[논문]Sulforaphane에 의한 HeLa 인체자궁경부함세포의 증식 억제 기전 연구

박성영; 배송자; 최영현

doi:10.5352/jls.2005.15.3.397

Sulforaphane에 의한 HeLa 인체자궁경부함세포의 증식 억제 기전 연구
Anti-proliferative Effects of the Isothiocyanate Sulforaphane on the Growth of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.15 no.3 = no.70, 2005년, pp.397 - 405

박성영 (신라대학교 자연과학대학 식품영양학과 및 마린바이오산업화지원센터) , 배송자 (신라대학교 자연과학대학 식품영양학과 및 마린바이오산업화지원센터) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실 및 대학원 바이오물질제어학과)

초록
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브로콜리와 같은 십자화과 식물에서 glucoraphanin의 가수분해를 통해 생성되는 isothiocyanate의 일종인 sulforaphane은 강력한 항암효과를 가지며, 역학적 조사를 포함한 다양한 선행 연구에서 androgen 비 의존적으로 성장하는 전립선 암세포의 증식을 억제하는데 효과가 있었다. 최근 연구 결과에 따르면 sulforaphane은 다양한 인체암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유발할 수 있는 것으로 알려지고 있으나, 정확한 분자생물학적 기전은 밝혀져 있지 않은 상태이다. 본 연구에서는 sulforaphane의 항암작용 기전을 조사하기 위하여 HeLa 인체자궁경부암세포의 증식에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하였다. Sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 세포의 증식억제 및 형태적 변형은 세포주기 C2/M arrest 및 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. RT-PCR 및 Western blot 분석 결과, sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A 및 cyclin-dependent kinase (Cdk)4 단백질의 발현이 선택적으로 저하되었으며, Cdc2, Cdk inhibitor인 p16 및 p21의 발현은 증가되었다 그러나 sulforaphane은 cyclooxygenases의 발현이나 telomere 조절에 중요한 역할을 하는 인자들의 발현에는 큰 영향을 주지 못하였다. Sulforaphane의 항암 기전을 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 부가적으로 필요하겠지만, 본 연구의 결과들에 의하면 sulforaphane은 강력한 인체암세포의 증식 억제 및 항암작용이 있을 것을 시사하여 준다고 할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Sulforaphane, an isothiocyanate derived from hydrolysis of glucoraphanin in broccoli and other cruciferous vegetables, was shown to induce phase II detoxification enzymes and inhibit chemically induced mammary tumors in rodents. Recently, sulforaphane is known to induce cell cycle arrest and apoptosis in human cancer cells, however its molecular mechanisms are poorly understood. In the present study, we demonstrated that sulforaphane acted to inhibit proliferation and induce morphological changes of human cervical carcinoma HeLa cells. Treatment of HeLa cells with $10{\mu}M\;or\;15{\mu}M$ sulforaphane resulted in significant G2/M cell cycle arrest as determined by flow cytometry. Moreover, $20{\mu}M$ sulforaphane significantly induced the population of sub-G1 cells (9.83 fold of control). This anti-proliferative effect of sulforaphane was accompanied by a marked inhibition of cyclin A and cyclin-dependent kinase (Cdk)4 protein and concomitant induction of Cdc2, Cdk inhibitor p16 and p21. However, sulforaphane did not affect the levels of cyelooxygenases and telomere-regulatory gene products. Although further studies are needed, the present work suggests that sulforaphane may be a potential chemoprevetive/ chemotherapeutic agent for the treatment of human cancer cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

