생쥐 신생자 시기에 생식 세포의 사멸 기전을 알아보기 위하여 세포 사멸을 보이는 생식 세포에서 세포 사멸 관련 단백질인 caspase-3, caspase-activated DNase(CAD), Bax 및 Fasnas ligand의 발현을 조사하였다. 활성화된 caspase-3와 CAD의 면역화학적 염색 결과 일차 및 이차 난포내 TUNEL 양성을 보이는 세포 사멸 난자에서 발현되는 것을 관찰하였다. CAD 또한 TUNEL 양성을 보이는 세포 사멸 난자에서 염색되었다. 활성화된 caspase-3와 CAB에 양성을 보이는 대부분의 난자들은 폐쇄의 형태학적 특징이라고 할 수 있는 세포질 내 공포가 관찰되었다. Bax는 세포질 내 공포가 존재하는 세포 사멸된 난자에서 염색되었다. Fas ligand 또한 TUNEL 양성을 보이는 난자에서 염색되었다. 이러한 TUNEL 양성을 보이는 생식 세포에서 활성화된 caspase-3와 CAD가 염색된 결과는 생쥐 난포 발달 초기 단계에 caspase-3와 CAD가 생식 세포의 세포사멸에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 TUNEL 양성을 보이는 난자에서 Bax와 Fas ligand가 발현된 결과는 이러한 단백질이 난자의 세포 사멸을 조절하는 요소로 작용할 수 있을 것으로 사료된다.
생쥐 신생자 시기에 생식 세포의 사멸 기전을 알아보기 위하여 세포 사멸을 보이는 생식 세포에서 세포 사멸 관련 단백질인 caspase-3, caspase-activated DNase(CAD), Bax 및 Fasnas ligand의 발현을 조사하였다. 활성화된 caspase-3와 CAD의 면역화학적 염색 결과 일차 및 이차 난포내 TUNEL 양성을 보이는 세포 사멸 난자에서 발현되는 것을 관찰하였다. CAD 또한 TUNEL 양성을 보이는 세포 사멸 난자에서 염색되었다. 활성화된 caspase-3와 CAB에 양성을 보이는 대부분의 난자들은 폐쇄의 형태학적 특징이라고 할 수 있는 세포질 내 공포가 관찰되었다. Bax는 세포질 내 공포가 존재하는 세포 사멸된 난자에서 염색되었다. Fas ligand 또한 TUNEL 양성을 보이는 난자에서 염색되었다. 이러한 TUNEL 양성을 보이는 생식 세포에서 활성화된 caspase-3와 CAD가 염색된 결과는 생쥐 난포 발달 초기 단계에 caspase-3와 CAD가 생식 세포의 세포사멸에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 TUNEL 양성을 보이는 난자에서 Bax와 Fas ligand가 발현된 결과는 이러한 단백질이 난자의 세포 사멸을 조절하는 요소로 작용할 수 있을 것으로 사료된다.
To investigate the mechanism of germ cell death in postnatal stage of mouse, the involvement of apoptotic executioners, caspase-3 and caspase-activated DNase(CAD), and apoptotic initiators, Bax Fas and Fas ligand, in the germ cell death has been studied. Immune-labels of active caspase-3 and CAD wer...
To investigate the mechanism of germ cell death in postnatal stage of mouse, the involvement of apoptotic executioners, caspase-3 and caspase-activated DNase(CAD), and apoptotic initiators, Bax Fas and Fas ligand, in the germ cell death has been studied. Immune-labels of active caspase-3 and CAD were located in TUNEL-positive, apoptotic, oocytes as well as normal oocytes of primary or secondary follicles. CAD immune-labels were also detected in the nucleus of TUNEL-positive oocytes. Most of oocytes showing positive immune-labeling of active caspase-3 or CAD had vacuoles in their cytoplasm, which is the morphological characteristic of oocyte during folliclar atresia. Bax immune-stains were detected in the atretic oocytes which showed the vacuole in their cytoplasm. Positive immune-labels for Fas ligand was localized in TUNEL-positive or atretic oocytes. Presence of immunoreactivity of active caspase-3 and CAD in TUNEL-positive germ cells implicate that active raspase-3 and CAD might play a role in germ cell apoptosis during early development of mouse ovarian follicle. Immunohistochemical localization of Bax and Fas ligand in TUNEL-positive oocytes suggests that these might be the most plausible modulator of oocyte apoptosis.
