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문제 정의
- 주입된 오존 또는 UV조사는 원수내에 존재하는 미생물뿐만 아니라 유기물에 의해서도 소비되기 때문에 미생물의 불활 성화 효율을 저감시키는 요인이 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 다양한 원수를 대상으로 미생물의 불활성화 실험이 수행되었다.
- 막에 의한 처리의 경우 시설비가 고가이며 미생물을 단지 분리해내는 방법이므로 분리된 미생물을 다시 처리해야 하는 2차적인 문제를 안고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 한계점을 극복하고자 높은 소독효과로 알려져 있는 오존과 UV 공정을 평가하고자 하였다. 또한 대체소독 기법개발의 일환으로서 소독뿐만 아니라 높은 산 화효과도 기대할 수 있는 오존/UV 공정을 적용하고자 하였다 (강, 1993).
- 우리나라에서도 이러한 문 제점들에 대하여 중요성이 인식되고 있지만 체계적인 연구 및 보고는 아직 많지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 최근 분자 생물학 분야에서 널리 사용되고 있는 PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응)방법을 수처리 분야에 적용하고자 하였으며 (Hidetoshi, 1999 ; Chang, 2002), 이러한 PCR 방법에 의하여 원수 내에 미량으로 존재하는 다양한 종류의 미생물을 동시에 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다. 미생물 모니터링을 위한 PCR법 의 원리를 Fig.
- 따라서 본 연구에서는 이러한 한계점을 극복하고자 높은 소독효과로 알려져 있는 오존과 UV 공정을 평가하고자 하였다. 또한 대체소독 기법개발의 일환으로서 소독뿐만 아니라 높은 산 화효과도 기대할 수 있는 오존/UV 공정을 적용하고자 하였다 (강, 1993).
제안 방법
- Fig. 4에서 그룹별로 분류된 sample에 대하여 각각의 염기서열 분석이 수행되었으며 얻어진 염기서열을 통하여 일 치하는 염기서열을 갖는 미생물을 조사하는 과정(WWW. ncbi.nlm.nif.gov/blast/Blast.cgi, www.firstmarket.com cutter/cut2.html)이 수행되었다. 이러한 과정에 의하여 각 대상원 수 및 처리수에서 존재하는 세균의 종류를 Table 3에 나타내었다.
- Cloning된 산물올 다시 증폭하여 각 colony에 대한 master plate를 제작하였다. Nucleotide sequence의 검출을 위하여 100 ㎍/L의 ampicillin 이 포함된 LB(Luria-Bertani)media master plate에서 colony# 선택하여 배양 후 배양액을 har- vest한 뒤 Plasmid extraction kit(Bioneer, Korea)를 이용해 plasmid DNA small-scale miniprep 과정을 수행하여 얻어진 DNA를 분석하였다 (Edwards, 1989).
- PCR법에 의하여 다양한 수원에 존재하는 세균들을 조사하였으며 오존, UV 및 오존/UV 복합처리 공정들에 의하여 처리한 결과, 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- coli 479(ATCC 35150)균주 3 /zg/L 두 힘께 주입되었다. Primer (2 ㎍/L)와 Conventional PCR (Bioneer, Korea) 제품의premix 용액(20 ㎍/L)을 증류수로 mass-up하여 전체 반웅용액은 총 50 ㎍/L를 사용하여 실시하였다. PCR 증폭에 사용된 Perkin Elmer-2700의 조건은 초기 denaturation 단계에서 94℃ 2분을 유지하였으며, 45 ℃ 1분 30초, 75 ℃ 2분에서 25 cycle을 실시한 후, 최종 단계인 DNA 합성은 72℃에서 10분 동안 실시하였다.
- 원수의 특성 및 배경 유기물질(Background organics)을 파악하기 위하여 pH, TOC, BOD5, COD, UV254 값을 측정하였다. P니의 측정은 pH meter (Model 420A, Orion)를 사용하였으며, TOC는 Dohrmann DC-180 analyzer로 분석하였다, UV254는 UV/VIS spectrophtometer (Varian Cary 3C)를 이용하였다.
- 오존은 고순도 산소를 이용하여 오존 발생기(Ozonia, CFS, USA)로 부터 발생되었으며, 반웅기내의 산기관을 통해 가스 상태의 오존이 주입되었다. 가스 상태의 오존은 flow meter를 이용하여 0.6 L/min의 일정한 유량으로 유지하였으며 주입오존 농도는 0.8 으로 조절하였다. 반웅기는 UV조사가 용이하도록 중앙에 석영관을 부착하였고, low pressure Hg Arc.
- 대상원수내에 존재하는 수인성 세균을 검출하기 위하여 모든 세균에 존재하는 16s rRNA 유전자 부위에서 모든 세균을 증폭시킬 수 있는 특정 primer를 Table 2와 같이 작성하였다.
