[ ${\alpha}$ ]-갈락토올리고 당인 melibiose, raffinose와 stachyose의 ${\alpha}-1,6$으로 결합된 D-galactosyl 잔기를 완전히 가수분해하는 것으로 확인된 Bacillus licheniformis YB-42의 ${\alpha}-galactosidase$는 사멸기에 도달하였을 때 배양상등액에서 최대활성을 보였다. ${\alpha}$-갈락토올리고 당의 가수분해 정도를 TLC와 환원당 생성량으로 분석한 결과, ${\alpha}-galactosidase$는 melibiose, raffinose, stachyose 순서로 가수분해 활성이 높았다. 반응산물인 당을 첨가하여 반응하였을 때 첨가 된 반응산물에 따라 가수분해 활성의 저해정도가 다르게 나타났으며, galactose에 의한 저해도가 가장 높았다. 첨가된 당의 농도 (20 mM)가 기질과 동일할 때는 가수분해 활성의 저해도가 미미하였으며 5배 농도로 첨가하였을 때도 가수분해 활성의 저해정도가 높지 않았다. 한편 소량의 효소로melibiose를 가수분해 하였을 때 반응초기에 TLC 상에서 기질보다 이동도가 낮은 물질이 생성되었으며, 이로보아 B. licheniformis YB-42의 ${\alpha}-galactosidase$는 당 전이활성을 갖는 것으로 여겨진다. 또한 대두분 추출액을 ${\alpha}-galactosidase$로 처리한 후 최종 반응산물을 분석한 결과, 대두분에 존재하는 raffinose와 stachyose가 완전히 가수분해 되었다.
[ ${\alpha}$ ]-갈락토올리고 당인 melibiose, raffinose와 stachyose의 ${\alpha}-1,6$으로 결합된 D-galactosyl 잔기를 완전히 가수분해하는 것으로 확인된 Bacillus licheniformis YB-42의 ${\alpha}-galactosidase$는 사멸기에 도달하였을 때 배양상등액에서 최대활성을 보였다. ${\alpha}$-갈락토올리고 당의 가수분해 정도를 TLC와 환원당 생성량으로 분석한 결과, ${\alpha}-galactosidase$는 melibiose, raffinose, stachyose 순서로 가수분해 활성이 높았다. 반응산물인 당을 첨가하여 반응하였을 때 첨가 된 반응산물에 따라 가수분해 활성의 저해정도가 다르게 나타났으며, galactose에 의한 저해도가 가장 높았다. 첨가된 당의 농도 (20 mM)가 기질과 동일할 때는 가수분해 활성의 저해도가 미미하였으며 5배 농도로 첨가하였을 때도 가수분해 활성의 저해정도가 높지 않았다. 한편 소량의 효소로melibiose를 가수분해 하였을 때 반응초기에 TLC 상에서 기질보다 이동도가 낮은 물질이 생성되었으며, 이로보아 B. licheniformis YB-42의 ${\alpha}-galactosidase$는 당 전이활성을 갖는 것으로 여겨진다. 또한 대두분 추출액을 ${\alpha}-galactosidase$로 처리한 후 최종 반응산물을 분석한 결과, 대두분에 존재하는 raffinose와 stachyose가 완전히 가수분해 되었다.
The maximum productivity of ${\alpha}-galactosidase,$ capable of hydrolyzing completely ${\alpha}-D-l,6-galactopyranosyl$ linkages within oligomeric substrates such as melibiose, raffinose and stachyose to liberate galactose residue, was reached to 718 mU/ml in the culture filt...
The maximum productivity of ${\alpha}-galactosidase,$ capable of hydrolyzing completely ${\alpha}-D-l,6-galactopyranosyl$ linkages within oligomeric substrates such as melibiose, raffinose and stachyose to liberate galactose residue, was reached to 718 mU/ml in the culture filtrate of Bacillus licheniformis at death phase. The ${\alpha}-galactosidase$ was identified to show different efficiencies for hydrolyzing the ${\alpha}-galactooligosaccharides$ according to analysis of reaction products by both TLC and quantification of the liberated reducing sugars. The enzyme was active on ${\alpha}-galactooligosaccharides$ in the order of melibiose, raffinose, and stachyose. Though the hydrolyzing activity of enzyme was faintly inhibited by reaction products such as galactose, glucose and sucrose with amounts of five folds more than the added substrates (20 mM), the largest inhibition of enzyme activity was caused by galactose among the end products. Unknown compound, which migrated slower than melibiose on TLC, was detected during hydrolysis reaction of melibiose, suggesting that the ${\alpha}-galactosidase$ has a glycosyl transferase activity. In addition, the enzyme was able to hydrolyze efficiently raffinose and stachyose existed in the soluble extract of soybean meal.
