선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그 중 betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 사ioline에서 합성되는데, 그 첫 단계는 choline dehydrogenase(CDH)] 의해서 촉매되고 (BetA gene), BetB 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogena- se(BAZ)H)에 의해 수행되 었다(McCue and Hanson, 1992). 따라서 본 연구에서는 염류 농도가 높은 우리나라 인삼 재배지에서 품질이 양호한 고려인삼을 안정적으로 생산하고자 염류내성 관련 유전자를 활용하여 인삼신품종을 육성코자 수행하였던 바, 이에 그 결과를 보고한다.
- 본 연구는 경희대학교 2004년 자유공모과제의 연구지원금에 의해서 수행되었으며 이에 대해 심심한 감사를 표하는 바이 다.
제안 방법
- tumefaciens MP90/pBetA. A. tumefaciens MP9Q/pBetB 균주를 25/^g/m I kanamycin고} 25^g/m I gentamycin이 첨가된 AB 배지에서 2일간 배양한 후 형질전환을 위하여 발아 직전의 인삼자엽과 공동배양하였다. 식물 호르몬 무첨가 MS배지에서 2일간 공동 배 양된 인삼의 자엽절편은 MS 기본배지에 250㎍/ml cefotaxime과 100µg/m l kanamycin을 첨가한 선 발배 지로 인삼자엽을 옮겼다.
- BetA 및 BetB 유전자가 도입 되 었더라도 전사가 되지 않으면 형질전환체로서의 기능을 할 수 없으므로 RT-PCR을 이용하여 도입된 유전자의 전사 여부를 확인하였다. cDNA 합성 및 PCR 반응 동안에 처음부터 NPT II, BetA 및 BetB primer를 반응액에 첨가하여 바로 사용하였다.
- 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 우선 담배에 형질전환을 시켰다. BetA 및 BetB 유전자에 의하여 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin베지에서 생장이 가능하였으며 PCR에 의하여 NPT II, BetA, BetB gene를 조사하였다. 이때 PCR를 위해서 NPTII (5‘ -GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TG-ACT-G-3Z, 5’ - ATC-GGG-AGC-GGC-GAT-ACC- GTA3, 700BP), BetA(5' -GAG-TTT-GAT-ATT-CCG-CTG-GTG-C-3Z, 5’ GGG-TGA- TGC-GAA-TTG-CGT-CG-3Z, 457BP) 및 BetB(5f -GGC-AAT-ATC-TGA-CCG-AGC- ATC - C-3‘, 5' -GTT-AGT-TTG- CGG-ATC-GAA-AAC-G- 3’ 335 BP) primer를사용하였 다.
- 이 때 cDNA 합성반응 액은 reverse transcriptase, RNasine, DTT를 사용하였으며, 42°C 에서 45분 반응시켜 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 Taq polymerase를 이용하여 최초 96P 에 서 2분간 pre-denaturation 후, 96P에서 30초, 6012에서 30초, 72P 에 서 2분간 40회 반응시킨 후에 최종적으로 72 °C 에서 15분간 post-extension시 켜 PCR를 종료하였 다.
- pRD400 binary vector-f- 이용와 BetB 유전자를 Agrobavterium에 도입하여 새로운 접합체 2종을 획득하였으며 (A. tumefaciens MP90/pBetA,A. tumefaciens MP90/pBetB), 재조합된 binary vector가 도입된 식물체에서 제대로 발현되는지 여부를 조사하기 위해서 담배에 형질전환을 시켰다. BetA 및 BetB 유전자를 도입한 형질전환 담배는 고농도의 kanamycin 배지에서 생장이 가능하였으며, PCR에 의하여 NPTII, BetA, BetB 유전자를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 gel 상에서 특정 band를 나타내어 형질전환체임을 확인할 수 있었다(Fig.
- 특히 선발 배지에는 식물 호르몬을 첨가하지 않고 대신 mannitol의 농도를 1 M 처리하여 배양하였다. 배양 7일 후에는 다시mannitolo] 함유되지 않은 선 발배지 로 계대 배양한 후 체세포배의 발생 여부와 생육 상태를 조사하였다. 항생제 배지에서 유도된 인삼체세포배는 BetA 및 BetB 유전자의 PCR을 통해 형질전환 여부를 확 인하였다.