- 나머지 1, 3, 5, 6, 10, 11, 15, 18, 20은 각각 다른 양상을 보였다. 따라서 염기서열분석을 위해 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 15, 16, 18, 20둥 총 12개의 sample들로 분류하였다.
- 8 mg/L-min으로 5분동안 주입되어 총 주입 된 오존 농도를 4 mg/L로 일정하게 하였다. 또한 UV 조사 는 0.42 W/L의 intensity를 갖는 UV 램프를 사용하여 종 5분 동안 조사되었다. 오존/UV 공정에서는 같은 조건에서 오존과 UV를 동시에 사용하였다.
- 실제 오존 주입량은 5분 동안 4 mg/L가 되도록 하였으며, UV 조사시 간도 이와 동일하게 5분 동안 수행되었다. 반웅기에서 배출되는 오존 가스는 2% KI 용액으로 trap하여 반응하지 않고 배출되는 오존량을 측정하였다.
- 원수의 특성 및 배경 유기물질(Background organics)을 파악하기 위하여 pH, TOC, BOD5, COD, UV254 값을 측정하였다. P니의 측정은 pH meter (Model 420A, Orion)를 사용하였으며, TOC는 Dohrmann DC-180 analyzer로 분석하였다, UV254는 UV/VIS spectrophtometer (Varian Cary 3C)를 이용하였다.
- coli를 선택) 올 spiking하여 시료에 PCR 반응의 억제자(inhibitor)가 있는지의 여부를 알아보았다. 이를 위하여 각 대상원수 단독으로 PCR을 실시하거나(S), 대상원수에 E.Coil를 spiking하여 수행, 또는 E.coli만을 대상으로 PCR을 수행(P)하여 처리 전후의 상태를 비교하였다. 그 결과 방튜수에서도 PCR 증폭이 성공적으로 일어나 PCR반옹의 억제자가 존재하지 않음을 알 수 있었다.
- PCR 증폭에 사용된 Perkin Elmer-2700의 조건은 초기 denaturation 단계에서 94℃ 2분을 유지하였으며, 45 ℃ 1분 30초, 75 ℃ 2분에서 25 cycle을 실시한 후, 최종 단계인 DNA 합성은 72℃에서 10분 동안 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA band가 확인되었으며, One shot® chemical transformation kit를 이용하여 cloning 하였다. Cloning된 산물올 다시 증폭하여 각 colony에 대한 master plate를 제작하였다.
- 4에서와 같이 염기서열에 대한 분석에 앞서 필요한 cloning 과정에서 같은 세균에서 증폭된 PCR 산물이 여러 개의 clone을 형성하므로 PCR5. 증폭된 산물을 적절한 제한 효소로 절단하여 같은 clone들로 그룹화하였다.
- 각 대상원수에 PCR에 의하여 세균을 증폭하였을 때, 정수에서는 증폭된 산물을 보이지 않은 반면 상수원수와 방류수의 경우, 세균이 증폭되었음을 알 수 있었다. 특히 하수 방류수와 같이 유기물 오염정도가 비교적 높은 시료의 경우, 여러 인자에 의하여 PCR이 억제될 가능성이 있으므로, 각 대상 시료수에 일정량의 세균(E.coli를 선택) 올 spiking하여 시료에 PCR 반응의 억제자(inhibitor)가 있는지의 여부를 알아보았다. 이를 위하여 각 대상원수 단독으로 PCR을 실시하거나(S), 대상원수에 E.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 원수는 다양한 수원에 대한 데이터를 확보하고자 W시의 상수원수 (Drinking Water Source, DRWS), 정수 (Drinking Water, DRW) 및 하수 처리장 방류수 (Sewage Treatment Plant Effluent Water, SEW)를 선정하였다. 상수원수의 경우, W시 정수처리장의 유입수로 사용되는 섬강의 표층에서 채수되었으며, 정수로는 W시 정수처리장의 처리수가 사용되었다.
이론/모형
- 1) 다양한 원수(상수원수, 정수 및 하수 방류수)내에 존재하는 세균을 검출하기 위하여 Polymerase Chain Reaction (PCR) 법을 효과적으로 적용하였다. PCR법에 의하여 각 원수내에 존재하는 다양한 세균 종올 한번에 검출하는 것이 가능하였으며 더 나아가 환경 분야에 관련된 수인성 세균의 검출에 보다 폭넓은 활용이 가능하리라 기대된다.
