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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 뇌신경 배양세포에서 카드뮴에 의한 산화적 스트레스의 증가작용을 관찰하고, 칼슘의 항상성에 중요한 역할을 하는 Na+/ K+ ATPase의 활성 및 amyloid beta peptide(Aβ)의 응집에 미치는 영향을 관찰함으로써 카드뮴의 중추신경계에 대한 독성작용 기전을 규명하고 Alzhei-mer's disease와의 관련성을 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서는 카드뮴의 중추신경계에 대한 독성작용 기전을 규명하고, Alzheimer's disease와의 관련성을 밝히고자 뇌신경 배양세포에서 카드뮴에 의한 산화적 스트레스의 증가작용을 관찰하고 칼슘의 항상성에 중요한 역할을 하는 Na+/K+ATPase의 활성 및 amyloid beta peptide(Aβ)의 응집에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- 카드뮴이 세포의 생존 및 성장에 미치는 영향을 관찰하고자 MTT assay를 시행하였다. MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 succinate dehydrogenase에 의하여 tetrazolium 염이 파란색의 formazan으로 환원되는 성질을 이용하여 세포의 생존 및 성장을 측정하는 방법이다.
- 세포에 대한 LC50를 기초하여 카드뮴의 처리농도를 결정하였다.
- 원심분리한 후에 형광분광광도계(Ex: 515 nm, Em: 553 nm)로 형광 세기를 측정한다. 1, 1, 3, 3-tetramethoxypropane을 표준액으로 작성한 검량선을 이용하여 형광 세기를 nmol MDA량으로 환산하였다.
- TNB의 생성속도를 분광광도계로 412nm에서 측정하였으며, 표준물질로 glutalhione을 사용하여 작성한 검량선으로부터 시료중의 glutathione 함량을 산출하였다.
- 카드뮴이 Na+/K+ ATPase의 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 HT22 배양세포에 카드뮴 2, 4, 8μM을 각각 처리한 후 4시간에 세포를 수확하여 실험에 사용하였다. Na+/K+ ATPase 활성은 Rhon 등의 방법으로 측정하였으며(Rohn ef al.
- 1)과 섞어 96-well plate에 가하고, ouabain을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 37℃에서 1시간 배양하였다. 10 μl의 Fiske-Subbarow 시약을 가한 후에 ELISA reader로 630nm에서 흡광도를 측정함으로써 Na+/K+ ATPase 활성을 측정하였다.
- 카드뮴이 β-amyloid(Aβ)의 응집에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 HT22 배양세포에 카드뮴 2, 4, 8μM을 각각 처리한 후 4시간에 세포를 수확하여 실험에 사용하였다. β-Amyloid의 응집에 미치는 영향을 편광현미경으로 관찰하였으며, 실험과정을 간략하게 기술하면 다음과 같다.
- 사용하였다. β-Amyloid의 응집에 미치는 영향을 편광현미경으로 관찰하였으며, 실험과정을 간략하게 기술하면 다음과 같다. 세포 배양액을 14,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후에 잔류물을 탈이온수로 3~5회 세척하고 30μl의 탈이온수에 현탁하였다.
- 현탁액을 현미경 슬라이드에 가하여 건조시키고, 50% Congo red(에탄올)로 5분간 염 색하였다. 슬라이드를 복굴절 편광현미경으로 β-amyloid의 응집을 관찰하였다.
- HT22 세포에 카드뮴을 농도별로 처리하고, 4시간 후에 배양액을 회수하여 원심분리 및 Congo red로 염색하여 편광현미경으로 Aβ의 응집을 관찰하였다(Fig. 5). 카드뮴은 용량의존적으로 Aβ의 무정형 응집(amorphous aggregation)을 증가시키는 것으로 조사되었다.
- 지방과산화물 생성 및 glutathione의 함량에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 카드뮴(CdCl2)을 농도별(0, 2, 4 또는 8μM)로 처리하고 4시간 후에 세포를 수확하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- Cadmium의 중추신경계에 대한 독성기전으로는 reactive oxygen species(ROS)의 생성 유발, antio-xydant defence systems의 장해 등이 보고되고 있어, 최근에 oxidative stress 연구에 많이 이용되고 있는 HT22 cell(hippocampal neuron cell line)을 대상 세포종으로 선정하였다. 본 연구에 사용한 세포주 HT22는 아주대학교 생리학교실에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM배지를 사용하여 5% CO2, 95% air, 37℃의 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 선정하였다. 본 연구에 사용한 세포주 HT22는 아주대학교 생리학교실에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM배지를 사용하여 5% CO2, 95% air, 37℃의 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액을 흡인 제거한 후 0.
