반대편 악에는 치아가 있는 환자의 경우, 치면세균막에 4가지 혐기성 치주질환 원인균들이 존재하였고, 반대편 의치의 표면 세균막에서도 각각의 세균이 검출되었다(Table 2 & 4). 즉, P.
forsythia 배양이 까다롭고 치주낭의 깊은 부분에서 서식한다는 사실을 감안한다면 의외의 결과라 할 수 있다. 이러한 이유로 본 연구의 중합효소연쇄반응 결과를 재확인하기 위해 P. gingivalis, T. forsythia 및 A. actinomycetemcomitans에 강한 양성(+) 반응을 보인 샘플을 임의로 선택하여 중합 효소 연쇄 반응 증폭 물을 클로닝하고, 핵산염기서열을 분석한 결과 각각의 세균 종이 맞게 검출된 것을 알 수 있었다(Table 6). 본 연구에서 사용된 두 세균 종에 대한 중합효소연쇄반응 프라이머는 Ashimoto 등(1)에 의해 개발된 것으로써 두 세균 종의 검출 및 동정에 널리 사용되는 것으로 본 연구에서도 두 프라이머 각각의 세균 종에 대한 특이도가 뛰어남을 알 수 있었다.
gingivalis가 관상 및 경동맥 혈관내피세포를 침입(invasion)할 수 있음을 관찰하여 심혈관 질환의 병원성 세균으로 작용가능성을 보고하였다. 이상의 연구 결과들에 의하면, 치주질환 관련 병원성 세균들 중 P. gingivalis가 가장 심혈관질환과 관련성이 많은 것으로 알려져 있다.
이상의 연구결과를 종합하면, 의치 표면 세균막에도 혐기성 세균인 P. gingivalis 및 T. forsythia가 존재함을 알 수 있었으며, 면역력이 약화되어 있거나, 기존의 심혈관 질환을 가지고 있는 환자의 경우, 의치의 부적절한 관리 및 구강 연조직 손상으로 인한 심혈관 질환의 유발 또는 악화가 초래될 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.
2 & 4). 즉, P. gingivalis, F. nucleatum 및 T. forsythia가 10명 환자 치면세균막에서 검출되었고, 이 경우 반대편 악의 의치 표면 세균막에서도 검출되었다. 또한 1명의 환자에서 치면세균막에서 P.
총의치의 장착 정도, 1일 세척 횟수 및 세척 방법에 따른 4가지 치주질환 원인세균 종에 대한 검출빈도를 조사한 결과, 15명의 환자 중 13명은 취침시간을 제외하고 의치을 장착하고 있었다. 하루에 의치를 세척하는 횟수는 1회가 4명, 2회가 7명, 3회가 4명이었으며, 이때 대부분 치약을 이용하는 것으로 조사되었다(Table 7 & 8), 이러한 결과로 의치의 관리 정도와 치주질환원인균들의 검출 빈도와는 상관관계가 없는 것으로 나타났다.
치아가 없으면서 상하악 모두 또는 한 악에 의치가 있는 무치악 환자의 경우에서는 A. actinomycetemcomitans를 제외하고 나머지 3 세균 종은 모두 의치 표면 세균막에서 검출되었다(Table 3 & 5). P gingivalis의 경우 25%(1/4), T.
한 악에 치아가 한 개 이상 잔존하고 반대편 악이 총의 치인 환자에서는 무치악 환자에서 보다 더 높은 빈도로 P. gingivalis (91%)와 T. forsythia(91%)가 검출되었다. 이때 치아에서도 두 세균 종이 91%씩 검출되었다.
후속연구
gingivalis는 검출되지 않았다고 보고하였다. 그러므로, 추후 이를 증명하기 위한 실험을 추가적으로 시행해야 할 것이다.
참고문헌 (15)
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