계혈등 추출물의 항산화와 사람 피부 섬유아세포에서의 Matrix Metalloproteinase-1 발현저해 효과 Effects of the Spatholobi calulis extract on Antioxidation and Inhibition of Matrix Metalloproteinase in Human Skin Fibroblasts원문보기
본 연구에서는 계혈등 추출물에 의한 항산화 효과, in vitro MMP-1효소 활성 저해 효과 및 사람섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 관찰하였다. 계혈등 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, $IC_{50}$은 각각 $45.81{\mu}g/ml$, $3.11{\mu}g/ml$로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. MMP-1 효소 활성 저해 효과도 $80{\mu}g/ml$에서 $97.33\%$를 저해하는 것으로 나타나 우수한 효과를 나타내었다. 사람섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 계혈등 추출물 $10{\mu}g/ml$에서 $74.66\%$로 단백질 수준에서 우수한 발현저해효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 계혈등 추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 계혈등 추출물은 항산화 효과, MMP-1 효소 활성저해 효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 계혈등 추출물에 의한 항산화 효과, in vitro MMP-1 효소 활성 저해 효과 및 사람섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 관찰하였다. 계혈등 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, $IC_{50}$은 각각 $45.81{\mu}g/ml$, $3.11{\mu}g/ml$로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. MMP-1 효소 활성 저해 효과도 $80{\mu}g/ml$에서 $97.33\%$를 저해하는 것으로 나타나 우수한 효과를 나타내었다. 사람섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 계혈등 추출물 $10{\mu}g/ml$에서 $74.66\%$로 단백질 수준에서 우수한 발현저해효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 계혈등 추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 계혈등 추출물은 항산화 효과, MMP-1 효소 활성저해 효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
The production of matrix metalloproteinases (MMPs) by the UV irradiated skin fibroblast and the degradation of exracellular matrix (ECM) by these enzymes is known as one of the main reasons of photoaging. In this study, to investigate the relationship between aging and Spatholobi caulis extract, we ...
The production of matrix metalloproteinases (MMPs) by the UV irradiated skin fibroblast and the degradation of exracellular matrix (ECM) by these enzymes is known as one of the main reasons of photoaging. In this study, to investigate the relationship between aging and Spatholobi caulis extract, we examined the effects of antioxidant, in vitro MMP inhibition and expression of UVA-induced MMP-1 in human dermal fibroblasts. Spathoiobi caulis extract was found to show scavenging activities of radicals and reactive oxygen species (ROS) with the $IC_{50}$ values of $45.81{\mu}g/ml$ against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and $3.11{\mu}g/ml$ against superoxide radicals in the xanthine/xanthine oxidase system, respectively. Spatholobi caulis extract inhibited the activities of MMP-1 in a does-dependent manner and the IC50 value calculated from semi-log plots was $31.96{\mu}g/ml$. Also, UVA induced MMP expression was reduced $74.66\%$ by treatment with Spatholobi caulis extract, and MMP-1 mRNA expression was reduced in a dose-dependent manner. Therefore Spatholobi caulis extract was able to significantly inhibit MMP expression in protein and mRNA level. All these results suggested that Spatholobi caulis extract may act as an anti-aging agent by antioxidation and reducing UVA-induced MMP-1 production.
The production of matrix metalloproteinases (MMPs) by the UV irradiated skin fibroblast and the degradation of exracellular matrix (ECM) by these enzymes is known as one of the main reasons of photoaging. In this study, to investigate the relationship between aging and Spatholobi caulis extract, we examined the effects of antioxidant, in vitro MMP inhibition and expression of UVA-induced MMP-1 in human dermal fibroblasts. Spathoiobi caulis extract was found to show scavenging activities of radicals and reactive oxygen species (ROS) with the $IC_{50}$ values of $45.81{\mu}g/ml$ against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and $3.11{\mu}g/ml$ against superoxide radicals in the xanthine/xanthine oxidase system, respectively. Spatholobi caulis extract inhibited the activities of MMP-1 in a does-dependent manner and the IC50 value calculated from semi-log plots was $31.96{\mu}g/ml$. Also, UVA induced MMP expression was reduced $74.66\%$ by treatment with Spatholobi caulis extract, and MMP-1 mRNA expression was reduced in a dose-dependent manner. Therefore Spatholobi caulis extract was able to significantly inhibit MMP expression in protein and mRNA level. All these results suggested that Spatholobi caulis extract may act as an anti-aging agent by antioxidation and reducing UVA-induced MMP-1 production.
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문제 정의
본 연구는 계 혈 등 추출물의 항산화 효과, MMP-1 효소 활성 저해 효과 및 UVA를 조사한 배양된 사람섬유아세포에서 MMP-1 발현 저해 효과를 검색하여 항노화 소재로 이용하고자 하였다.
