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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 4가지 다른 한국 잔디 품종에서 유기된 배발생 캘러스 계통들을 이용하여 Agrobacterium 형질전환 조건을 확립하여 위에서 언급한 문제점들을 어느 정도 최소 화 하고, 동시에 particle bombardment로 상 처를 유발시킨 후, Agrobacleriwn과 공동배양 을 하여 어느 정도 형질전환효율이 향상되는 지를 알아보고자 실험을 수행하였다.
- Agrobactrerium tumefaciense 이용한 형질전환을 하기 전에 particle bombardment를 이용한 전처리가전이된 유전자의 발현에 어떤 영향을 미치는가를 알아보았다 (Table 2). 일반적으로 형질전환 실험에서 한 가지 방법만을 사용하는 것이 보편적이나, 본 연구에서는 두 가지 방법을 병행하여 형질전환 효율을 향상시키고자 하였다.이 방법을 이용하여 참나리에서 는 3배 이상 높은 형질전환 효율을 나타내었다(남 등, 2004).
제안 방법
- Agrobactrerium tumefaciense 이용한 형질전환을 하기 전에 particle bombardment를 이용한 전처리가전이된 유전자의 발현에 어떤 영향을 미치는가를 알아보았다 (Table 2). 일반적으로 형질전환 실험에서 한 가지 방법만을 사용하는 것이 보편적이나, 본 연구에서는 두 가지 방법을 병행하여 형질전환 효율을 향상시키고자 하였다.
- 0)에 각각 1, 5, 15, 30, 60분간 침지시킨 후, 무균여과지에서 20분간 건조시킨다. 건조 후에 공동배양 배지 위에서 25+1℃, 3일간 암 조건에서 공동배양을 실시하고 나서, 세척배지 (MS액체배지, cefotaxime 300mg/l과 vancomycin 250mg/l)에서 6시간 배양한 후, 호르몬이 제거된 선발배지 (MS 고 체배지, cefotaxime 250mg/1)에서 10일간 25 ℃, 연속 명배양(약 1,500-2,000 lux) 조건하 에서 배양하였다. 형질전환은 하나의 페트리디쉬에 필터를 놓고 그 위에 100mg의 배발생 캘 러스 덩어리들을 메스를 이용하여 골고루 퍼지게 한 후 실시하였고, 실험은 4반복으로 실시하였다.
- 다양한 Zoysiagrass 4가지 품종들을 식물 재료 로 사용하여 AgrobacteriunT만 이용한 방법 그리고 particle bombardment로 배발생 캘러스에 상처를 낸 후, Agrobacteriuni으로 공동 배양 시키는 2가지 다른 형질전환 방법을 비교하였다. 예비실험에서 일반적으로 형질전환에 널리 사용되는 kanamycin과 PPT (phospinitricin)의 적정 선 발 농도에 대해서 실험하였는더], kanamycin의 경우 300mg/l 그리고 PPT의 경우는 50mg/l의 농도에서 가장 효과적인 선발 효율을 나타내었다.
- 또 하나의 시도로서 먼저 particle gun (PDS-100(yHe, Bio-Rad, U.S.A)을 이용하여 아무런 plasmid DNA도 들어있지 않은 텅스텐 입자로 배발생 캘러스에 상처를 입힌 후, 위의 경우처럼 Agrobactreium형질전환을 실시하였으며, 한편 particle bombardment 실험은 임(2001) 등의 방법을 아래와 같이 일부 변형하여 실시하였다. 먼저 50mg의 텅스텐 입자를 70% 에탄올에세척하고, 50% glycerol 500pl로 현탁 하였다.
- 멸균처리된 종자로부터 형질전환에 사용할 캘러스를 유기하기 위해 CIM (MS기본배지 ((Murashige and Skoog, 1962))에 2, 4-D 3 mg/1, sucrose 30g4 및 plant agar 5.5g4, pH 6.0)에 치상 후, 25±1℃ 의 암 조건에서 4주간 배양한 후, 형성된 캘러스 중에서 노란색의 잘 부서지는 배발생 캘러스를 선택하여 상기 CIM 에서 다른 성분은 동일하고 2, 4-D 농도만로 낮춘 증식배지로 옮겨 주었다.