- 식물세포에서 발현용 promoter는 발현 정도가 높은 35S/35S/AMV promoter와 단일 35S promoter를 사용하고 teTminator는 Tnos를 사용하였다. 식물세포 형질전환용 binary vector는 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하였고, 인삼 형질 전환에 사용할 Agrobacterium은 disarmed Ti-vectoi를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP 90을 사용하였다. 사용한 유전자는 BetA 및 BetB 유전자(Me Cue and Hanson, 1992)로 binary vector0!] 재조합하여 Agrobacterium6^ 도입한 후 새로운 conjugants 2종을 획득하였다.
- 형질전환 담배에서 RNA isolation kit를 이용하여 total RNA를 추출한 후 cDNA 합성하여 PCR을 수행 하 였다 .이 때 cDNA 합성반응 액은 reverse transcriptase, RNasine, DTT를 사용하였으며, 42°C 에서 45분 반응시켜 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 Taq polymerase를 이용하여 최초 96P 에 서 2분간 pre-denaturation 후, 96P에서 30초, 6012에서 30초, 72P 에 서 2분간 40회 반응시킨 후에 최종적으로 72 °C 에서 15분간 post-extension시 켜 PCR를 종료하였 다.
- BetA 및 BetB 유전자에 의하여 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin베지에서 생장이 가능하였으며 PCR에 의하여 NPT II, BetA, BetB gene를 조사하였다. 이때 PCR를 위해서 NPTII (5‘ -GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TG-ACT-G-3Z, 5’ - ATC-GGG-AGC-GGC-GAT-ACC- GTA3, 700BP), BetA(5' -GAG-TTT-GAT-ATT-CCG-CTG-GTG-C-3Z, 5’ GGG-TGA- TGC-GAA-TTG-CGT-CG-3Z, 457BP) 및 BetB(5f -GGC-AAT-ATC-TGA-CCG-AGC- ATC - C-3‘, 5' -GTT-AGT-TTG- CGG-ATC-GAA-AAC-G- 3’ 335 BP) primer를사용하였 다.
- 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 우선 담배에 형질전환을 시켰다. BetA 및 BetB 유전자에 의하여 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin베지에서 생장이 가능하였으며 PCR에 의하여 NPT II, BetA, BetB gene를 조사하였다.
- 4). 즉 발 아 직전에 있는 인삼자엽을 멸균된 필터 페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 다음 생장호르몬이 첨가되지 않고 1 M의 mannitol이 첨가된 MS 기본배지 에서 3일간 전배 양하였다. 전배 양 후 MS 기본배 지 에 250/^g/m I cefotaxime과 100 #g/m Z kanamycin을 첨가한 선발 배지에 인삼자엽을 옮겼다.
- 형질전환 담배에서 RNA isolation kit를 이용하여 total RNA를 추출한 후 cDNA 합성하여 PCR을 수행 하 였다 .이 때 cDNA 합성반응 액은 reverse transcriptase, RNasine, DTT를 사용하였으며, 42°C 에서 45분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
대상 데이터
- (1996), York et al, (1996)), Hiraga et al, (1996)에 의하여 methicillin resistant gene, dihydrolipoamide dehydrogenase, angiotansin I- converting enzyme gene 등이 개발되었으며, 이미 gen아)ank에 수백 편의 관련 논문들이 보고되고 있다. 본 실험에서 사용된 betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성된다. 그 첫 단계는 choline dehydrogenase(CDH)o|] 의해서 촉매되고 (BetA gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다(McCue and Hanson, 1992).
- Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline 에서 합성되는데, 첫 단계는 choline dehydrogenase (CDH)에 의해서 촉매되 고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH) 에 의해 수행된다. 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아그로 박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2종을 획득하였으며 (AgrobacWvWm tumefaciens MP90 /pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector?} 식물에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시켰으며, 형질전환된 담배에서는 '고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환 체임을 확인할 수 있었다. 인삼에 Bet A, Bet B gene의 도입은 1M의 mannitolo] 함유된 식물 호르몬 무첨가 MS 배지에서 단일 배 발생 방법에 형질전환체를 획득하였으나, 형질전환체의 발생빈도(12%)가 매우 낮았 다.
