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문제 정의
- 천년초선인장은 일반적으로 손바닥선인장으로 널리 알려진 제주산 백년초와는 달리 영하 20°C의 혹한에서도 생존이 가능해 수년에서 수십 년생의 경작이 가능한 다년생 식물이다. 본 연구에서는 천년초 선인장에 대한 다양한 연구의 일환으로 이의 생리활성 물질을 찾아내고자 하였고 이의 효과를 규명하고자 하였다.
가설 설정
- 2)Proton resonance multiplicity and coupling constants (Hz) are given in parenthesis.
- 5)No inhibitory zone was formed.
제안 방법
- 0 mL/min이고 UV detector는 280 nm로 하였다. HPLC로 측정 결과 가장 큰 면적을 보여준 18 min 구간의 물질을 정제하였다. 정제물은 Electron Impact Mass Spectrometer (EI-MS, MS Engine 5989A, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분자량을 측정하였다.
- 대조군으로 benzoic acid를 동일한 방법으로 측정하였으며 용매에 의한 항균 활성이 일어날 수 있어 고형분 시료를 녹인 양의 methanol만으로 공시험을 하였다. Liquid culture에서 생육저해 효과는 천연초 분리 정제물[Cheonnyuncho (Opuntia humifusa) compound(C.C)]의 몰농도를 달리한 liquid culture에 균주를 접종시킨 후 24시간 후 균의 생육정도를 UV/visible Spectrophotometer(Lambda 15, PerkinElmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 생육 저해 효과를 알아보았다. 대조군으로 C.
- 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(μg/mL)을 RC50으로 나타냈으며, 기존 항산화제인 α-tocopherol 및 BHA와 비교하였다(9). TBA법에 의한 지질과산화 억제력을 측정하기 위한 기질 용액은 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0)와 ethanol을 4:1로 혼합한 용매에 linoleic acid를 0.03 M이 되도록 첨가하여 제조하였다. 이 기질 용액 20 mL에 0.
- , Tokyo, Japan)를 접착시키고 30°C에서 24시간 동안 배양한 후 형성된 저해 부위의 크기(mm)를 측정하였다. 대조군으로 benzoic acid를 동일한 방법으로 측정하였으며 용매에 의한 항균 활성이 일어날 수 있어 고형분 시료를 녹인 양의 methanol만으로 공시험을 하였다. Liquid culture에서 생육저해 효과는 천연초 분리 정제물[Cheonnyuncho (Opuntia humifusa) compound(C.
- 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(μg/mL)을 RC50으로 나타냈으며, 기존 항산화제인 α-tocopherol 및 BHA와 비교하였다(9).
- 천년초를 70% 에탄올로 추출한 후 이를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 순차 분획하여 항산화 활성이 우수한 에틸아세테이트 획분을 얻었다. 에틸아세테이트 획분을 가지고 TLC를 실시하여 10개의 fraction으로 분리하였고 이중 항산화 활성이 가장 우수하게 나온 3번째 fraction을 취한 후 silica gel chromatography를 사용하여 정제하였다. 총 10개의 분획을 채취한 후 항산화 활성이 우수한 4번째 분획을 채취하여 HPLC를 사용하여 정제하였다.
- 여기에 정제물을 methanol에 녹인 후 고형분 시료 함량이 4 mg 또는 8 mg이 되게끔 흡착시킨 멸균 paper disk(8 mm, Advantec, Toyo Roshi Co., Tokyo, Japan)를 접착시키고 30°C에서 24시간 동안 배양한 후 형성된 저해 부위의 크기(mm)를 측정하였다.
- 75% TBA시약 2 mL를 가한 다음 30초 동안 진탕시킨 후 95°C 수욕 상에서 40분 동안 반응시켰다. 이 반응액을 실온까지 냉각시켜 acetic acid 1 mL, chloroform 2 mL를 가하여 진탕시킨 후, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 상징액의 흡광도를 532 nm에서 측정하여 TBA값을 산출하여 지질과산화 억제력을 측정하였다(10).