- 형질전환에 사용된 벡터는 super binary vector인 pTOK233으로서 T-DNA 내부에 intron을 포함한 GUS ([}-glucuronidase), NPTII (neomycin phosphotransferase: kanamycin 저항성) 및 HPT (hygromycin phosphotransferase: hygromycin 저항성) 유전자를 포함하고 있으며, 이벡터를 Agrobacterium strain LBA4404에 도입하여, kanamycin 50mg/l과 hygromycin 50 가 포함된 AB배지에서 28℃에서 2일간 배양한 후, 형질전환에 이용하였다. 배발생 캘러스를 상기 벡터가 포함된 LBA4404 현탁액 (O.D60Qnm = 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0)에 각각 1, 5, 15, 30, 60분간 침지시킨 후, 무균여과지에서 20분간 건조시킨다. 건조 후에 공동배양 배지 위에서 25+1℃, 3일간 암 조건에서 공동배양을 실시하고 나서, 세척배지 (MS액체배지, cefotaxime 300mg/l과 vancomycin 250mg/l)에서 6시간 배양한 후, 호르몬이 제거된 선발배지 (MS 고 체배지, cefotaxime 250mg/1)에서 10일간 25 ℃, 연속 명배양(약 1,500-2,000 lux) 조건하 에서 배양하였다.
- 성숙종자를 70% 에탄올에서 1분간 침지하고, 멸균수로 1회 수 세 후에 4% NaOCl (유한락스)에 15분간 교반하면서 표면 살균 하였다. 살균된 종자는 멸균수로 3회 이상 세척한 후, 멸균된 여과지로 옮겨 건조한 후에 아래에 명시된 캘러스유도 배지 (Callus induction medium: CIM)로 치 상하였다.
- 선발 배지에서의 kaxianediyFFT (phospinotridn) 적정선발농도한국잔디류에서 형성된 배발생 캘 러스(Fig. la)를 향후 형질전환체선발 시에 적정한 kanamycin과 PPT농도를 조사하고자 재분화 배지에 hygromycin을 0-400mg/l까지 첨가하고 PPT의 경우에는 0-100mg/l의 농도로 각각 첨가하였다. 배발생 캘러스의 생존율은 hygromycin의 경우 100mg4의 농도에서 적절한 선발이 이루어졌으나 (임등, 2001), kanamycin을 선발 배지에 첨가하여 형질전환 계통을 선발 시에는 단자엽이 자연적으로 kanamycin에 대해 저항성을 가지고 있으므로 선발이 어려운 단점이 있다.
- japonica, S94, Sinica Common, 안양중지)의 종자를 절편체로 사용하였다. 성숙종자를 70% 에탄올에서 1분간 침지하고, 멸균수로 1회 수 세 후에 4% NaOCl (유한락스)에 15분간 교반하면서 표면 살균 하였다. 살균된 종자는 멸균수로 3회 이상 세척한 후, 멸균된 여과지로 옮겨 건조한 후에 아래에 명시된 캘러스유도 배지 (Callus induction medium: CIM)로 치 상하였다.
- 일반적으로 형질전환 실험에 선발 마커로 많이 사용되어지는 kanamycin과 PPT의 적정 선발 농도를 조사하고 자 본실험의 선발 배지에 첨가되는 kanamycin (0, 10, 50, 100, 200, 300, 400 mg/1)과 PPT (0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 mg/1)을 재분화 배지 (MS기본염 류, BA 0.5mg4, sucrose 30g/1, pH 6.0)에 첨가하여 실험하였다. 지름 2-3mm의 배발생 캘러스를 25개/plate로 배양하였고, 반복은 25개가 배양된 plate 10개로 10반복하였으며, 배양 6주 후에 절편체의 고사율과 신초 형성율을 조사하였다.
- 0)에 첨가하여 실험하였다. 지름 2-3mm의 배발생 캘러스를 25개/plate로 배양하였고, 반복은 25개가 배양된 plate 10개로 10반복하였으며, 배양 6주 후에 절편체의 고사율과 신초 형성율을 조사하였다.