To investigate the mechanism of germ cell death in postnatal stage of mouse, the involvement of apoptotic executioners, caspase-3 and caspase-activated DNase(CAD), and apoptotic initiators, Bax Fas and Fas ligand, in the germ cell death has been studied. Immune-labels of active caspase-3 and CAD were located in TUNEL-positive, apoptotic, oocytes as well as normal oocytes of primary or secondary follicles. CAD immune-labels were also detected in the nucleus of TUNEL-positive oocytes. Most of oocytes showing positive immune-labeling of active caspase-3 or CAD had vacuoles in their cytoplasm, which is the morphological characteristic of oocyte during folliclar atresia. Bax immune-stains were detected in the atretic oocytes which showed the vacuole in their cytoplasm. Positive immune-labels for Fas ligand was localized in TUNEL-positive or atretic oocytes. Presence of immunoreactivity of active caspase-3 and CAD in TUNEL-positive germ cells implicate that active raspase-3 and CAD might play a role in germ cell apoptosis during early development of mouse ovarian follicle. Immunohistochemical localization of Bax and Fas ligand in TUNEL-positive oocytes suggests that these might be the most plausible modulator of oocyte apoptosis.
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문제 정의
따라서 본 연구는 생쥐 난소 내 초기 난포 형성과정에 발생하는 생식세포의 사멸현상에 관여하는 여러 조절자들의 발현 여부를 면역조직화학법과 TUNEL 염색을 통하여 확인함으로써 초기 난포 폐쇄 기전을 규명하고자 한다. 아울러 신생자 시기의 난포 형성 과정 중 발생하는 생식세포의 세포 사멸이 caspase계 단백질에 의해 유도되는지 여부와 이 실행 단계를 유도하는 신호로서 어떤 세포사멸 조절인자가 관여하고 있는지 확인함으로써 난포 형성 과정에서 발생하는 난자의 세포 사멸 기전을 규명하고자 하였다.
본 연구는 생쥐 신생자 생식세포 사멸이 활발하게 일어나는 것으로 보고된(Song, 1998) 생후 7일째의 난소에서 생식세포 내 세포사멸 과정에 세포사멸 조절인자들의 관련 여부를 확인하고자 하였다. 생후 7 일째 생쥐 난소내에서 활발하게 나타나는 생식세포의 사멸 현상이 여러 향세포 사멸인자들 에 의해 동일하게 조절되는 지를 알아보기 위하여 TUNEL 염색을 통하여 세포 사멸 여부를 확인한 결과 7 일자 신생자 난소에서는 정상 난포의 과립 세포에서 전부 음성반응을 보였으며, 퇴화 난포의 과립 세포에서는 강한 갈색의 양성 반응이 나타나는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 폐쇄가 일어 난 난포내 난자의 퇴화 현상이 세포 사멸에 의한 것임을 의미한다.
따라서 본 연구는 생쥐 난소 내 초기 난포 형성과정에 발생하는 생식세포의 사멸현상에 관여하는 여러 조절자들의 발현 여부를 면역조직화학법과 TUNEL 염색을 통하여 확인함으로써 초기 난포 폐쇄 기전을 규명하고자 한다. 아울러 신생자 시기의 난포 형성 과정 중 발생하는 생식세포의 세포 사멸이 caspase계 단백질에 의해 유도되는지 여부와 이 실행 단계를 유도하는 신호로서 어떤 세포사멸 조절인자가 관여하고 있는지 확인함으로써 난포 형성 과정에서 발생하는 난자의 세포 사멸 기전을 규명하고자 하였다.