본 연구에서는 계혈등 추출물에 의한 항산화 효과, in vitro MMP-1 효소 활성 저해 효과 및 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 관찰하였다. 계혈 등 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, IC50은 각각 45.
최근 천연물로부터 항산화 활성을 측정한 연구 결과는 많이 보고되고 있으나 MMP-1 활성 억 제 에 대한 연구 결과는 미비 하다(10-13). 이에 천연물로부터 항산화 활성 및 MMP-1 억제 활성을 보여주는 물질을 검색하였다. 본 연구에 사용된 계혈등 (Spatholobi caids)은 密花豆 (Spatholobus suberectus Dunn)의 줄기를 건조한 생약재로서 보혈, 활혈, 통락의 작용이 있어 월경 불순, 사지 마비 등의 치료에 이용되며, 혈액순환을 돕고 혈류 순환을 촉진시켜 동맥경화로 인한 고혈압 또는 심장병, 협심증에 효과를 나타내는 생 약으로 알려져 있다(14).
제안 방법
사람 섬유아세포를 2 X 105 cells/농도로 96-well plate의 well에 계혈등 추출물을 세포에 처리하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액 (5 飓/畝)을 첨가하고 4시간 후 원심 분리하여 상등액을 제거하고 100 迎 acid-isopropanol (0.04 N HC1 in isopropanol)를 첨가한 후 570 nm에서 microplate reader (Model ELX 800, BIO-TEK instruments, USA)로 흡광도를 측정하였다.
MTT[3-(4, 5-dimethythiazo2-gl)-2-5-diphenytetrazolium bromide] 정량은 Mosmann(17)의 방법을 변형하여 실시하였다. 사람 섬유아세포를 2 X 105 cells/농도로 96-well plate의 well에 계혈등 추출물을 세포에 처리하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
5분, 72℃ 1분, 28 cycles로 반응 시 켰다. PCR에 의하여 생성된 산물을 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 MMP-1과 f-actin 유전자의 발현을 확인하였다. MMP-1의 oligonucleotide 서열은 sense oligonucleotide?} 5'-AAAGGGA ATAAGTACTGGGC-3', antisense oligonucleotide가 5'-AATTC CAGGAAAGTCATGTG-3' 이며, 6-actin의 oligonucleotide서 열은 sense oligonucleotide가 5'-ATGCAGAAGGAGATCACTGC- 3', antisense oligonucleotide?]- 5'-CTGCGCAAGTTAGGTTTT GT-3'이다.
5 uM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany)로 37 ℃ 에서 60분, 93 ℃ 에서 5분 heating 시킴으로서 반응을 중지 시 켰다. Polymerase Chain Reaction (PCR) 은 cDNA로부터 MMP-1, B-actin을 증폭하기 위하여 1 以 cDNA, 0.5 uM 의 5'과 3'primer, 10 X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 uM dNTP, 25 mM MgCl2, 2.5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)를 섞고 distilled water로 전체를 25 成로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃ 0.
3 J/cm2 UVA (UVA F15T8BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA 조사 후 배양 배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 계혈등 추출물을 처리하여 24시간 배 양하였다.
5 X IO, cells/iN의 농도로 35 nun dish에 배 양, 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 배 양한다. UV조 사전에 원 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum 성 분을 제거 후 6.3 J/cm2 UVA (UVA F15T8BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA 조사 후 배양 배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 계혈등 추출물을 처리하여 24시간 배 양하였다.
계혈등 추출물의 세포독성측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. 사람섬유아 세포에 대한 계혈등 추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 계혈 등 추출물은 50 儡/畝 이하의 농도로 처리 시 세포 생존율은 80% 이하로 저하되었으며 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Fig.
유해산소라 불려지는 활성산소는 세 포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과 산 화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며 다양한 종류의 식물 성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되어 있다(18-20). 계혈등 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 효과가 알려진 BHT (2, [6]-Di-tert-Butyl-p-cresol)(21) 를 이용하여 계혈등 추출물의 항산화 효과를 비교하였다.
이러한 콜라겐을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 콜라겐 type I을 분해하는 MMP-1 으로 이러한 MMP-1의 효소 활성을 저해하거 나 발현을 억제하는 활성을 가진 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지한다(19). 따라서 MMP 저해 효과가 있는 소재는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부 유지에 유용하게 사용될 수 있으므로 계혈등 추출물에 대한MMP-1의 효소 활성 저해 효과를 측정하였다. 양성 대조군인 1, 10-phenanthroline 의 경우 100(ig/ M에서 94.
5 unit collagenase 40 成을 첨가하였다. 암소, 실온 에서 20분 경과 후 형광 분광광도계 (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출 파장 515 nm로 형 광값을 측정 하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정 하였으며 시료 자체의 형광값도 측정 하여 효소활성 계산 시 보정하였다.