세포주기 조절의 관점에서 암세포는 세포주기의 비정상화에 기인된 질병으로 정의될 수 있으며, 특정 시기의 세포주기 억제는 세포주기 조절 양성인자의 발현저하 또는 음성조절 인자의과발현에 의한 것으로 요약될 수 있다[6, 24]. 따라서 sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 자궁경부암세포의 성장억제가 세포주기 특정 시기의 교란과 연관성을 지니는지의 여부를 조사하기 위하여 세포주기 분포에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하였다.이를 위하여 정상 및 다양한 농도의 sulforaphane이 처리된 배지에서 48시간 배양한 후 flow cytometry를 이용하여 분석한 결과는 Fig.
또한 COX-2의 과발현에 의해 암 조직에서 의 혈관 신생 및 전이능이 높아지고 apoptosis를 막는다는 점과 COX-2 저해제에 의한 angiogenesis와 종양 형성의 억제 등의 결과에서 이 유전자의 선택적 조절에 의한 암 예방 전략 이 대두되고 있다. 따라서 본 연구에서는 sulforaphane 처리에 의한 인체 암세포의 증식억제가 COX-2의 선택적발현 억제와 관련이 있는지의 여부를 조사하였다. 상기에서와 동일 조건에서 얻어진 암세포들을 대상으로 COX-1 및 COX-2의
2]. 따라서 본 연구에서는 sulforaphane의 처리가 이러한 telomere 조절 관련 유전자들의 발현에 영향을 미칠 수 있을지의 가능성을 조사하여 보았다. Fig.
그러나 pl6의 경우 일반적으로 G1 기 arrest에만 관여하는 것으로 알려져 있으며, p27 역시 G1 기 arrest에 중요하지만 부분적으로 G2/M기 arrest에도 관여할 수 있는 것으로 보고되어지고 있다[6, 10]. 따라서 본 연구에서는 sulforaphane의 처리에 의한 인체 자궁경부암 세포의 G2/M기의 억제 유발에 종양 억제 유전자p53 및 pl6, p21 그리고 p27과 같은 Cdk inhibitors 들의 관련 여부를 조사하였다. Fig.
본 연구에서는 sulforaphane의 항암기 전에 관한 연구가 거의 이루어져 있지 않은 자궁경부암세포를 선택하여 sul- foraphane이 자궁경부암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사 하였다.
최근 연구 결과에 따르면 sulforaphane은 다양한 인체 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유발할 수 있는 것으로 알려지고 있으나, 정확한 분자생물학적 기전은 밝혀져 있지 않은 상태이다. 본 연구에서는 sulforaphane의 항암작용기전을 조사하기 위하여 HeLa 인체자궁경부암 세포의 증식에 미치는 sulforaphane 의 영향을 조사하였다. Sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 세포의 증식억제 및 형태적 변형은 세포주기 G2/M arrest 및 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.

