본 연구는 양조과정의 부산물인 주박으로부터 분리한 다당류(JPS)가 초기 면역반응에 중추적인 역할을 수행하는 대식세포에서 활성화를 유도하는지에 관한 여부를 알아보기 위해서 수행되었다. 주박에서 분리한 다당류를 마우스 유래 대식세포인 RAW264.7 cell에 처리하였을 때 대식세포의 활성화의 지표인 NO와 cytokine(IL-6, TNF-${\alpha}$)의 분비가 증가되었다. 또한 이러한 NO와 cytokine의 증가의 원인에 관한 면역기전에 관하여 알아본 결과 JPS의 처리는 MAPKs(ERK, JNK, p-38)의 인산화를 촉진시켜 NF-${\kappa}B$의 활성을 유도하여 면역세포의 활성인자들의 분비를 촉진시킨 것으로 관찰되었다.
본 연구는 양조과정의 부산물인 주박으로부터 분리한 다당류(JPS)가 초기 면역반응에 중추적인 역할을 수행하는 대식세포에서 활성화를 유도하는지에 관한 여부를 알아보기 위해서 수행되었다. 주박에서 분리한 다당류를 마우스 유래 대식세포인 RAW264.7 cell에 처리하였을 때 대식세포의 활성화의 지표인 NO와 cytokine(IL-6, TNF-${\alpha}$)의 분비가 증가되었다. 또한 이러한 NO와 cytokine의 증가의 원인에 관한 면역기전에 관하여 알아본 결과 JPS의 처리는 MAPKs(ERK, JNK, p-38)의 인산화를 촉진시켜 NF-${\kappa}B$의 활성을 유도하여 면역세포의 활성인자들의 분비를 촉진시킨 것으로 관찰되었다.
Activating macrophage cells play an important role in the host immune defense system. In this paper, immuno-modulatory activities of polysaccharides separated from Jubak (JPS) in macrophage cells were investigated. Immuno-modulatory activities were estimated based on cell proliferation, nitric oxide...
Activating macrophage cells play an important role in the host immune defense system. In this paper, immuno-modulatory activities of polysaccharides separated from Jubak (JPS) in macrophage cells were investigated. Immuno-modulatory activities were estimated based on cell proliferation, nitric oxide (NO) and cytokine production, degree of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), and nuclear factor (NF)-${\kappa}B$ phosphorylation in RAW264.7 macrophage cells. JPS (62.5 to $250{\mu}g/mL$) did not induce a cytotoxic event. Additionally, NO and proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor-${\alpha}$ and interleukin-6) production significantly increased in a dose-dependent manner. Similarly, phosphorylation of MAPKs and NF-${\kappa}B$ increased upon JPS treatment. Therefore, our results suggest that polysaccharides separated from Jubak can induce macrophage activation through MAPK and NF-${\kappa}B$ signaling and induction of Th1 polarization.
Activating macrophage cells play an important role in the host immune defense system. In this paper, immuno-modulatory activities of polysaccharides separated from Jubak (JPS) in macrophage cells were investigated. Immuno-modulatory activities were estimated based on cell proliferation, nitric oxide (NO) and cytokine production, degree of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), and nuclear factor (NF)-${\kappa}B$ phosphorylation in RAW264.7 macrophage cells. JPS (62.5 to $250{\mu}g/mL$) did not induce a cytotoxic event. Additionally, NO and proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor-${\alpha}$ and interleukin-6) production significantly increased in a dose-dependent manner. Similarly, phosphorylation of MAPKs and NF-${\kappa}B$ increased upon JPS treatment. Therefore, our results suggest that polysaccharides separated from Jubak can induce macrophage activation through MAPK and NF-${\kappa}B$ signaling and induction of Th1 polarization.
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문제 정의
본 연구는 양조과정의 부산물인 주박으로부터 분리한 다당류(JPS)가 초기 면역반응에 중추적인 역할을 수행하는 대식 세포에서 활성화를 유도하는지에 관한 여부를 알아보기 위해서 수행되었다. 주박에서 분리한 다당류를 마우스 유래 대식세포인 RAW264.
본 연구는 주박에서 추출한 다당체의 대식세포 면역 활성능에 대해 알아보기 위하여 마우스 대식세포 유래의 세포주인 RAW264.7 세포주에서 면역증진 매개인자인 NO, proinflammatory cytokine의 분비능과 cytokine의 분비능을 조절하는 조절인자인 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 인산화 및 nuclear factor(NF)-κB의 핵 내로의 이동에 미치는 영향에 관하여 알아보았다.