- 식물세포에서 발현용 promoter는 발현 정도가 높은 35S/35S/AMV promoter와 단일 35S promoter를 사용하고 teTminator는 Tnos를 사용하였다. 식물세포 형질전환용 binary vector는 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하였고, 인삼 형질 전환에 사용할 Agrobacterium은 disarmed Ti-vectoi를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP 90을 사용하였다.
성능/효과
- tumefaciens MP90/pBetB), 재조합된 binary vector가 도입된 식물체에서 제대로 발현되는지 여부를 조사하기 위해서 담배에 형질전환을 시켰다. BetA 및 BetB 유전자를 도입한 형질전환 담배는 고농도의 kanamycin 배지에서 생장이 가능하였으며, PCR에 의하여 NPTII, BetA, BetB 유전자를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 gel 상에서 특정 band를 나타내어 형질전환체임을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 그러나 형 질 전환 담배 의 유식물체는 공동배 양 시 사용한 Agrobacterium 이 감염되어 특정 밴드가 나타날 수 있 기 때 문에 Agrobacterium 감염 시 나타나는 VirG (primer, 5’ -TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC AGG-3' , 5' -CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC- 3' , 965 bp) 유전자의 유무를 확인한 바, 형질전환체 에서는 VirG 밴드가 나타나지 않고 Agrobacterium 에 서만 형성됨을 확인할수 있어 BetA, 및 BetB 유전자 가 담배에 형 질전환 되 었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 5). BetA 및 BetB 유전자에 의하여 형질전환된 인삼체 세포배로부터 shoot를 형성하기 위해서 GAj 50mg/ I 를 첨가한 1/2 MS 배지에 접종한 결과 shoot가 형성되는 것을 확인할 수 있었으나 (Fig. 6), 기형의 shoot가 많이 관찰되었다. 따라서, 이후 정상적인 Shoot 유도의 효율을 높이는 방법을 개발해야 할 것 이다.
- cDNA 합성 및 PCR 반응 동안에 처음부터 NPT II, BetA 및 BetB primer를 반응액에 첨가하여 바로 사용하였다. RT-PCR이 완료된 후에는 1.2% agarose gel 상에서 전기영동한 후에 EtBr 에 의해 염색하여 uv하에서 밴드의 형성 여부를 확인한 결과 형질전환체에서는 모두 밴드가 형성되었으나 대조구에서는 전혀 밴드가 형성되지 않아 형질전환체는 정상적으로 RNA를 합성하고 있음을 확인하였다 (Fig. 3).담배 에서 형 질전환이 확인된 유식물체를 토양에 이식하여 생장을 조사한 결과 BetB가 도입된 형질전환체는 생장이 잘 안되 었으나 (Fig.
- Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline 에서 합성되는데, 첫 단계는 choline dehydrogenase (CDH)에 의해서 촉매되 고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH) 에 의해 수행된다. 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아그로 박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2종을 획득하였으며 (AgrobacWvWm tumefaciens MP90 /pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector?} 식물에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시켰으며, 형질전환된 담배에서는 '고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환 체임을 확인할 수 있었다. 인삼에 Bet A, Bet B gene의 도입은 1M의 mannitolo] 함유된 식물 호르몬 무첨가 MS 배지에서 단일 배 발생 방법에 형질전환체를 획득하였으나, 형질전환체의 발생빈도(12%)가 매우 낮았 다.
- 1). 그러나 형 질 전환 담배 의 유식물체는 공동배 양 시 사용한 Agrobacterium 이 감염되어 특정 밴드가 나타날 수 있 기 때 문에 Agrobacterium 감염 시 나타나는 VirG (primer, 5’ -TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC AGG-3' , 5' -CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC- 3' , 965 bp) 유전자의 유무를 확인한 바, 형질전환체 에서는 VirG 밴드가 나타나지 않고 Agrobacterium 에 서만 형성됨을 확인할수 있어 BetA, 및 BetB 유전자 가 담배에 형 질전환 되 었음을 확인할 수 있었다(Fig.2).