- 첫 번째 방법인 오직 Agrobacterium을 통하여 형질전환시킨 경우 그리고 두 번째 방법인 particle gun 으로 상처를 먼저 유기하고 Agrobacterium으로 형질전환한 배발생캘러스 들을 형질전환 직후에 cefotaxime 250mg4, vancomycin 200mg4과 hygromycin lOOmg/1 첨가된 1차 선발배지에서 3주간 배양한 후, 2차 선발배지 (cefotaxime 200mg/l, vancomycin lOOmg/1, hygromycin 50mg/l)로 옮겨 재분화 를 유도하였다. 2차 선발배지에서 배양 8주 후 에, 살아 남은 캘러스들을 신선한 동일성분의 배지로 옮겨 주어 재분화를 유도하였다.
- 항생제 및 제초제 선발 배지에서 선발된 배 발 생캘러스에서 유전자의 도입 및 발현의 확인은 먼저 쉽게 확인할 수 있는 GUS 유전자를 이용하여 실시하였다. 형질전환 10일, 4주 그리고 12주가 경과된 시점에서 각각의 방법을 이용하여 형질전환된 배발생 캘러스들의 GUS 유전자의 발현 분석을 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 조사하였다.
- 건조 후에 공동배양 배지 위에서 25+1℃, 3일간 암 조건에서 공동배양을 실시하고 나서, 세척배지 (MS액체배지, cefotaxime 300mg/l과 vancomycin 250mg/l)에서 6시간 배양한 후, 호르몬이 제거된 선발배지 (MS 고 체배지, cefotaxime 250mg/1)에서 10일간 25 ℃, 연속 명배양(약 1,500-2,000 lux) 조건하 에서 배양하였다. 형질전환은 하나의 페트리디쉬에 필터를 놓고 그 위에 100mg의 배발생 캘 러스 덩어리들을 메스를 이용하여 골고루 퍼지게 한 후 실시하였고, 실험은 4반복으로 실시하였다.
대상 데이터
- 식물재료로는 한국잔디의 품종 중 4개 품종(Z. japonica, S94, Sinica Common, 안양중지)의 종자를 절편체로 사용하였다. 성숙종자를 70% 에탄올에서 1분간 침지하고, 멸균수로 1회 수 세 후에 4% NaOCl (유한락스)에 15분간 교반하면서 표면 살균 하였다.
- 1 M spermidine 20 ill 을 차례로 넣어 70% 에탄올로 한 번 더 수세한 후, 최종적으로 100% 에탄올을 첨가하여 최종 10ml로 맞추어 -20℃에 보관하였다. 여기서 163μ1씩 현탁액을 microcarrier에 분주하여 형질전환에 사용하였고, 페 트리디쉬 중앙의 지름 3.5cm 안에 약 250mg의 배발생 캘러스를 골고루 퍼지게 한 후 시행하였고, 각 1회 실험에 10개의 페트리디쉬가 사용되었다. Helium 가스의 압력조건과 사출거리는 임 등(2001)의 방법에 따라 시행하였다.
이론/모형
- 5cm 안에 약 250mg의 배발생 캘러스를 골고루 퍼지게 한 후 시행하였고, 각 1회 실험에 10개의 페트리디쉬가 사용되었다. Helium 가스의 압력조건과 사출거리는 임 등(2001)의 방법에 따라 시행하였다.
- 항생제 및 제초제 선발 배지에서 선발된 배 발 생캘러스에서 유전자의 도입 및 발현의 확인은 먼저 쉽게 확인할 수 있는 GUS 유전자를 이용하여 실시하였다. 형질전환 10일, 4주 그리고 12주가 경과된 시점에서 각각의 방법을 이용하여 형질전환된 배발생 캘러스들의 GUS 유전자의 발현 분석을 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 조사하였다.
성능/효과
- 배발생 캘러스의 생존율은 hygromycin의 경우 100mg4의 농도에서 적절한 선발이 이루어졌으나 (임등, 2001), kanamycin을 선발 배지에 첨가하여 형질전환 계통을 선발 시에는 단자엽이 자연적으로 kanamycin에 대해 저항성을 가지고 있으므로 선발이 어려운 단점이 있다. Kanamycin lOOmg/1 가 첨가된 배지에서 10% 미만의 신초 형성율을 나타내었으며, 300m"l의 농도에서 모든 캘러스의 생장이 억제되었고, 80-85%의 캘러스가 고사하였다. 그러나 kanamycin의 경우에는 200mg/l의 농도에서 어느 정도 선발이 가능하였으나, 일부 배발생 캘러스의 경우 체세포배 형성도 관찰되었다.