제안 방법

이 때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehy drogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산 물들을 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 ultra violet (이하에서 확인하였다.
암세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 훅, sulforaphane 을 적정 농도별로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA) 시약을 0.5 mg/mL 농도가 되게 성장배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 배양 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정상배지에서 배양된 암세포와 sulforaphane처리된 배지에서 배양된 세포들의 성장률을 비교하였다. 세포 형태 변화 관찰을 위해서는 세포배양용 petridish에 세포를 24시간 동안 안정화시킨 다음 sulforaphane을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경 하에서 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다.
1% Tween 20 in PBS)에 4℃에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후enhanced chemilum-inoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, Ⅱ, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다.본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
특히 Cdk2는 cyclin A와 결합하여 S기와 G2기 동안 역할을 [7, 이하는 반면 Cdc2는 cyclin Bl과 결합하면 핵막의 histone Hl과 lamin이 인산화에 의해 kinase 활성이 증가하여 핵막의 붕괴 및 염색체의 재배열이 일어나서 M기로 진행이 된다[15, 19]. 따라서 HeLa 자궁경부암 세포에서 sulfora- phane의 처리에 따른 세포주기 조절 관련 기전을 조사하기 위하여 cyclins 및 Cdks의 발현에 미치는 sulforaphane의 영향을 RT-PCR 및 Western immunoblotting 법으로 먼저 조사하였다. Fig.
먼저 인체 자궁경부암 HeLa 세포의 증식에 미치는 sul- foraphane의 영향을 알아보기 위하여 실험 재료 및 방법에서 서술한 것처럼 HeLa 세포를 안정화시킨 후 48시간 동안 배지에 sulforaphane을 적정 농도로 희석하여 처리한 후, MTT assay를 실시하였으며, 그 결과를 Fig. 1A에 나타내었다. Fig.
, Carlsbad, CA, USA)를 4℃에서 1 시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 2의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자(Table 1)를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다.
상충액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량시 RBio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)- polyacrylamide g인을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schnell, Keene, NH, USA) 으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 4℃에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후enhanced chemilum-inoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.
상기와 동일한 조건으로 준비된 암세포를 대상으로 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 4℃에서 1 시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 2의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다.
정상 및 sulforaphane처리된 배지에서 자란 세포들을 수집하여 적당량의 lysis buffer를 첨가하여 4℃ 에서 30분간 반응시킨 후, 14, 000 rpm으로 15분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상충액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량시 RBio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)- polyacrylamide g인을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schnell, Keene, NH, USA) 으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함유한 PBS-T (0.
5 mg/mL 농도가 되게 성장배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 배양 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정상배지에서 배양된 암세포와 sulforaphane처리된 배지에서 배양된 세포들의 성장률을 비교하였다. 세포 형태 변화 관찰을 위해서는 세포배양용 petridish에 세포를 24시간 동안 안정화시킨 다음 sulforaphane을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경 하에서 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다.
세포주기의 분포도에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 Cycle TEST PLUS kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하였으며, 정상 및 sulforaphane이 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포들을 buffer solution을 이용하여 두세 번 씻어내고, Cycle TEST PLUS solution A 및 B를 상온에서 각각 10분씩 처리한 후 Cycle TEST PLUS solution C를 처리하여 4C에서 30분 동안 염색하였다. 이를 nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.
이상의 결과들은 인체 유방암 세포, 전립선암 세포, 대장암 세포, 췌장암 세포 및 악성 백혈구 등에서 관찰된 최근의 선행연구들에서 관찰된 경우와 유사한 경향성을 보여주는 것으로 [2, 14, 18, 20, 22, 25], sulforaphane은 자궁경부암 세포에서도 다른 암세포에서처럼 비슷한 증식억제 효능이 있음을 알 수 있었다. 아울러 sulforaphane의 처리가 암세포의 형태에 어떠한 영향을 주는지에 대해 알아보기 위하여 여러 농도의 sulforaphane 을 48시간 동안 처리 후 위상차현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰한 결과는 Fig. IB에 나타낸 바와 같다. 즉 sul foraphane 처리 농도의존적으로 현저한 세포밀도의 감소 현 상과 형태적인 변화를 관찰할 수 있으며, sulforaphane의 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리 농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는 dendrite-like structure가 관찰되었다.
세포주기의 분포도에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 Cycle TEST PLUS kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하였으며, 정상 및 sulforaphane이 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포들을 buffer solution을 이용하여 두세 번 씻어내고, Cycle TEST PLUS solution A 및 B를 상온에서 각각 10분씩 처리한 후 Cycle TEST PLUS solution C를 처리하여 4C에서 30분 동안 염색하였다. 이를 nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 sulforaphane은 Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였으며 10 mM의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 -20C에 보관하여 사용하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다. 실험에 사용한 인체 자궁경부암 HeLa 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 90%의 Dulbecco^s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL), 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL) 등이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다.
, Arlington Heights, Ⅱ, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다.본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, US시에서 구입하였으며, 이차 항체로사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Hechts, Ⅱ, USA)에서 구입하였다.
Luis, MO, USA)에서 구입하였으며 10 mM의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 -20C에 보관하여 사용하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다. 실험에 사용한 인체 자궁경부암 HeLa 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 90%의 Dulbecco^s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL), 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL) 등이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위해 적정시간 배양 후 0.

이론/모형

분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 2의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자(Table 1)를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이 때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehy drogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.