제안 방법
Cells lysates were subjected to SDSPAGE and immunoblotting analysis was performed using each specific antibody to MAPKs (phospho-p38, phospho-ERK1/2, and phosphoJNK1/2) (A) and NF-κB (p65) (B).
분리된 배양 상등액에서 IL-6, TNF-α 및 NO의 함량을 측정하였다. Cytokine 함량은 ELISA kit(eBioscience Co., San Diege, CA, USA)을 사용하여 측정하였으며, 이때 cytokine의 농도는 kit에 포함되어 있는 표준용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.
JPS가 대식세포의 세포독성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 대식세포 RAW264.7 cell에 농도별 JPS를 처리하여 JPS에 대한 세포의 생존율을 MTT 방법을 통하여 평가하였다(Fig. 1). JPS를 62.
MTT 시약의 첨가로 생긴 formazan을 녹이기 위해서 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL씩 첨가하고 1시간 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, Control(medium only)의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
) 시약을 처리하여 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 sodium nitrite(NaNO2, Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 얻은 표준직선과 비교하여 산출하였다.
RAW264.7 cell을 96 well plate에 3×104cell/well의 농도로 분주한 후 37°C, 5% CO2 incubator에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고 JPS를 phosphate buffered saline(PBS; WelGene, Daegu, Korea)에 용해하여 62.5, 125 및 250 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리하였다.
RAW264.7 대식세포를 6 well plate에 2×106 cell/well 의 농도로 분주하여 12시간 동안 완전히 부착시키고 JPS를 62.5 및 125 μg/mL의 농도로 처리하였다.
건조된 주박을 실험실용 분쇄기(NSG-1002SS, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하고 주박 분말 50 g에 400 mL의 distilled water를 가하여 100°C에서 2시간 동안 열수추출 하였다.
대식세포 활성화에 미치는 영향을 평가하기 위해서 RAW264.7 대식세포에 JPS를 처리한 후 세포 상등액에서 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α, IL-6와 NO의 생성에 대하여 알아보았다.
따라서 JPS는 대식세포의 세포독성에 영향을 미치지 않았으며, 추후 JPS의 처리가 cytokine 및 NO의 생성능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 JPS의 농도를 62.5, 125및 250 μg/mL로 고정하여 실험하였다
분리된 cell lysate는 BCA protein de-tection kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질 정량을 실시하였고, well당 20 μg 의 cell lysate를 10% polyacrylamide gel에 각각 loading 하여 SDS-PAGE로 변성 분리하였다.
분리된 배양 상등액에서 IL-6, TNF-α 및 NO의 함량을 측정하였다.
이후 TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 10분씩 3회 세척하였으며, p-p38, p-38, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK 및 NF-κB의 발현량을 측정하기 위해 1차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MN, USA) 를 1:2,000으로 희석하여 4시간 동안 반응시키고 TBST로 5분간 3회 세척하였다.
핵 내의 단백질을 분리하기 위하여 상기 수집된 세포에 저장성 완충액[10 mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)(HEPES), pH 7.9, 1.5 mM magnesium chloride(MgCl2), 10 mM potassium chloride(KCl), 0.5mM dithiothreitol(DTT), 1 μM leupeptin과 0.2 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF)]을 20분간 처리한 후 12,000×g에서 1분간 원심분리 하여 세포질과 핵을 분리하였으며, 분리된 핵을 고장성 완충액[20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glycerol, 420 mM ethylene diamine tetra acetic acid 0.5 mM DTT, 1 μM leupeptin, 0.2 mM PMSF]을 처리하여 10,000×g에서 20분간 원심분리 하여 핵단백질을 추출하였다.
대상 데이터
마우스의 대식세포주인 RAW264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 세포배양을 위해 100 unit/mL penicillin 및 100 unit/mL streptomycin 과 10% fetal bovine serum을 포함하는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지(Life Technology, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였으며, 세포는 37°C, 5% CO2 incubator(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
본 연구에서 사용된 주박은 경상북도 김천시 해인주조에서 제공받아 사용하였다. 건조된 주박을 실험실용 분쇄기(NSG-1002SS, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하고 주박 분말 50 g에 400 mL의 distilled water를 가하여 100°C에서 2시간 동안 열수추출 하였다.
데이터처리
Statistical analysis was performed using the Student's two tailed t-test with a significance level of * P<0.05, ** P<0.01, and *** P<0.001.