제안 방법
이차항체를 Tris buffer에 1:500으로 희석하여 조직에 충분히 도포한 후 37℃의 습윤상자 안에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 Tris buffer로 5 분간 3 회 세척하였다. DAB로 10 분간 발색시킨 후 슬라이드를 증류수로 2 회 세척하고 Mayer's hematoxylin으로 2 분간 대조염색을 실시하였다. 탈수를 마친 슬라이드는 xylene으로 투명화시키고 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였으며 염색이 끝난 슬라이드는 광학현미경 하에서 400 배로 관찰하였다.
본 실험에서는 샘타코 실험동물 사육장에서 공급받은 8주령 ICR 생쥐를 사용하였다. 공급후 14시간/10시간(명/암) 조명조건에서 3T일간 적응시키고, 먹이와 물을 충분히 공급하여 실험에 사용하였다. 충분히 성숙된 암컷을 수컷과 합사 시킨 후 임신된 쥐가 출산한 날을 1일로 하여 출생후 7일째 경추 도살한 후 난소를 적출하였다.
6)로 3회 세척하였다. 그런 다음 anti- digoxigenin-peroxidase로 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후 Tris buffer로 세척하고 3, 3'-diaminobenzidine(DAB, 0.1% in PBS; Research Genetics)으로 10 분간 발색시켜 검경하였다.
준비된 난소 조직 슬라이드는 in situ apoptosis detection kit (ApopTag kit, PharMingen)를 사용하여 난자의 세포 사멸 여부를 확인하였다. 먼저 조직 슬라이드는 xylene 과정을 통해 paraffin을 제거하고, 알코올 과정을 거쳐 물로 세척한 후 phosphate buffered saline(PBS, Gibco)으로 세척하였다.
공급후 14시간/10시간(명/암) 조명조건에서 3T일간 적응시키고, 먹이와 물을 충분히 공급하여 실험에 사용하였다. 충분히 성숙된 암컷을 수컷과 합사 시킨 후 임신된 쥐가 출산한 날을 1일로 하여 출생후 7일째 경추 도살한 후 난소를 적출하였다.
DAB로 10 분간 발색시킨 후 슬라이드를 증류수로 2 회 세척하고 Mayer's hematoxylin으로 2 분간 대조염색을 실시하였다. 탈수를 마친 슬라이드는 xylene으로 투명화시키고 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였으며 염색이 끝난 슬라이드는 광학현미경 하에서 400 배로 관찰하였다.
파라핀 박편으로 준비된 생후 7 일째 신생자 생쥐 난소를 재료로 TUNEL 방법에 의해 생식세포의 세포 사멸 여부를 확인 하였다. 출생전에 비해 출생후 2 일째 신생자 난소에서는 몇 개의 세포에서 진한 갈색을 보일 뿐 뚜렷한 반응이 없었다.
대상 데이터
본 실험에서는 샘타코 실험동물 사육장에서 공급받은 8주령 ICR 생쥐를 사용하였다. 공급후 14시간/10시간(명/암) 조명조건에서 3T일간 적응시키고, 먹이와 물을 충분히 공급하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
Bax의 경우 일차 및 이차 난포에서 TUNEL에 대해 양성을 보이는 난자에서 공통적으로 관찰되었다. Bax의 존재 확인은 신생자 생쥐 생식세포의 사멸이 미토콘드리아내 Bax와 관련이 있다는 사실을 입증하는 결과로 앞서의 활성적 caspase-3 에 대한 결과와 연결하여 볼 때 이 시기의 세포사멸이 Bax의 영향으로 미토콘드리아 막의 기능이 붕괴되어 cytochrome c가 방출됨으로써 caspase가 활성화되어 유도되는 경로에 의해 진행될 수 있음을 시사한다고 사료된다.
CAD의 경우도 활성적 caspase-3와 마찬가지로 일차 및 이차 난포에서 TUNEL에 대해 양성을 보이는 난자에서 공통적으로 관찰되었다. 이 경우 TUNEL labeling에 의해 염색된 핵 부분은 균일하지 않고 부분적으로 주변화되는 특징을 나타냈다.