- Agrobacterium tiunefaciens를 이용한 한국 잔디류의 GUS 유전자 발현 효율에 영향을 미치는 요인 중, 박테리아 농도(O.D600nm)의 효과와 감염 시간을 조사하였는데, 박테리아 농도 조사 실험에서는 O.D600nm = L8에서 가장 높은 GUS 유전자 발현 정도를 나타내었다 (Table 1). 그러나, 이 농도에서 형질전환된 배발생 캘러스 들은 배양 2-4주 사이에 박테리아에 의한 심한 오염율을 나타내어 형질전환 효율을 계산하는 데 어려움이 발생하였으므로, 향후 Agrobacterium을 이용한 형질전환에는 O.
- 예비실험에서 일반적으로 형질전환에 널리 사용되는 kanamycin과 PPT (phospinitricin)의 적정 선 발 농도에 대해서 실험하였는더], kanamycin의 경우 300mg/l 그리고 PPT의 경우는 50mg/l의 농도에서 가장 효과적인 선발 효율을 나타내었다. Agrobacterium을 이용한 형질전환은 Agrobacterium을 2일간 배양시킨 다음, 박테리 아 농도를 O.D 600nm=1.0 -1.2로 맞추고, 배발생 캘러스를 30분간 감염시키는 방법이 효과적이었는데, particle bombardment 를 이용하여 캘러스에 상처를 유발시킨 후, Agrobacterium, 으로 감염시키면 3배 이상 높은 형질전환 수율을 획득할 수 있었다. 이상의 결과는 한국잔디형질전환에 있어서 particle bombardment과 Agrobacterium을 병행하여 실시한 최초의 보고이고, 이러한 시스템을 기반으로 하여 향후 한국 잔디를 포함하여 다른 난지형 및 한 지형 잔디의 품종 개량에 널리 이용되리라 생각된다.
- 이 방법을 이용하여 참나리에서 는 3배 이상 높은 형질전환 효율을 나타내었다(남 등, 2004).표 2에 나타난 것처럼 hygromycin 이 첨가된 배지에서만 선발한 경우, Agrobacterium 만 이용하여 형질전환시킨 경우보다 20% 정도 낮은 선발 효율을 나타내었으나, hygromycin과 kanamycin 이 2가지 항생제가 첨가된 선발 배 지에서 선발 시에는 particle bombardment> 병행하여 형질 전환 한 방법이 escape의 발생도 감소하고 GUS 유전자 발현에 있어서도 30% 향상된 결과를 나타내었다 (Table 2).형질전환 과정에서 Agmbacterium 만 사용하는 경우는 식물조직의 상태에 따라서 효율에 영향을 받지만, particle bombardment를 이용하여 식물체 조직에 상처를 유발시킨 후, Agrobacterium 을 감염시키면 표피세포가 얇은 캘러스 조직뿐만 아니라 분열 조직, 줄기 및 잎 등의 다양한 식물조직 에서도 효과적일 것이라고 추론하였다 (남등, 2004).
- 2의 농도로 배발생 캘러스들 을 감염시킨 후, 공동배양하는 것이 효과적이라고 사료된다. 한편 박테리아 감염 시간이 형질전환 효율에 미치는 영향을 살펴보면, 4가지 잔디 품종들에서 유기된 배발생 캘러스를 agmbacteriwn과 30분 동안 감염시켰을 경우, GUS 유전자의 발현도 다른 처리구에 비해 비교적 높은 경향을 나타내었고, 선발 과정에서 발생하는 박테리아에 의한 감염도 거의 나타나지 않았다 (Fig 3).
후속연구
- 2로 맞추고, 배발생 캘러스를 30분간 감염시키는 방법이 효과적이었는데, particle bombardment 를 이용하여 캘러스에 상처를 유발시킨 후, Agrobacterium, 으로 감염시키면 3배 이상 높은 형질전환 수율을 획득할 수 있었다. 이상의 결과는 한국잔디형질전환에 있어서 particle bombardment과 Agrobacterium을 병행하여 실시한 최초의 보고이고, 이러한 시스템을 기반으로 하여 향후 한국 잔디를 포함하여 다른 난지형 및 한 지형 잔디의 품종 개량에 널리 이용되리라 생각된다.
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