성능/효과

따라서 HeLa 자궁경부암 세포에서 sulfora- phane의 처리에 따른 세포주기 조절 관련 기전을 조사하기 위하여 cyclins 및 Cdks의 발현에 미치는 sulforaphane의 영향을 RT-PCR 및 Western immunoblotting 법으로 먼저 조사하였다. Fig. 3A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이 조사된 cyclins 중, cyclin Bl을 제외한 다른 cyclin은 전사 수준에서 sulfora phane 처리에 따라 농도의존적으로 다소 감소되는 경향을 보였으나, 단백질 수준에서의 발현은 sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A의 발현이 다른 cyclin에 비하여 매우 억제되었음을 알 수 있었다. 그리고 Cdks의 발현에 미치는 sulfora- phane의 영향을 조사한 결과는 Fig.
따라서 본 연구에서는 sulforaphane의 처리에 의한 인체 자궁경부암 세포의 G2/M기의 억제 유발에 종양 억제 유전자p53 및 pl6, p21 그리고 p27과 같은 Cdk inhibitors 들의 관련 여부를 조사하였다. Fig. 5A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이 종양 억제 유전자 p53의 경우 전사 수준에서 의 큰 변화 없이 10 uiM 및 15 uM 처리군에서 부분적인 단백질의 축적 현상을 관찰할 수 있었으나 sulforaphane 처리 농도의존적으로 발현 자체가 증가하는 것은 아닌 것으로 판단된다. Cdk inhibitor 중에서 p27은 sulforaphane 처리에 의하여 큰 변화가 없었으나, p21 의 경우 sulforaphane이 처리된 배지에서 배양된 세포에서 전체적으로 다소 높게 나타났다.
Sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 세포의 증식억제 및 형태적 변형은 세포주기 G2/M arrest 및 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. RT-PCR 및 Western blot 분석 결과, sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A 및 cyclin-dependent kinase (Cdk)4단백질의 발현이 선택적으로 저하되었으며, Cdc2, Cdk inhibitor인 pl6 및 p21 의 발현은 증가되었다. 그러나 sulforaphane은 cyclooxygenases의 발현이나 telomere 조절에 중요한 역할을 하는 인자들의 발현에는 큰 영향을 주지 못하였다.
그러나 sulforaphane은 cyclooxygenases의 발현이나 telomere 조절에 중요한 역할을 하는 인자들의 발현에는 큰 영향을 주지 못하였다. Sulforaphane 의 항암기전을 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 부가적으로 필요하겠지만, 본 연구의 결과들에 의하면 sulforaphane 은 강력한 인체 암세포의 증식억제 및 항암작용이 있을 것을 시사하여 준다고 할 수 있다.
본 연구에서는 sulforaphane의 항암작용기전을 조사하기 위하여 HeLa 인체자궁경부암 세포의 증식에 미치는 sulforaphane 의 영향을 조사하였다. Sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 세포의 증식억제 및 형태적 변형은 세포주기 G2/M arrest 및 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. RT-PCR 및 Western blot 분석 결과, sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A 및 cyclin-dependent kinase (Cdk)4단백질의 발현이 선택적으로 저하되었으며, Cdc2, Cdk inhibitor인 pl6 및 p21 의 발현은 증가되었다.
86% 정도였다. 그리고 10 nM 및 15 yM 처리군의 경우 및 G2/M 기의 빈도는 대조군과 유사하였으나, apoptosis 유발에 해당되는 sub-Gl기에 해당되는 빈도가 대조군의 5.06%에 비하여 각각 22.18% 및 31.40%로 매우 증가되었다. 따라서 sub-Gl 기에 속한 세포를 제외한 나머지 세포들을 고려할 경우, sul foraphane 3] 처리에 따라 G1 기에 속하는 세포의 빈도는 감소된 반면, G2/M기에 속하는 암세포의 빈도가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다.
따라서 sub-Gl 기에 속한 세포를 제외한 나머지 세포들을 고려할 경우, sul foraphane 3] 처리에 따라 G1 기에 속하는 세포의 빈도는 감소된 반면, G2/M기에 속하는 암세포의 빈도가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 그리고 20 |1M sulforaphane의 처리군의 경우 약 50%에 해당되는 세포가 sub-Gl기에 속하여 sulforaphane 처리에 따른 암세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest와 연관된 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. HeLa 자궁경부암 세포에서 관찰된 이러한 현상은 췌장암 세포, 유방암 세포, 대장암 세포, 전립선암 세포, 흑색종세포 등에서 나타난 결과와 매우 유사하였다[14, 20, 2225],
