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문제 정의
- 본 연구는 Acetaminophen (APAP) 단회 투여로 급성 간독성을 유발한 rat에 대한 계혈등 물추출물 (SCE)의 간보호 효과를 평가하였다.
- 본 연구에서는 活血祛瘀 작용을 지닌 계혈등이 APAP로 유도된 급성 간독성에 대한 보호 효과를 평가하고자, in vivo에서 SCE를 전처치한 후에 APAP를 단회 투여하여 간독성을 유발한 후에 먼저 혈액학적, 조직학적 분석을 통해 간보호 효과를 살펴보았다.
- 본 연구에서는 계혈등 물추출물 (SCE; Spatholobi Caulis Water Extract)의 APAP로 유도된 급성 간독성에 대한 보호 효과를 알아보고자 혈액학적 평가, 조직학적 평가, GSH level, malondialdehyde (MDA) 함량, pro-caspase-3 발현을 평가해 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- , Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. Densitometric analysis를 위해 Image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)을 사용하였다.
- 원심분리 후 상층액을 취하여 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA Standard curve는 1,1,3,3-tetraethoxypropane (malondialdehyde, MDA)을 사용하여 535nm 흡광도를 측정하였다.
- MDA levels were measured in 10% homogenates of liver samples from rats subjected to SCE (50 mg/kg or 100 mg/kg) for 4 days and then treated with APAP (1.2 g/kg body weight, p.o.) for 24 hour. Values represent mean ± SD (n = 5) (#, significant as compared to normal, ## P<0.
- o)와 SCE를 고농도 (100 mg/kg)로 투여한 100 mg/kg SCE군으로 나누어 실시하였다. SCE 50 mg/kg와 100 mg/kg는 4일 동안 경구투여 하였으며 간손상을 유도하기 위해 4일째 SCE를 투여한 때로부터 2시간 후 APAP를 투여하고, 이후 24시간 후 실험동물을 희생하였다. (Scheme 1)
- in vivo상에서 APAP는 단회 투여로 실험동물에서 급성 간독성을 유발하기에, SCE를 4일 동안 경구 투여하고 마지막날 SCE 투여 2시간후 APAP를 투여한 다음 24 시간 후에 rat를 희생시키고 혈액과 간을 적출하여 SCE의 효과를 살펴보았다.
- 각 실험군은 5마리로 배정하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 군을 Normal군으로 하고, 급성 간손상을 유발시킬 목적으로 APAP (1.2g/kg, p.o.)만을 투여한 군을 APAP군으로 하였으며, APAP (1.2kg,p.o)와 SCE를 저농도 (50 mg/kg)로 투여한 50 mg/kg SCE군, APAP (1.2kg,p.o)와 SCE를 고농도 (100 mg/kg)로 투여한 100 mg/kg SCE군으로 나누어 실시하였다. SCE 50 mg/kg와 100 mg/kg는 4일 동안 경구투여 하였으며 간손상을 유도하기 위해 4일째 SCE를 투여한 때로부터 2시간 후 APAP를 투여하고, 이후 24시간 후 실험동물을 희생하였다.
- 간 실질조직의 일부를 채취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4 µm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학현미경 (Nikon, Japan) 하에서 관찰하였다. 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/mm2 of hepatic parenchyma) 및 변성 간세포의 수 (N/1000 hepatocytes)를 자동영상분석장치 (DMI-300 Image Processing; DMI, Korea)를 이용하여 각각 평가하였다.
- 간 실질조직의 일부를 채취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4 µm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학현미경 (Nikon, Japan) 하에서 관찰하였다.
- 하지만 이러한 간손상은 SCE에 의해 유의하게 감소되었으며, APAP에 의해 증가된 염증세포의 침윤 수도 SCE에 의해 감소되었다. 따라 서, SCE는 APAP에 의한 간독성을 해독하는 과정에서 역할을 수행한 것으로 사료되며, 이를 규명하기 위해, MDA 및 GSH 함량변화 및 pro-caspase-3의 발현량에 대한 SCE의 영향을 살펴보았다.
- 1% Tween 20을 함유한 PBS 용액)로 2시간 blocking한 후 pro-caspase-3, actin의 antibody를 PBS에 희석하여 반응 시켰다. 반응 후 0.1% Tween 20을 함유한 PBST 용액으로 세척한 다음, 2차 antibody인 rabbit anti-Goat IgG와 반응시킨 후 ECL chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. Densitometric analysis를 위해 Image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd.
- 원심분리하여 나온 상등액을 10000×g에서 10분간 한번 더 원심분리하여 상등액을 취하 였으며, 상등액 300µl와 GSH determination kit에 있는 시약인 solution R3 600µl, solution R1 50µl, solution R2 50µl를 차례로 혼합하며 vortex를 한 후 25℃의 어두운 곳에서 10분 동안 반응을 시킨 후 405nm 흡광도를 측정하였다.
- 혈청중 ALT, AST, LDH는 Analysis kits와 Automated blood chemistry analyzer (Photometer 5010, Robert Riele GmbH & Co KG, Berlin, Germany)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였 다. GSH kit는 Oxis International (Portland, OR, USA) 로부터 구입하였으며, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) kit는 Pointe Scientific Inc. (Canton, MI, USA)부터 구입하였다. 20 mM Tris Cl (pH 7.