- 이를 silica gel chromatography(3 cm×35 cm, 60 mesh)를 사용하여 정제하였다.
- 천년초는 한국에서 자생하는 손바닥선인장으로 예전부터 민간에서 약재로 사용되어져 왔다. 천년초를 70% 에탄올로 추출한 후 이를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 순차 분획하여 항산화 활성이 우수한 에틸아세테이트 획분을 얻었다. 에틸아세테이트 획분을 가지고 TLC를 실시하여 10개의 fraction으로 분리하였고 이중 항산화 활성이 가장 우수하게 나온 3번째 fraction을 취한 후 silica gel chromatography를 사용하여 정제하였다.
- 이때 용매는 클로로포름-메탄올 혼합용매를 사용하였으며 메탄올의 농도를 0～100%까지 순차적으로 높여 나갔다. 총 10개의 분획을 채취한 후 DPPH법을 활용하여 항산화 활성을 검증한 결과 가장 활성이 우수한 분획을 채취하여 HPLC를 사용하여 정제하였다. HPLC는 Preparative Liquid Chromatography (M930, Young-Lin, Anyang, Korea)와 Develosil ODS-5 column(Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다.
- 에틸아세테이트 획분을 가지고 TLC를 실시하여 10개의 fraction으로 분리하였고 이중 항산화 활성이 가장 우수하게 나온 3번째 fraction을 취한 후 silica gel chromatography를 사용하여 정제하였다. 총 10개의 분획을 채취한 후 항산화 활성이 우수한 4번째 분획을 채취하여 HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제물은 EI-MS를 사용하여 분자량을 측정하였고 1H-NMR과 13C-NMR spectrum을 측정하여 검증한 결과 taxifolin으로 확인되었다.
- 항균 활성은 paper disk diffusion(11)과 liquid culture에서 생육저해 효과(12)를 측정하였다. Paper disk diffusion은 8 log cfu/mL로 전배양한 각 시험균주의 배양액 0.
대상 데이터
- , Palo Alto, CA, USA)로 측정하였으며, DMSO-d6용매를 사용하였고 ppm 단위로 나타내었다. 13C-NMR spectrum은 Varian Unity Inova 75 MHz (Varian Inc.)로 측정하였으며, DMSO-d6용매를 사용하였고 ppm 단위로 나타내었다.
- 정제물은 Electron Impact Mass Spectrometer (EI-MS, MS Engine 5989A, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분자량을 측정하였다. 1H-Nuclear magnetic resonance(NMR) spectrum은 Varian Unity Inova 300 MHz(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)로 측정하였으며, DMSO-d6용매를 사용하였고 ppm 단위로 나타내었다. 13C-NMR spectrum은 Varian Unity Inova 75 MHz (Varian Inc.
- 총 10개의 분획을 채취한 후 DPPH법을 활용하여 항산화 활성을 검증한 결과 가장 활성이 우수한 분획을 채취하여 HPLC를 사용하여 정제하였다. HPLC는 Preparative Liquid Chromatography (M930, Young-Lin, Anyang, Korea)와 Develosil ODS-5 column(Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. 이동상으로 0.
- C)]의 몰농도를 달리한 liquid culture에 균주를 접종시킨 후 24시간 후 균의 생육정도를 UV/visible Spectrophotometer(Lambda 15, PerkinElmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 생육 저해 효과를 알아보았다. 대조군으로 C.C와 몰농도를 동일하게 조정한 benzoic acid를 사용하였다.
- HPLC로 측정 결과 가장 큰 면적을 보여준 18 min 구간의 물질을 정제하였다. 정제물은 Electron Impact Mass Spectrometer (EI-MS, MS Engine 5989A, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분자량을 측정하였다. 1H-Nuclear magnetic resonance(NMR) spectrum은 Varian Unity Inova 300 MHz(Varian Inc.
- 천년초선인장은 충남 아산시 소재 (주)여러분의 천년초에서 재배해 동결 건조한 것을 공급받아 분쇄해 사용하였다. 추출 및 분획용 용매로 ethanol, hexane, chloroform, ethylacetate, butanol 등은 1급으로, high performance liquid chromatography(HPLC)용 acetonitrile과 formic acid는 특급으로 Duksan Pure Chemical Co.