The maximum productivity of ${\alpha}-galactosidase,$ capable of hydrolyzing completely ${\alpha}-D-l,6-galactopyranosyl$ linkages within oligomeric substrates such as melibiose, raffinose and stachyose to liberate galactose residue, was reached to 718 mU/ml in the culture filtrate of Bacillus licheniformis at death phase. The ${\alpha}-galactosidase$ was identified to show different efficiencies for hydrolyzing the ${\alpha}-galactooligosaccharides$ according to analysis of reaction products by both TLC and quantification of the liberated reducing sugars. The enzyme was active on ${\alpha}-galactooligosaccharides$ in the order of melibiose, raffinose, and stachyose. Though the hydrolyzing activity of enzyme was faintly inhibited by reaction products such as galactose, glucose and sucrose with amounts of five folds more than the added substrates (20 mM), the largest inhibition of enzyme activity was caused by galactose among the end products. Unknown compound, which migrated slower than melibiose on TLC, was detected during hydrolysis reaction of melibiose, suggesting that the ${\alpha}-galactosidase$ has a glycosyl transferase activity. In addition, the enzyme was able to hydrolyze efficiently raffinose and stachyose existed in the soluble extract of soybean meal.
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제안 방법
대두분에는 raffinose, stachyose등이 존재하여 이들이 대두원료 의 식품이나 사료를 섭취하였을 때 고창증의 원인이 되는 것으 로 알려져 있다. B. licheniformis YB-42의 α-Galactosidase가 대 두분에 존재하는 a-galactoside 당을 분해하는지 조사하기 위해 대두분 추출액을 기질로 하여 효소반응을 수행하였다. 대두분 현 탁액(10%, w/v)의 상등액을 기질로 사용하여 과량의 효소를 첨 가하여 동물의 체온에 가까운 37℃에서 반응을 수행한 결과 대 두분에 존재하는 raffinose와 stachyose가 모두 분해된 것으로 확 인되었다(Fig.
B. licheniformis YB-42의 효소 생산성과 미생물의 성장정도와의 관계를 조사하기 위해 LB 액체배지에 배양하였으며, 이 때 균의 성장을 조사하기 위해 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 600 nm에서 흡광도를 즉정하였고, α-Galactosidase 의 생산성은 배양상등액에 존재하는 효소활성을 측정함으로써 결정하였다. B.
Melibiose, raffinose, slachyose를 각각 반응기질로 하여 효소반 응을 수행한 후에 반응액을 3분 동안 95℃에서 열처리한 후 원 심 분리하여 단백질 침전물을 제거하고 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수(4.3:5:0.7, (v/v)) 혼합용액을 전 개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시 키 기 위해서는 9 ml ethanol, 0.
In the presence of various concentrations of the end products such as galactose, glucose and sucrose, enzymatic hydrolysis of substrates (20 mM) including melibiose (A), raffinose (B), and stachyose (C) were done for Ih at 45℃, respectively. The end products were added to be final concentrations of 0 mM (lane 1), 10 mM (lanes 2 and 6), 20 mM (lanes 3 and 7), 100 mM (lanes 4, 5, 8 and 9), respectively. Lanes 5 and 9 are corresponding to the reaction mixture before enzymatic reaction.
본 연구에서는B. licheniformis YB-42가 생산하는 α-Galactosidase의 활성에 따 른 기질간 가수분해 효율을 비교하고 대두분에 존재하는 oc- galactoside 당의 가수분해능을 조사하였다.
α-Galactosidase의 기질간 가수분해 효율을 비교하기 위해 반응 중 생성된 환원당을 조사하였다. 0.
대상 데이터
licheniformis YB42을 α-Galactosidase의 생산 균으로 사용하였고, LB 액체배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10g; Nad, 5 g; water, 1 liter)를 이용하여 배양하였다. α-Galactosidase 조효소 액으로는 B. licheniformis YB-42를 LB 배지에 접종하여 37, C에 서 20시간 배양한 후 배양상등액을 ammonium sulfate (20-70%) 분획화, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 수 행하여 부분정제된 α-Galactosidase을 사용하였다(13).
된장에서 분리된 B. licheniformis YB42을 α-Galactosidase의 생산 균으로 사용하였고, LB 액체배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10g; Nad, 5 g; water, 1 liter)를 이용하여 배양하였다. α-Galactosidase 조효소 액으로는 B.