Xanthine oxidase에 의해 형성되는 superoxide anion의 생성저해의 결과는 Table 2에 나타내었다. 양성 대조군으로 BHT를 이용하여 계혈등 추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 계혈등 추출물은 투여 농도의 존 적으로로 superoxide radical 소거 작용을 나 타내 1, 10, 100 俸佩의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거 능은 39.
계혈등 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 양성 대조군으로는 항산화 효과가 알려진 BHT (2, [6]-Di-tert-Butyl-p-cresol)(21) 를 이용하여 계혈등 추출물의 항산화 효과를 비교하였다. 그 결과 계혈등 추출물을 10, 102, 103 园畝의 농도로 처리한 경우 각 DPPH radical 소거 능은 25.
피부의 광노화에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 activator protein-1 (AP-1)의 활성도가 증가되는 신호전달경로를 통해 MMP-1 발현을 증가 시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다(23). 이러한 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 계혈등 추출물이 미치는 영향을 알아보고자 사람 섬유아세포에 6.3 J/cm2 UVA를 조사하고 계혈 등 추출물을 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현저해 효과를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)을 통해 알아보았다. 그 결과 계혈등 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 발 현저해 효과를 나타내었다.
대상 데이터
구 입 한 Human demal fibroblast를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지 에 10% fetal bovine serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6-10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody, anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate는 Sigma (USA) 로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
신생아의 포피조직에서 분리한 human dermal fibroblast는 Modem Tissue Technology (MTT, Korea)로부터 구입하였다. 구 입 한 Human demal fibroblast를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지 에 10% fetal bovine serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6-10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody, anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate는 Sigma (USA) 로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
11 儡/业의 소거 능을 보여 우수한 superoxide radical 소거 효과를 나타내었다. 대조군인 BHT는 82.78 鹿/业에서 50%의 superoxide radical을 소거 하 였 다,
본 실험에서 사용한 계혈등은 Spatholobi 로서 중국 북 경대학에서 제공받아 사용하였다. 계혈등 100 g을 분쇄하여 70% EtOH 1000 戒로 환류하면서 3시간씩 2회 반복 추출하고 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 사용하였다.
신생아의 포피조직에서 분리한 human dermal fibroblast는 Modem Tissue Technology (MTT, Korea)로부터 구입하였다. 구 입 한 Human demal fibroblast를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지 에 10% fetal bovine serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6-10세대 세포를 실험에 이용하였다.
MMP-1 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석 법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-collagen, 효소 (collagenase)는 molecular probe사 (Eugene, OR, USA)에서 시판 중인 제품을 사용하였으며, 반응 완충액 (0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl2) 2 mM sodium azide, pH 7.6) 100 /比에 0.25 mg/m£ DQ collagen 20 成와 시료 40 成을 첨가하고 0.5 unit collagenase 40 成을 첨가하였다. 암소, 실온 에서 20분 경과 후 형광 분광광도계 (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출 파장 515 nm로 형 광값을 측정 하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정 하였으며 시료 자체의 형광값도 측정 하여 효소활성 계산 시 보정하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균 土 표준편차로 표기하였고 통계적 유 의성은 Student's t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
MMP-1 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석 법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-collagen, 효소 (collagenase)는 molecular probe사 (Eugene, OR, USA)에서 시판 중인 제품을 사용하였으며, 반응 완충액 (0.
Xanthin히xanthine oxidase 반응에서 형 성 된 superoxide radical 소거효과는 nitroblue tetrazolium (NBT) 방법에 의해 측정 하였다(16). 50 mM NazCOa buffer (pH 10.
항산화 활성은 DPPH (Aldrich, USA)를 이용하여 시료의 라 디칼 소거효과 (radical scavenging effect)를 측정하는 Blois 법 (15) 을 활용하였다. 0.
성능/효과
11 您価로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. MMP-1 효소 활성 저 해 효과도 80 您/圳에서 97.33%를 저해하는 것으로 나타나 우수한 효과를 나타내었다. 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 계혈등 추출물 10 愿/!成에서 74.
Tot이 RNA that was extracted from human dermal fibroblasts was analyzed by RT-PCR and each lane in (A) corresponds to each bar in (B). The results were expressed as the average of triple determination with S.D. * p<0.05, significantly different from control (UVA: 6.3 J/cm2, EGCG: 5 eg/mC).