Statistical analysis was performed using the Student's two tailed t-test with a significance level of ** P<0.01, *** P<0.001.
이상의 실험에서 얻어진 결과는 Statistical Package for Social Sciences(SPSS, 10.0, IBM, Chicago, IL, USA) software를 이용하여 one way ANOVA test로 분석하였으며, 시료 간의 유의성은 Student's two tailed t-test로 * P< 0.05, ** P<0.01 및 *** P<0.001 수준에서 비교하였다.
성능/효과
JPS를 62.5, 125 및 250 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았고 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가되는 것으로 관찰되었다.
따라서 JPS의 처리에 의한 대식세포 활성화의 정확한 면역기전을 알아보기 위해서 대식세포에 JPS 의 농도를 62.5 및 125 μg/mL로 처리하고 MAPKs와 NF-κB 의 인산화 정도를 관찰했을 때 JPS의 처리가 MAPK(ERK, JNK, p-38) 및 NF-κB의 인산화를 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
따라서 본 실험에서는 대식세포의 활성 지표인 cytokine의 분비량을 통해서 대식세포의 활성화 정도를 알아본 결과 JPS를 대식 세포에 세포독성이 없는 62.5, 125 및 250 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 TNF-α 및 IL-6의 함량이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 보아 JPS의 처리는 대식세포의 활성화를 유도하는 것으로 사료된다(Fig. 2B)
또한 이러한 NO와 cytokine의 증가의 원인에 관한 면역기전에 관하여 알아본 결과 JPS의 처리는 MAPKs(ERK, JNK, p-38)의 인산화를 촉진시켜 NF-κB의 활성을 유도하여 면역세포의 활성인자들의 분비를 촉진시킨 것으로 관찰되었다.
본 연구에서도 62.5, 125 및 250 μg/mL의 JPS를 처리하였을 때 세포독성을 확인할 수 없었으며, NO 분비능이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 관찰되어 JPS 의 처리는 대식세포의 면역 활성능을 증강시키는 것으로 사료된다.
상기 실험에서 JPS의 처리가 cytokine 및 NO의 분비를 증가시킴으로써 대식세포 활성화를 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 초기 면역반응이 시작되면 면역세포 내 신호전달에 관여하는 MAPKs(ERK, JNK, p-38) 및 NF-κB의 인산화가 이루어지고, NF-κB가 최종 활성화되어 면역 방어기작을 나타내는 cytokine 및 NO의 분비에 영향을 미치는 것으로 보고된다(13).
앞선 결과에서 세포독성에 영향을 미치지 않는 농도인 62.5, 125 및 250 μg/mL의 농도로 JPS를 처리하여 대식세포 활성화 인자인 cytokine(TNF-α, IL-6)과 NO의 생성을 관찰한 결과 JPS의 처리는 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6와 NO의 분비능을 증가시키는 것으로 관찰되었다(Fig. 2A, B).
대식세포는 선천 및 적응 면역시스템에서 방어와 조절을 담당하는 면역세포로 외부로부터 유입되는 항원을 직접적 으로 제거하거나 무력화시키는 기능을 수행한다. 항원제시 세포로서 대식세포는 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-6와 nitric oxide(NO) 등과 같은 다양한 물질을 분비하여 자기 자신 또는 적응면역체계를 담당하는 T림프구를 활성화시킨다(8).
주박이란 무엇인가?
주박(酒粕)은 곡류와 효모, 누룩을 주원료로 막걸리나 청주를 양조하는 과정에서 생산되는 부산물로 흔히 술지게미 라고 한다(1). 영양학적으로 당질, 알코올, 유기산 및 효모 등을 함유하며, 그중 다당류와 단백질이 풍부하게 함유되어 있다고 보고된다(2).
마우스 유래 대식세포에 주박으로부터 분리한 다당 류를 처리했을 때, NO와 cytokine 증가를 유발하는 원인에 관한 면역기전은 무엇인가?
7 cell에 처리하였을 때 대식세포의 활성화의 지표인 NO와 cytokine(IL-6, TNF-α)의 분비가 증가되었다. 또한 이러한 NO와 cytokine의 증가의 원인에 관한 면역기전에 관하여 알아본 결과 JPS의 처리는 MAPKs (ERK, JNK, p-38)의 인산화를 촉진시켜 NF-κB의 활성을 유도하여 면역세포의 활성인자들의 분비를 촉진시킨 것으로 관찰되었다.
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