- metaphosphoric acid (MPA), APAP, GSH, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), MDA는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. pro-caspase-3 및 actin antibody는 Santacruz Biotechnology Inc.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. pro-caspase-3 및 actin antibody는 Santacruz Biotechnology Inc. (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였 다. GSH kit는 Oxis International (Portland, OR, USA) 로부터 구입하였으며, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) kit는 Pointe Scientific Inc.
- 실험동물은 6주령 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 (180 -200g)를 효창사이언스 (대구, 한국)로부터 공급받아 1주일 동안 동물실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 60%, 12시간 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean ± S.D.로 나타내었으며, 처치군간의 유의성은 one way analysis of varience (ANOVA)로 검정한 후 Newman-Kleuls test로 검정하였다.
성능/효과
- APAP로 유도된 간세포 자멸사에 미치는 SCE의 효과를 살펴보기 위하여 pro-caspase-3의 단백질 발현을 조사한 결과, SCE는 APAP에 의해 감소된 pro-caspase-3 발현량을 점진적으로 증가시켰다 (Fig. 6A). 단백질 발현량을 densitometer로 측정하여 Normal을 100%로 하였을 때, APAP군은 43.
- LDH는 Normal에서는 60.60 ± 17.68 IU/L이었으나, APAP로 간손상을 유도한 경우는 214.20 ± 48.12 IU/L로 유의하게 증가하였으며, 이러한 증가는 SCE 50, 100 mg/kg의 투여로 각각 173.80 ± 36.38, 49.00 ± 22.45 (IU/L)로 감소하였 으며, SCE 100 mg/kg에서는 유의성이 인정되었다 (Fig. 1C).
- SCE가 APAP로 유도된 급성 간손상에 대한 간세포 보호 효과를 평가하기 위해 혈액생화학적인 변화를 관찰한 결과, ALT는 Normal에서는 52.80 ± 4.52 IU/L이었으나, APAP 로 간손상을 유도한 경우는 133.20 ± 12.37 IU/L로 유의하게 증가하였다.
- SCE가 APAP로 유도된 지질과 산화에 대한 억제 효과를 살펴보기 위하여 MDA 함량을 조사한 결과, Normal에서 MDA 를 100%로 하였을 때, APAP로 간손상을 유도한 경우는 150.18 ± 19.37%로 유의하게 증가하였으며, 이러한 증가는 SCE 50, 100 mg/kg의 투여로 각각 99.92 ± 2.61, 100.91 ± 12.42 (%)로 감소하였다 (Fig. 4).
- SCE가 APAP에 의해 유도된 간독성에 미치는 효과를 조직 학적으로 평가를 한 결과, APAP를 투여한 경우 간세포의 공포화, 지방소적의 간세포내 축적 및 염증세포 침윤과 같은 소엽중심성 괴사 소견이 관찰되었으나, 이들 APAP 투여에 의한간 손상은 SCE의 투여에 의해 현저하게 감소되었다 (Fig. 2).
- SCE의 항산화 효과를 측정하기 위하여 간 조직내의 GSH 함량을 관찰한 결과, Normal 그룹의 GSH level을 100%로 하였을 때, APAP 그룹은 71.99 ± 3.42%의 GSH level을 보여 APAP에 의해 GSH가 유의하게 감소하였다.
- 간 변성율은 Normal에서는 4.76 ± 1.17%를 나타내 었으며, APAP에 의해서는 49.60 ± 10.51%로 유의하게 증가되었다.
- 간 조직으로 부터 MDA 함량변화를 조사해 본 결과, APAP 단독 처리한 간 조직에서 Normal에 비해 현저하게 증가된 MDA 함량이 관찰되었으나, SCE에 의해 감소되었다. 이러한 결과로부터, SCE가 지질과산화를 억제함으로써 APAP에 의한 간손상을 보호한다고 할 수 있다.
- 그 결과 SCE는 APAP에 의해 증가된 ALT, AST, LDH 수치 및 간 조직의 변성율, 침윤된 염증세포의 수 및 변성 간세포수, hepatic MDA 함량을 유의하게 감소시켰으며, 또한 APAP에 의해 감소된 Hepatic glutathione (GSH)를 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과로 보아 계혈등은 APAP로 유도된 급성 간독성에 대해 유의한 보호 효과를 나타내었으며, 특히 GSH의 감소를 억제하고 지질과산화를 막음으로써 간보호 효과를 나타낸 것으로 보여 진다.
- . 그 결과, APAP 에 의해 pro-caspase-3의 발현이 감소되어 apoptosis가 유도되었음을 추측할 수 있었으며, SCE에 의해 발현량이 다시 증가되었다. 따라서, SCE는 APAP가 유도한 apoptosis 과정을 억제함으로써 간 손상을 방어할 것으로 사료되나, apoptosis 과정에서 SCE의 명확한 역할을 규명하기 위해서는 연구가 더 필요하다.