데이터처리
- 실험자료의 분석은 SPSS 통계프로그램(ver. 11.0)과 Microsoft excel을 이용하였으며, 대조군과 처치군의 차이는 t-test로 비교하였다.
이론/모형
- MTT assay 결과로부터 HT22 세포에 대한 카드뮴의 LC5와 LC50를 산출하기 위하여 미국 EPA에서 제공하는 Benchmark Dose Software(BMDS)를 이용하였다. 세포에 대한 LC50를 기초하여 카드뮴의 처리농도를 결정하였다.
- HT22 세포에 농도별로 카드뮴을 처리하고 8시간 배양한 후에 지방과산화의 지표로서 thiobarbi-turic acid-reactive substances를 Gal vino 등의 방법으로 측정하였다(Miki and Teruo, 2000). 20% trich-loroacetic acid 2.
- 세포내의 glutathione(GSH) 량은 Tietze가 개발한 DTNB-GSSG reductase recycling assay법 에 따라 측정하였다(Tietze, 1969). 총 GSH 정량에 이용되는 recycling assay법은 특이적 효소과정으로 매우 민감한 방법이다.
- 실험에 사용하였다. Na+/K+ ATPase 활성은 Rhon 등의 방법으로 측정하였으며(Rohn ef al., 1993), 실험과정을 간략하게 기술하면 다음과 같다. 세 포를 20 mM imidazole, 0.
- MTT assay 결과로부터 LC5와 LC50를 산출하기 위하여 미국 EPA에서 제공하는 Benchmark Dose Software(BMDS)를 이용하였다. 그 결과는 Fig.
성능/효과
- 카드뮴 8 μM 처치군에서 지방 과산화물의 함량은 대조군과 비교하여 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다.
- 카드뮴 8 μM 처치군에서 지방 과산화물의 함량은 대조군과 비교하여 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다.
- , 1992). 본 연구에서 카드뮴은 24μM에서 뇌신경 세포를 완전히 사멸시켰으며, 8 μM에서 β-amyloid의 응집을 현저히 증가시켰다. 이러한 결과는 카드뮴의 신경계에 대한 독성기전에 β-amyloid의 응집의 관련성을 시사하고 있다.
- 2. HT22 세포에서 카드뮴을 농도별로 처리하였을 때에 지방 과산화물의 함량은 용량의존적으로 증가하였다(P< 0.05). 카드뮴 8 μM 처치군에서 지방 과산화물의 함량은 대조군과 비교하여 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다.
- 3. HT22 세포내의 glutathione 함량은 카드뮴에 의해 용량의존적으로 감소되었다(p<0.01). 카드뮴 2 μM을 처리하였을 때에 glutathione 함량은 17% 정도 감소되었으며, 8 rM의 경우는 51% 정도 감소하였다.
- 4. 카드뮴(1-8μM)을 농도별로 처리하고, 4시간 후에 세포를 수확하여 Na+/K+ ATPase의 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과 카드뮴은 4μM부터 Na+/K+ ATPase의 활성을 현저히 저해하였다.
- 5. HT22 세포에 카드뮴을 농도별로 처리하고, 4시간 후에 배양액을 회수하여 원심분리 및 Congo red로 염색하여 편광현미경으로 A&의 응집을 관찰한 결과 카드뮴은 용량의존적으로 AJ3의 무정형 응집(amorphous aggregation)을 증가시키는 것으로 관찰되었다.
- 이상의 결과에서 카드뮴의 중추신경계에 대한 독성작용은 산화적 스트레스 증가작용 및 Na+/K+ ATPase의 활성 감소작용에 기인하는 것으로 생각되며, 카드뮴에 의해 β-amyloid의 응집이 증가되는 것으로 보아 Alzheimer's disease의 촉발 또는 진행과도 관련이 있을 것으로 사료된다.
- 1. 카드뮴은 HT22 세포의 생육을 용량의존적으로 억제하였으며, LC5와 LC50은 각각 4.1 μM과 9.5μM로 나타났다.
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