이론/모형
Reaction was performed for 10 min at 45℃ with various amounts of α-Galactosidase. Amounts of the liberatedreducing sugar were determined by DNS method.
The reaction was performed for 10 min at 45℃ with various amounts of the enzyme. The reducing sugars liberated from the soluble extract were quantificated by DNS method. Authentic sugar abbreviations are as follows: Sc, sucrose; Ga, galactose; R, raffinose;S, stachyose.
α-Galactosidase에 의한 가수분해 반응 후 유리된 환원당은 3, 5-dinitrosalycylic acid (DNS)방법으로 다음과 같이 정량함으로 써 즉정하였다. 0.
성능/효과
α-Galactosidase의 기질간 가수분해 효율을 비교하기 위해 반응 중 생성된 환원당을 조사하였다. 0.15jimol의 melibiose, raffinose, stachyose를 기질로 하여 효소량을 달리하여 10분간 반응시킨 결 과 melibiose는 0.25 U 이상의 효소를 사용하였을 때 0.14|imol 의 환원당이 생성되어 약 93% 이상의 기질이 가수분해 되었다 (Fig. 3A). Raffinose와 stachyose는 효소량이 증가함에 따라 유리 된 환원당이 계속적으로 증가하였으며, 1 U의 효소를 사용하였 을 때 raffinose의 경우 0.
한편 다수의 glycosyl hydrolases가 기질의 가수분해 반응 중에 당 전이 활성을 보이는 것으로 알려져 있으며, Bifidobacterium adolescentis의 α-Galactosidase도 당 전이활성 갖는 것으로 보고 되었다(15). B. lichenifonnis YB-42의 α-Galactosidase는 a-galactoside 당을 가수분해하는 과정에서 효소량이 적을 때 반응 초기에 기 질보다 이동도가 낮은 물질이 생성되는 것으로 확인되었다. Fig.
licheniformis YB-42의 효소 생산성과 미생물의 성장정도와의 관계를 조사하기 위해 LB 액체배지에 배양하였으며, 이 때 균의 성장을 조사하기 위해 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 600 nm에서 흡광도를 즉정하였고, α-Galactosidase 의 생산성은 배양상등액에 존재하는 효소활성을 측정함으로써 결정하였다. B. licheniformis YB-42는 3TC에서 빠르게 성장하 여 배양 10시간 만에 최대성장도를 나타냈고, 이후 배양시간에 따라 사멸함과 동시에 배양상등액에 존재하는 효소 활성이 지속 적인 증가율을 보였으며 배양 45시간째에서 α-Galactosidase의 생 산성이 718 mU/ml에 이르렀다(Fig. 1). B.
lichenifonnis YB-42의 α-Galactosidase는 a-galactoside 당을 가수분해하는 과정에서 효소량이 적을 때 반응 초기에 기 질보다 이동도가 낮은 물질이 생성되는 것으로 확인되었다. Fig. 4는 melibiose를 기질로 사용하였을 때 중간 반응산물을 TLC로 분석한 결과로 기질인 melibiose와 반응산물인 glucose, galactose외에 melibiose보다 이동도가 낮은 물질이 생성되었으며, 반응시간이 길어질수록 기질의 양과 함께 감소되는 것으로 나타 났다. 이로보아 반응 중간에 생성된 물질의 정체는 알 수 없으나, α-Galactosidase의 전이 활성에 의해 melibiose간의 결합이나, 반 응산물과 melibiose간의 결합으로 생성된 당 중합도가 3개 이상 인 물질로 추측된다.
3A). Raffinose와 stachyose는 효소량이 증가함에 따라 유리 된 환원당이 계속적으로 증가하였으며, 1 U의 효소를 사용하였 을 때 raffinose의 경우 0.13 μmol의 환원당이 생성되어 88.0%의 가수분해 효율을 보였고(Fig. 3B), stachyose의 경우 0.21 punol의 환 원당이 생성되어 70.8%의 가수분해 효율을 보였다(Fig. 3B). α-Galactosidase 반응 후 생성된 환원당의 양을 기준으로 하였을 때 도 TLC로 분석하였을 때와 동일하게 melibiose, raffinose, stachyose 순으로 가수분해 효율이 높은 것으로 확인되었다.
3B). α-Galactosidase 반응 후 생성된 환원당의 양을 기준으로 하였을 때 도 TLC로 분석하였을 때와 동일하게 melibiose, raffinose, stachyose 순으로 가수분해 효율이 높은 것으로 확인되었다.