33%를 저해하는 것으로 나타나 우수한 효과를 나타내었다. 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1의 발현저해효과는 계혈등 추출물 10 愿/!成에서 74.66%로 단백질 수준에서 우수한 발현저해 효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 계혈등 추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해 효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 계혈등 추출물은 항산화 효과, MMP-1 효소 활성 저해 효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
3A). 결론적으로 계혈등 추출물은 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 을 단백질 및 mRNA(32, 33) 수준에서 발현을 저해하는 효과가 확인되었으며 이는 기존 보고된 EGCG와 유사한 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 사람섬유아세포에서 계혈등 추출물은 UVA로부터 생성된 ROS를 소거하거나 신호 전달 (signal transduction) 과정에 관여하여 MMP 발현을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서는 계혈등 추출물에 의한 항산화 효과, in vitro MMP-1 효소 활성 저해 효과 및 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 관찰하였다. 계혈 등 추출물의 DPPH와 superoxide radical 소거효과는 처리 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거효과를 나타냈으며, IC50은 각각 45.81 “g/mC, 3.11 您価로 DPPH와 superoxide radical을 소거하여 우수한 항산화 효과를 나타내었다. MMP-1 효소 활성 저 해 효과도 80 您/圳에서 97.
3 J/cm2 UVA를 조사하고 계혈 등 추출물을 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현저해 효과를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)을 통해 알아보았다. 그 결과 계혈등 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 발 현저해 효과를 나타내었다. 계 혈 등 추출물을 0.
양성 대조군으로 BHT를 이용하여 계혈등 추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 계혈등 추출물은 투여 농도의 존 적으로로 superoxide radical 소거 작용을 나 타내 1, 10, 100 俸佩의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거 능은 39.67%, 83.67%, 93%로 나타났으며, IC50 은 3.11 儡/业의 소거 능을 보여 우수한 superoxide radical 소거 효과를 나타내었다. 대조군인 BHT는 82.
양성 대조군으로는 항산화 효과가 알려진 BHT (2, [6]-Di-tert-Butyl-p-cresol)(21) 를 이용하여 계혈등 추출물의 항산화 효과를 비교하였다. 그 결과 계혈등 추출물을 10, 102, 103 园畝의 농도로 처리한 경우 각 DPPH radical 소거 능은 25.33%, 87.33%, 92.67%로 나타났으며, ICsoe 45.81 俸価로 대 조 군인 BHT보다 우수한 free radical 소거효과를 나타내었다 (Table 1). 전자공여 능은 radical에 수소를 공여 함으로써지 질과 산화를 억제 할 뿐만 아니라 체 내에 서 radical에 의한 노화의 억제 에 이용된다.
전자공여 능은 radical에 수소를 공여 함으로써지 질과 산화를 억제 할 뿐만 아니라 체 내에 서 radical에 의한 노화의 억제 에 이용된다. 따라서 계 혈 등 추출물의 DPPH radical에 대한 전자 공여 능의 작용은 수소 공여체로서 또한 지질 radical과 반 응하는 primary 항산화제로서 매우 효과적임을 보여주었다.
결론적으로 계혈등 추출물은 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 을 단백질 및 mRNA(32, 33) 수준에서 발현을 저해하는 효과가 확인되었으며 이는 기존 보고된 EGCG와 유사한 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 사람섬유아세포에서 계혈등 추출물은 UVA로부터 생성된 ROS를 소거하거나 신호 전달 (signal transduction) 과정에 관여하여 MMP 발현을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 생각된다.
Barthelman 등(30)과 Fisher 등(31)은 각각 EGCG와 all-trans-retinoic acid가 자외 선에 의한 AP-1의 활성도 증가를 방지함으로서 MMP-1 유전자 발현이 감소함을 보고하였다. 따라서, 계혈등 추출물이 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행한 결과 농도 의존적으로 MMP-1 mRNA 발현을 저해하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3A). 결론적으로 계혈등 추출물은 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 을 단백질 및 mRNA(32, 33) 수준에서 발현을 저해하는 효과가 확인되었으며 이는 기존 보고된 EGCG와 유사한 우수한 효과를 나타내었다.
계혈등 추출물의 세포독성측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. 사람섬유아 세포에 대한 계혈등 추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 계혈 등 추출물은 50 儡/畝 이하의 농도로 처리 시 세포 생존율은 80% 이하로 저하되었으며 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Fig. 2). 값은 181 傩이 었다.
67%, 73%, 97.33% 저해하였으며, IG。은 31.96 ㎛/观로 나타났다(Fig. 1), 이 실험 결과 계혈등 추출물이 MMP-1 효소 활성 부위에 대한 직접적인 저 해 활성에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
후속연구
66%로 단백질 수준에서 우수한 발현저해 효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 계혈등 추출물은 모두 농도 의존적으로 발현 저해 효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 계혈등 추출물은 항산화 효과, MMP-1 효소 활성 저해 효과와 UVA에 의한 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 항노화 소재로써 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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