따라서 웅성과 자성의 생 식세포 모두 발생과정에서 일어나는 세포 사멸이 초기 단계에서는 여러 다양한 유발 원인에 의해 유도될 수 있지만, 실행 단계에서는 공통적으로 caspase계 단백질들이 관여하는 것으로 생각할 수 있다. 결론적으로 caspase 계단백질의 활성화는 성체 난소뿐만 아니라 그 이전 시기인 성적 미분화 기, 즉 신생자기에도 동일하게 생식세포의 사멸기전에 작용 할 수 있을 것으로 생각한다.
이 경우 TUNEL 염색에 의해 염색된 핵 부분은 균일하지 않고 부분적으로 주변화되는 특징을 나타냈다. 그러나 이렇게 활성적 caspase-3와 CAD 면역 반응성을 보이는 난자에서 막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며 난자의 외형도 정상적인 원형의 형태에서 타원형으로 일부 변형된 것을 관찰할 수 있었다. 일부에서는 CAD 면역 반응성이 핵내에서 관찰되기도 하였다.
이 경우 TUNEL labeling에 의해 염색된 핵 부분은 균일하지 않고 부분적으로 주변화되는 특징을 나타냈다. 그러나 일부 TUNEL에 양성을 보이지 않는 음성 난자 에서도 갈색 반응을 보였는데, 이렇게 CALM 양성을 보이는 난자도 활성적 caspase-3 경우와 마찬가지로 막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며 난자의 외형도 정상적인 원형의 형태에서 타원형으로 일부 변형된 것을 관찰할 수 있었다. 일부에서는 CAD 면역반응이 핵 내에서 관찰되기도 하였다(Fig.
생후 7 일째 생쥐 난소내에서 활발하게 나타나는 생식세포의 사멸 현상이 여러 향세포 사멸인자들 에 의해 동일하게 조절되는 지를 알아보기 위하여 TUNEL 염색을 통하여 세포 사멸 여부를 확인한 결과 7 일자 신생자 난소에서는 정상 난포의 과립 세포에서 전부 음성반응을 보였으며, 퇴화 난포의 과립 세포에서는 강한 갈색의 양성 반응이 나타나는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 폐쇄가 일어 난 난포내 난자의 퇴화 현상이 세포 사멸에 의한 것임을 의미한다. 그리고 난자 주변부, 즉 난구세포에 강한 양성 반응이 나타났고 비교적 초기의 성장 난포보다는 난포가 성장한 이후 즉 비교적 큰 난포에서 많은 반응이 나타나는 것으로 보아 DNA 분절화 현상이 난포의 성장에 따라 달라짐을 의 미한다고 볼 수 있다. 세포 사멸 과정은 난소와 자궁 등 생식 기관을 포함하는 다양한 장기에서, 그리고 발생 과정의 여러 단계에서 관찰되는 일반적인 현상으로, 특히 난소의 경우 그 발생 및 주기적 변화에 필수적인 과정이라 할 수 있다.
그러나 7 일자 신생자 난소에서는 정상 난포의 과립세포에서 전부 음성반응을 보였으며, 퇴화난포의 과립세포에서는 강한 갈색의 양성반응이 나타났다. 그리고 난포내 난자 주변부, 즉 난포 중앙의 과립세포는 강한 양성반응이 나타났고 비교적 초기의 성장 난포보다는 난포가 성장한 이후 즉 비교적 큰 난포에서 많은 반응이 나타나 DNA 분절화 현상이 많이 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2, 3).
이렇게 Fas에 양성을 보이는 난자는 세포막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며 난자 핵이 세포질의 한쪽 으로 치우쳐 정상적인 형태에서 일부 변형된 것으로 생각된다. 또한 Fas 배위자 면역 표지의 경우 주로 TUNEL 양성의 세포에서 내부에 강한 갈색의 염색성이 폭넓게 존재하였고, 세포막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 난자 핵이 세포 질의 한쪽으로 약간 치우쳐 정상적인 형태에서 일부 변형된 것을 관찰할 수 있었으며 핵내 염색질의 분절화가 관찰되었 다.
또한 Fas 배위자 면역 표지의 경우 주로 TUNEL 양성의 세포에서 내부에 강한 갈색의 염색성이 폭넓게 존재하였고, 세포막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 난자 핵이 세포 질의 한쪽으로 약간 치우쳐 정상적인 형태에서 일부 변형된 것을 관찰할 수 있었으며 핵내 염색질의 분절화가 관찰되었 다.