- 3).담배 에서 형 질전환이 확인된 유식물체를 토양에 이식하여 생장을 조사한 결과 BetB가 도입된 형질전환체는 생장이 잘 안되 었으나 (Fig. 4-A, left), B&4가 도입된 형질전환체는 정상적으로 생장하는 모습(Fig. 4-A, right)을 보였으며, 특히 BetA 형질전 환체의 경우에는 정상적으로 개화 결실이 되었다 (Fig. 4-B, C). BetB 도입 형질전환체의 경우 생장에 이상을 가져오는지에 대해서는 추후 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 일단 담배에서 형질전환이 확인되어 다시 인삼에 형질전환을 유도하고자 단일 배 발생 방법에 의해서 형질전환체를 획득하였으나 형질전환체의 빈도가 매우 낮아 원형질 분리 방법을 통한 배 발생 방법에 의하여 계속적으로 형질전환율을 증대하였다 (Fig. 4). 즉 발 아 직전에 있는 인삼자엽을 멸균된 필터 페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 다음 생장호르몬이 첨가되지 않고 1 M의 mannitol이 첨가된 MS 기본배지 에서 3일간 전배 양하였다.
- 4).항생 제 배지 에 서 유도된 체세포배의 형질전환 여부를 확인하기 위해서 다시 PCR을 수행한 바, 인삼 형질전환체에서는 BetA 및 BetB 유전자가 확인되었으나 대조구에서는 전혀 밴드가 형성되지 않아 인삼에서도 동일 유전자에 의한 형질전환이 되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). BetA 및 BetB 유전자에 의하여 형질전환된 인삼체 세포배로부터 shoot를 형성하기 위해서 GAj 50mg/ I 를 첨가한 1/2 MS 배지에 접종한 결과 shoot가 형성되는 것을 확인할 수 있었으나 (Fig.
후속연구
- 4-B, C). BetB 도입 형질전환체의 경우 생장에 이상을 가져오는지에 대해서는 추후 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 최근까지 염류 내성의 식물체를 선발하기 위해 서 식물의 조직세포를 배양하여 고농도의 염류첨가배지에서 선발하였으나, 대부분의 선발 세포주는 생리적 현상에 의한 영향으로 판명 되어졌다. 그러나 본 실험과 같이 외부 유전자를 직접 도입하여 형질전환체를 유도하여 획득된 조직은 생리적인 현상이 아닌 유전적인 변환이므로 계속적인 유전이 가능하지만 추후 염류내성 신품종의 육성을 위해서는 선발계통의 안정성 검토, 염류 내성기작의 신호전달체계, 재분화형질전환식물체의 후대검정 및 대량증식 등에 관한 연구가 계속적으로 수행되어야 할 것으로 판단 된다.
- 6), 기형의 shoot가 많이 관찰되었다. 따라서, 이후 정상적인 Shoot 유도의 효율을 높이는 방법을 개발해야 할 것 이다.
- 인삼은 종자를 통하여 번식할 수 있으나 채종하는데 3-4년이 소요됨과 동시에 1회 채종량이 대단히 적은 작물로서 타 식물에 비하여 우수 품종 육성에 장구한 세월이 필요하며, 또한 우수 품종을 육성하였다고 하더라도 동일한 유전자형을 지닌 개체 수증식 에 도 상당한 시일이 요구되므로 이러한 불편하고 어려운 점을 해결하기 위하여 인삼의 조직배양 기술이 개발 확립되어 단시일내 에 homologous gene을 지닌 개체수를 대량으로 증식할 수 있는 기반이 구축되어야 할 것이다. 최근 식물 유전공학기법의 발달로 유전자조작에 의한 많은 유전자들이 cloning되었으며, 시oning된 유전자를 다시 강력한 promotor로 재조합 후 식물세포에 형질전환시킴으로서 새로운 식물체를 개발하고 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.