- 원수내 존재하는 다양한 미생물을 한번에 분석하기 위하여 PRA (PCR-fragment length polymorphic analysis)와 PSA (PCR-sequence analysis)의 두 가지 방법 모두 사용되었다. PCR에 사용된 시료(DNA template)는 10 ㎍/L이였으 며, 시료내 방해물질(inhibitor)의 존재를 알아보기 위하여 positive contr이으로서 E.
성능/효과
- 2) 각 세균을 검줄한 결과, 정수에서는 검출된 세균이 없었으며 상수원수의 경우, 원수에서 58 종, 오존 처리수에서 7 종, UV 처리수에서 5종, 오존/UV 처리수에서는 3 종이 검출되었다. 하수 방류수의 경우, 원수에서 13 종, 오존 처리수에서 9 종, UV 처리수에서 6종, 오존/UV 처리수에서는 5종이 검출되었다.
- 3은 PCR 산물을 Haem 제한효소로 절단하여 전기영동을실시한 후 dendrogram을 이용해 그룹화한 결과를 보여주고 있다. 20개의 colony를 선택한 후 동일한 양상을 보이는 2group-2, 4, 8, 12, 14 groups)- 16, 19 group을 구별해 낼 수 있었고 (그룹별 왼쪽에 표기된 수치 들은 두 개의 라인에 대한 유사성올 나타냄), 주입된 Ecoli 와 동일한 양상을 보이는 13과 17번 samplee TOPO cloning kits의 vector primer를 이용해 PCR올 수행한 결과 유일한 vector로 판명되었다. 나머지 1, 3, 5, 6, 10, 11, 15, 18, 20은 각각 다른 양상을 보였다.
- 이러한 결과로부터 PCR 증폭이 성 공적으로 수행되었으며, prim이.가 적절하게 제조되었음을 확인하였다.
- 3에는 각 대상원수의 처리수에 대한 PCR 결과를 나타내었다. 각 대상원수에 PCR에 의하여 세균을 증폭하였을 때, 정수에서는 증폭된 산물을 보이지 않은 반면 상수원수와 방류수의 경우, 세균이 증폭되었음을 알 수 있었다. 특히 하수 방류수와 같이 유기물 오염정도가 비교적 높은 시료의 경우, 여러 인자에 의하여 PCR이 억제될 가능성이 있으므로, 각 대상 시료수에 일정량의 세균(E.
- 각 대상원수의 일반적인 수질 특성을 Table 1에 나타내었다. 각 대상원수의 pH는 6.6에서 7.3사이에서 큰 차이를 보이지 않았으며, TOC는 하수 방류수에서 다른 대상원수 에 비해 2배에서 5배까지 다소 높은 값을 나타내었다. 주입된 오존 또는 UV조사는 원수내에 존재하는 미생물뿐만 아니라 유기물에 의해서도 소비되기 때문에 미생물의 불활 성화 효율을 저감시키는 요인이 될 수 있다.
- 원수에서의 결과를 비교해볼 때, 상수원수에 비하여 하수 방류수에서약 4배 정도의 적은 수의 세균 종이 검출되었다. 각 종에대한 정량적인 결과는 본 연구에서 제시하지 않았으나, 상수원수에 비해 하수 방류수에는 검출된 각종에서 박테리아의 수가 비교적 많다는 것이 관찰되었다. 처리수에 대한 결과를 살펴보면, 상수원수와 하수 방류수 모두에서 오존/UV 공정에 의하여 세균의 제거효율이 가장 높다는 것을 알 수 있었다.
- 오존/UV 공정에서는 같은 조건에서 오존과 UV를 동시에 사용하였다. 결과를 살펴보면, 정수 (DRW)의 경우 원수에서 아무런 세균도 검출되지 않았다. 반면 상수원수(DRWS)에서는 원수에서 58종의 세균이 검출되었으며 오존 처리수에서는 5종, UV 처리수에서는 7종, 오존/UV 처리수에서는 3종이 각각 검출되었다.
- 하수 방류수의 경우, 원수에서 13 종, 오존 처리수에서 9 종, UV 처리수에서 6종, 오존/UV 처리수에서는 5종이 검출되었다. 결과적으로 오존/UV가 다양한 세균을 제어하기위하여 가장 효과적인 공정으로 판명되었다.
- coli만을 대상으로 PCR을 수행(P)하여 처리 전후의 상태를 비교하였다. 그 결과 방튜수에서도 PCR 증폭이 성공적으로 일어나 PCR반옹의 억제자가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이와 같이 direct PCR 증폭결과로부터 정수를 제외한 상수원수 및 하수 방류수에서 처리 전후의 S, S+P, P 모두에서 992bp에서 증폭되었음을 알 수 있었다.
- Beta pro- teobacterium sp.들이 오존, UV, 오존/UV 처리에 대하여 강한 저항력올 갖고 있다는 것을 알 수 있었다. 참고적으로 이러한 세균들의 특성은 다음과 같다.