본 연구는 생쥐 신생자 생식세포 사멸이 활발하게 일어나는 것으로 보고된(Song, 1998) 생후 7일째의 난소에서 생식세포 내 세포사멸 과정에 세포사멸 조절인자들의 관련 여부를 확인하고자 하였다. 생후 7 일째 생쥐 난소내에서 활발하게 나타나는 생식세포의 사멸 현상이 여러 향세포 사멸인자들 에 의해 동일하게 조절되는 지를 알아보기 위하여 TUNEL 염색을 통하여 세포 사멸 여부를 확인한 결과 7 일자 신생자 난소에서는 정상 난포의 과립 세포에서 전부 음성반응을 보였으며, 퇴화 난포의 과립 세포에서는 강한 갈색의 양성 반응이 나타나는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 폐쇄가 일어 난 난포내 난자의 퇴화 현상이 세포 사멸에 의한 것임을 의미한다. 그리고 난자 주변부, 즉 난구세포에 강한 양성 반응이 나타났고 비교적 초기의 성장 난포보다는 난포가 성장한 이후 즉 비교적 큰 난포에서 많은 반응이 나타나는 것으로 보아 DNA 분절화 현상이 난포의 성장에 따라 달라짐을 의 미한다고 볼 수 있다.
이러한 결과를 종합하여 볼 때 생쥐 신생자 시기의 난포 발달 과정 중 발생하는 생식세포의 퇴화는 세포 사멸에 의한 것임을 알 수 있었으며, 이들이 Fas에 의해 사멸 신호를 받아 생존과 사멸의 조절을 담당하는 Bax 단백질에 영향을 미침으로써 결국 caspase-3가 활성화되면서 활성적 caspase-3 CAD에 의해 세포 사멸이 유도되는 것임을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 생식세포의 세포 사멸에 여러 향사멸 조절인자들이 관여하는 것으로 보아 이 시기에 생식세포의 사멸에는 최소한 하나 이상의 조절 기전이 관여할 것으로 생각된다.
Fas ligand 면역 표지의 경우, 강한 갈색의 염색성이 주로 TUNEL 양성의 세포에서 내부에 폭넓게 존재하였다. 이렇게 Fas ligand에 양성을 보이는 난자는 세포막을 따라 세포 안쪽으로 여러 형태와 크기의 액포를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며 난자 핵이 세포질의 한쪽으로 약간 치우쳐 정상적인 형태에서 일부 변형된 것을 관찰할 수 있었으며 핵내 염색질의 분절화가 관찰되었다(Fig. 3c, d).
한편 Matikainen 등(1999)은 caspase-3 녹아웃 생쥐를 이용한 실험에서 활성적 caspase-3에 대한 면역조직화학법에 의한 결과, 야생형에 비하여 원시난포와 일차 및 이차 난포를 포함한 강소 형성전 난포내 난자에 활성적 caspase-3의 존재가 차이가 없었다고 보고함으로써 생식세포의 세포 사멸에 활성적 caspase-3가 관여하지 않는 것으로 결론지었으나, 본 실험 결과에 따르면 그러한 가정은 사실과 다를 것으로 판단 된다. 이처럼 활성적 caspase-3가 세포사멸의 양상을 보이는 일차난포내 난자에서 검출되는 것으로 보아, caspase계 단백 질은 생식 세포 사멸에 관여하고 있는 것으로 생각되지만, 일부의 경우 caspase계 단백질의 활성화 경로를 통하지 않는 세포사멸의 방법에 의해서도 사멸이 유도될 수 있는 것으로 생각할 수 있다. 이러한 가정은, T 림프구에서 사멸 수용체를 통하지 않는 세포 사멸 자극에 의해서만 caspase-3의 활성화가 관찰되고, 그 외의 경우 활성적 caspase-3가 세포사멸에 관여하지 않는다는 보고에 의해서도 지지된다(Bid'ere & Senik,2001).
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