- 단백질 발현량을 densitometer로 측정하여 Normal을 100%로 하였을 때, APAP군은 43.10 ± 9.78%로 발현량이 유의하게 감소하였으며, 100 mg/kg의 SCE 투여로 인해 94.54 ± 12.52%로 발현량이 유의하게 증가하였다 (Fig. 6B).
- 이상의 결과들로부터 SCE는 APAP로 유도된 급성 간독성에 대해 유의한 보호 효과를 가진 것으로 생각되며, 이러한 SCE의 간보호 효과는 급격한 GSH의 감소에 대한 방어 효과와 지질과산화 억제 효과로 설명할 수 있다. 더불어, SCE는 apoptosis로 유도되는 간손상에서 pro-caspase-3를 억제함 으로써 간 보호에 관여할 것으로 추측된다. 이는 계혈등이 간손상에 대한 예방 및 치료제로서의 활용가능성을 보여 준 것으로, 향후 계혈등에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 혈액학적 분석으로 ALT, AST, LDH를 살펴본 결과, APAP는 Normal에 비해 현저하게 상승된 수치를 보였으나, SCE에 의해 유의하게 수치가 감소하였다. 더불어, 조직학적 평가에서도 APAP를 단독 처치한 간조직에서 관찰되었던 간세포의 공포화, 지방소적의 간세포내 축적 및 염증세포 침윤과 같은 소엽중심성 괴사가 SCE에 의해 감소됨을 확인할 수있었다. 또한 Normal의 간조직의 변성율이 4.
- 또한 Normal의 간조직의 변성율이 4.76 ± 1.17% 인데 반해 APAP를 단독 처치한 간조직은 49.60 ± 10.51% 의 간 변성율을 보여 간손상이 확인되었다.
- 많은 연구 결과들에서 발표된 것처럼 APAP에 의한 간독성화 과정에서 생산된 NAPQI는 GSH의 양을 급격히 고갈시키며, 이로 인해 세포 괴사 반응이 진행된다고 알려져 있다21,27,55). 본 실험에서도 APAP를 단독으로 처치한 간 조직에서 현저하게 감소된 GSH 함량을 확인할 수 있었으며, 이러한 GSH의 감소는 SCE에 의해 회복되었다. 따라서 SCE는 APAP로 유도된 간독성에서 GSH의 고갈을 방지하고 지질과산화를 억제함으로써 간 보호 작용을 발휘하는 것으로 추측된다.
- 그 결과 SCE는 APAP에 의해 증가된 ALT, AST, LDH 수치 및 간 조직의 변성율, 침윤된 염증세포의 수 및 변성 간세포수, hepatic MDA 함량을 유의하게 감소시켰으며, 또한 APAP에 의해 감소된 Hepatic glutathione (GSH)를 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과로 보아 계혈등은 APAP로 유도된 급성 간독성에 대해 유의한 보호 효과를 나타내었으며, 특히 GSH의 감소를 억제하고 지질과산화를 막음으로써 간보호 효과를 나타낸 것으로 보여 진다.
- 간 조직으로 부터 MDA 함량변화를 조사해 본 결과, APAP 단독 처리한 간 조직에서 Normal에 비해 현저하게 증가된 MDA 함량이 관찰되었으나, SCE에 의해 감소되었다. 이러한 결과로부터, SCE가 지질과산화를 억제함으로써 APAP에 의한 간손상을 보호한다고 할 수 있다.
- 이상의 결과들로부터 SCE는 APAP로 유도된 급성 간독성에 대해 유의한 보호 효과를 가진 것으로 생각되며, 이러한 SCE의 간보호 효과는 급격한 GSH의 감소에 대한 방어 효과와 지질과산화 억제 효과로 설명할 수 있다. 더불어, SCE는 apoptosis로 유도되는 간손상에서 pro-caspase-3를 억제함 으로써 간 보호에 관여할 것으로 추측된다.
- 혈액학적 분석으로 ALT, AST, LDH를 살펴본 결과, APAP는 Normal에 비해 현저하게 상승된 수치를 보였으나, SCE에 의해 유의하게 수치가 감소하였다. 더불어, 조직학적 평가에서도 APAP를 단독 처치한 간조직에서 관찰되었던 간세포의 공포화, 지방소적의 간세포내 축적 및 염증세포 침윤과 같은 소엽중심성 괴사가 SCE에 의해 감소됨을 확인할 수있었다.
후속연구
- 그 결과, APAP 에 의해 pro-caspase-3의 발현이 감소되어 apoptosis가 유도되었음을 추측할 수 있었으며, SCE에 의해 발현량이 다시 증가되었다. 따라서, SCE는 APAP가 유도한 apoptosis 과정을 억제함으로써 간 손상을 방어할 것으로 사료되나, apoptosis 과정에서 SCE의 명확한 역할을 규명하기 위해서는 연구가 더 필요하다.
- 더불어, SCE는 apoptosis로 유도되는 간손상에서 pro-caspase-3를 억제함 으로써 간 보호에 관여할 것으로 추측된다. 이는 계혈등이 간손상에 대한 예방 및 치료제로서의 활용가능성을 보여 준 것으로, 향후 계혈등에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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