- (Milwaukee, WI, USA)의 것을 사용하였다. 항균실험에 사용한 균주 및 배지는 Table 1과 같으며 배지는 Difco(Detroit, MI, USA)의 것을 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구의 결과는 3회 반복하여 평균으로 나타내었고, 각 실험군 간의 비교분석은 SAS system을 이용하여 ANOVA 분석 후 α=0.05에서 Duncan's multiple range test를 사용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 항산화 활성은 DPPH법에 의하여 전자공여능과 TBA법에 의하여 지질과산화 억제력을 측정하였다. DPPH법에 의한 전자공여능은 여러 농도의 시료를 4 mL의 methanol에 녹여 1.
성능/효과
- C를 paper disk에 흡수시켰을 경우 yeast에서도 비슷한 크기의 clear zone을 관찰할 수 있었다. Benzoic acid의 경우 8 mg을 흡수시켰을 경우에도 항진균 효과를 보여주지 못하고 있음에 비교하여 볼 때 본 정제물의 우수한 항진균 효과도 알 수 있었다. C.
- 천년초에서 정제된 물질은 2배량의 benzoic acid보다도 우수한 항균 활성을 보여주었다. Gram positive, gram negative 균주에 대해 모두 우수한 항균 효과를 보여주었다. 또한 Table 4에 기재하진 않았으나 2배량인 8 mg의 C.
- 그람 양성세균 및 음성세균 모든 균주의 liquid culture에 대하여 C.C의 몰농도가 15 × 10-4 M일 경우 생장이 절반가량 억제되었으며 20×10-4 M일 경우 생장이 대부분 억제되었다.
- 본 항산화 실험결과 천년초 정제물의 항산화 활성은 α-tocopherol과 비슷한 정도의 활성을 나타내었고 BHA에 비하여 전자공여능은 우수하나 지질과산화 억제력은 다소 못 미치는 결과를 보여주었다.
- 이를 가지고 항산화 활성을 검증한 결과 α-tocopherol, BHA와 비교하여 뒤지지 않는 효과를 보여주었고 항균 활성을 검증한 결과 그람 양성, 음성의 식중독균에 모두 benzoic acid보다 우수한 활성을 보여주었다.
- 2)하여 얻었다. 이를 헥산, 클 로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 순차 분획하여 DPPH법을 활용하여 전자공여능을 측정한 결과 가장 우수한 획분을 선택하였다. 이 획분을 TLC를 실시하여 10개의 fraction으로 분리하였고 이중 항산화 활성이 가장 우수하게 나온 fraction을 취하였다.
- 전자공여능 측정결과와 달리 BHA가 가장 우수한 활성을 보여주고 α-tocopherol이 가장 낮은 활성을 보여주었다.
- 총 10개의 분획을 채취한 후 항산화 활성이 우수한 4번째 분획을 채취하여 HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제물은 EI-MS를 사용하여 분자량을 측정하였고 1H-NMR과 13C-NMR spectrum을 측정하여 검증한 결과 taxifolin으로 확인되었다. 이를 가지고 항산화 활성을 검증한 결과 α-tocopherol, BHA와 비교하여 뒤지지 않는 효과를 보여주었고 항균 활성을 검증한 결과 그람 양성, 음성의 식중독균에 모두 benzoic acid보다 우수한 활성을 보여주었다.
- 천년초에서 분리된 물질이 1.19 μg/mL로 가장 적은 양으로 50%의 free radical 소거능을 보여주었고 α-tocopherol, BHA 순으로 좋은 활성을 보여주었다.
- Paper disk diffusion에 의하여 clear zone의 직경을 측정한 항균 활성 결과는 Table 4와 같다. 천년초에서 정제된 물질은 2배량의 benzoic acid보다도 우수한 항균 활성을 보여주었다. Gram positive, gram negative 균주에 대해 모두 우수한 항균 효과를 보여주었다.
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