- 반면 상수원수(DRWS)에서는 원수에서 58종의 세균이 검출되었으며 오존 처리수에서는 5종, UV 처리수에서는 7종, 오존/UV 처리수에서는 3종이 각각 검출되었다. 또한 하수 방류수의 경우 원수에서 13종의 세균이 검출되었으며, 오존 처리수에서 9종, UV 처리수에서 6종 그리고 오존/UV 처리수에서는 5종이 각각 검출되었다. 원수에서의 결과를 비교해볼 때, 상수원수에 비하여 하수 방류수에서약 4배 정도의 적은 수의 세균 종이 검출되었다.
- 결과를 살펴보면, 정수 (DRW)의 경우 원수에서 아무런 세균도 검출되지 않았다. 반면 상수원수(DRWS)에서는 원수에서 58종의 세균이 검출되었으며 오존 처리수에서는 5종, UV 처리수에서는 7종, 오존/UV 처리수에서는 3종이 각각 검출되었다. 또한 하수 방류수의 경우 원수에서 13종의 세균이 검출되었으며, 오존 처리수에서 9종, UV 처리수에서 6종 그리고 오존/UV 처리수에서는 5종이 각각 검출되었다.
- 또한 하수 방류수의 경우 원수에서 13종의 세균이 검출되었으며, 오존 처리수에서 9종, UV 처리수에서 6종 그리고 오존/UV 처리수에서는 5종이 각각 검출되었다. 원수에서의 결과를 비교해볼 때, 상수원수에 비하여 하수 방류수에서약 4배 정도의 적은 수의 세균 종이 검출되었다. 각 종에대한 정량적인 결과는 본 연구에서 제시하지 않았으나, 상수원수에 비해 하수 방류수에는 검출된 각종에서 박테리아의 수가 비교적 많다는 것이 관찰되었다.
- 그 결과 방튜수에서도 PCR 증폭이 성공적으로 일어나 PCR반옹의 억제자가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이와 같이 direct PCR 증폭결과로부터 정수를 제외한 상수원수 및 하수 방류수에서 처리 전후의 S, S+P, P 모두에서 992bp에서 증폭되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 수중에 미생물의 존재여부의 확인은 가능하나 구체적인 미생물 종을 알아보기 위해서는 16s rRNA 부위의 염기서열에 대한 분석이 요구되었다.
- 각 종에대한 정량적인 결과는 본 연구에서 제시하지 않았으나, 상수원수에 비해 하수 방류수에는 검출된 각종에서 박테리아의 수가 비교적 많다는 것이 관찰되었다. 처리수에 대한 결과를 살펴보면, 상수원수와 하수 방류수 모두에서 오존/UV 공정에 의하여 세균의 제거효율이 가장 높다는 것을 알 수 있었다. 또한 Flavobacterium sp.
후속연구
- 1) 다양한 원수(상수원수, 정수 및 하수 방류수)내에 존재하는 세균을 검출하기 위하여 Polymerase Chain Reaction (PCR) 법을 효과적으로 적용하였다. PCR법에 의하여 각 원수내에 존재하는 다양한 세균 종올 한번에 검출하는 것이 가능하였으며 더 나아가 환경 분야에 관련된 수인성 세균의 검출에 보다 폭넓은 활용이 가능하리라 기대된다. 현재까지 문제점으로는 세균을 정량적 으로 검출하는 것이 다소 복잡하여 보다 쉽게 접근하는 방법을 모색할 필요가 있으며 수인성 세균이외에 감엄 성이 없는 세균의 검출이 가능하기 때문에 이러한 단점도 보완해야할 필요성이 있다고 사료된다.
- , Beta proteo- bacterium sp.들이 오존, UV, 오존/UV 처리에 대하여 강한 저항력을 보였으며, 이에 대하여 보다 세밀한 처리 실험이 요구되었다.
- 는 지금까지 임상적 중요성은 보고 되지는 않았다. 특히 Pseudomonas aerugi- nosa는 인체에 유해하기 때문에 오존 및 UV에 의한 제거 효율에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- PCR법에 의하여 각 원수내에 존재하는 다양한 세균 종올 한번에 검출하는 것이 가능하였으며 더 나아가 환경 분야에 관련된 수인성 세균의 검출에 보다 폭넓은 활용이 가능하리라 기대된다. 현재까지 문제점으로는 세균을 정량적 으로 검출하는 것이 다소 복잡하여 보다 쉽게 접근하는 방법을 모색할 필요가 있으며 수인성 세균이외에 감엄 성이 없는 세균의 검출이 가능하기 때문에 이러한 단점도 보완해야할 필요성이 있다고 사료된다.
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