2에 나타낸 바와 같이 60분간 반응하였을 때 melibiose는 20 mU, raffinose는 40 mU, stachyose는 80 mU의 효소를 사용하 였을 경우 대부분의 기질이 가수분해 되었고, 또한 melibiose는 40mU로 60분간, raffinose는 40mU로 90분간, stachyose는80mU로 90분간 각각 반응시켰을 때 완전히 가수분해 되는 것 으로 관찰되었다. 그러므로 B. lichenifonnis YB42의 α-Galactosidase 에 의한 가수분해 활성은 melibiose, raffinose, stachyose 순으로 높다는 사실이 확인되었다.
licheniformis YB-42의 α-Galactosidase가 대 두분에 존재하는 a-galactoside 당을 분해하는지 조사하기 위해 대두분 추출액을 기질로 하여 효소반응을 수행하였다. 대두분 현 탁액(10%, w/v)의 상등액을 기질로 사용하여 과량의 효소를 첨 가하여 동물의 체온에 가까운 37℃에서 반응을 수행한 결과 대 두분에 존재하는 raffinose와 stachyose가 모두 분해된 것으로 확 인되었다(Fig. 6A). 반응시간을 1 시간으로 고정하고 효소량을 달리하여 반응하였을 때 효소량이 증가할수록 대두분에 존재하는 raffinose와 stachyose의 양이 감소하였으며, 80 mU의 효소를 첨가하였을 때 이들이 대부분 가수분해 되었다(Fig.
licheniformis YB-42의 배양상등액으로부터 부분 정제된 a-galactosidase는 a-galactoside 당인 melibiose, rafEnose와 s* tachyose 모두 완전 가수분해 하는 것으로 확인되었다(13). 따 라서 효소의 활성과 반응시간에 따른 a-galactoside 당의 가수분 해 정도를 조사하기 위해 melibiose, raffinose, stachyose를 0.8 |imol로 하여 각각 효소량과 반응시간을 달리하여 반응하였을 때 효소량과 반응시간이 증가될수록 가수분해도가 높았다. 반응시간 과 효소량에 따른 기질간에 가수분해 효율을 TLC로 비교한 결 과 Fig.
8 |imol로 하여 각각 효소량과 반응시간을 달리하여 반응하였을 때 효소량과 반응시간이 증가될수록 가수분해도가 높았다. 반응시간 과 효소량에 따른 기질간에 가수분해 효율을 TLC로 비교한 결 과 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 60분간 반응하였을 때 melibiose는 20 mU, raffinose는 40 mU, stachyose는 80 mU의 효소를 사용하 였을 경우 대부분의 기질이 가수분해 되었고, 또한 melibiose는 40mU로 60분간, raffinose는 40mU로 90분간, stachyose는80mU로 90분간 각각 반응시켰을 때 완전히 가수분해 되는 것 으로 관찰되었다. 그러므로 B.
6A). 반응시간을 1 시간으로 고정하고 효소량을 달리하여 반응하였을 때 효소량이 증가할수록 대두분에 존재하는 raffinose와 stachyose의 양이 감소하였으며, 80 mU의 효소를 첨가하였을 때 이들이 대부분 가수분해 되었다(Fig. 6B). 따라서 cc-galactosidase에 의한 대두의 raHinose와 stachyose 가수분해 활 성은 대두에 존재하는 다른 성분에 의해 특별하게 저해되지 않는 것으로 추측된다.
전통 발효식품인 된장으로부터 a-galactosidas&의 생산균으로 분리된 YB-42 균주는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA 염기서열 (GenBank accession No AY601721)에 따라 B. licheniformis로 동정되었으며(13), 분리균의 α-Galactosidase 는melibiose, raffinose, stachyose에서 a-1, 6 결합의 a-galactose 잔 기를 완전히 가수분해 한다는 사실이 알려졌다. 본 연구에서는B.
따라서 cc-galactosidase에 의한 대두의 raHinose와 stachyose 가수분해 활 성은 대두에 존재하는 다른 성분에 의해 특별하게 저해되지 않는 것으로 추측된다. 한편 효소활성에 따른 대두분 분해산물의 환원당을 조사하기 위해 2%의 대두분 추출액을 기질로 하여 10 분간 가수분해 반응을 수행하였을 때 첨가된 효소량이 375 mU 이상에서 0.101 μmol의 최대 환원당이 발생하는 것으로 확인되 었다(Fig. 6C). 따라서 B.
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