즉 10처리군의 경우 대조군에 비하여 40% 이상 세포 증식이 억제되었으며, 20 uM 처리군에서는 약 78% 정도의 세포 증식 억제 현상을 관찰할 수 있었다. 그리고 30 \jM 처리군에서는 생존율이 10% 정도로 암세포가 정상적인 생존을 하 지 못하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 유방암 세포, 전립선암 세포, 대장암 세포, 췌장암 세포 및 악성 백혈구 등에서 관찰된 최근의 선행연구들에서 관찰된 경우와 유사한 경향성을 보여주는 것으로 [2, 14, 18, 20, 22, 25], sulforaphane은 자궁경부암 세포에서도 다른 암세포에서처럼 비슷한 증식억제 효능이 있음을 알 수 있었다.
3A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이 조사된 cyclins 중, cyclin Bl을 제외한 다른 cyclin은 전사 수준에서 sulfora phane 처리에 따라 농도의존적으로 다소 감소되는 경향을 보였으나, 단백질 수준에서의 발현은 sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A의 발현이 다른 cyclin에 비하여 매우 억제되었음을 알 수 있었다. 그리고 Cdks의 발현에 미치는 sulfora- phane의 영향을 조사한 결과는 Fig. 4A 및 B에서 알 수 있듯이, Cdk4가 sulforaphane 처리 농도의존적으로 강하게 전사 및 번역 수준에서 발현이 감소되었으나, Cdk2 및 Cdk6의 경우 sulforaphane 처리에 따른 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다. 그러나 Cdc2의 경우 대조군에 비하여 sulforaphane 처리군에서 전체적으로 단백질 발현이 오히려 다소 증가되었음을 알 수 있었다.
40%로 매우 증가되었다. 따라서 sub-Gl 기에 속한 세포를 제외한 나머지 세포들을 고려할 경우, sul foraphane 3] 처리에 따라 G1 기에 속하는 세포의 빈도는 감소된 반면, G2/M기에 속하는 암세포의 빈도가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 그리고 20 |1M sulforaphane의 처리군의 경우 약 50%에 해당되는 세포가 sub-Gl기에 속하여 sulforaphane 처리에 따른 암세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest와 연관된 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
즉 sul foraphane 처리 농도의존적으로 현저한 세포밀도의 감소 현 상과 형태적인 변화를 관찰할 수 있으며, sulforaphane의 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리 농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는 dendrite-like structure가 관찰되었다. 따라서 인체 자궁경부암 세포의 sulforaphane 처리 농도의존적인 형태적 변화와 밀도의 감소는 sulforaphane 처리에 따른 세포 증식억제와 부합되는 결과임을 알 수 있었다.
그리고 30 \jM 처리군에서는 생존율이 10% 정도로 암세포가 정상적인 생존을 하 지 못하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 유방암 세포, 전립선암 세포, 대장암 세포, 췌장암 세포 및 악성 백혈구 등에서 관찰된 최근의 선행연구들에서 관찰된 경우와 유사한 경향성을 보여주는 것으로 [2, 14, 18, 20, 22, 25], sulforaphane은 자궁경부암 세포에서도 다른 암세포에서처럼 비슷한 증식억제 효능이 있음을 알 수 있었다. 아울러 sulforaphane의 처리가 암세포의 형태에 어떠한 영향을 주는지에 대해 알아보기 위하여 여러 농도의 sulforaphane 을 48시간 동안 처리 후 위상차현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰한 결과는 Fig.
7에서 보여주 는 바와 같이 telomere와 관련된 human telomere reverse transcriptase (hTERT), human telomerase RNA (hTR), mam malian telomerase-associated protein-1 (TEP~1)Z그리고 tran scription control factor■인 c-myc 등을 조사해 보았으나, 유의적인 차이점은 관찰할 수 없었다. 이상의 결과에서 sulforaphane 의 처리에 의한 HeLa 세포의 증식억제에는 prostagandin 및 telomere 조절인자들의 발현 변화와는 무관함을 알 수 있었다. 그러나 Raw 264.
1A에 나타낸 바와 같이 48시간 동안 정상배지에서 자란 HeLa 세포에 비하여 sulforaphane이 함유된 배지에서는 sulforaphane5] 첨가농도 의존적으로 세포의 증식이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉 10처리군의 경우 대조군에 비하여 40% 이상 세포 증식이 억제되었으며, 20 uM 처리군에서는 약 78% 정도의 세포 증식 억제 현상을 관찰할 수 있었다. 그리고 30 \jM 처리군에서는 생존율이 10% 정도로 암세포가 정상적인 생존을 하 지 못하였음을 알 수 있었다.
IB에 나타낸 바와 같다. 즉 sul foraphane 처리 농도의존적으로 현저한 세포밀도의 감소 현 상과 형태적인 변화를 관찰할 수 있으며, sulforaphane의 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리 농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는 dendrite-like structure가 관찰되었다. 따라서 인체 자궁경부암 세포의 sulforaphane 처리 농도의존적인 형태적 변화와 밀도의 감소는 sulforaphane 처리에 따른 세포 증식억제와 부합되는 결과임을 알 수 있었다.

후속연구

그리고 pl6의 경우 단백질의 발현이 다소 증가되어 특히 최고 농도 처리군에서는 대조군에 비하여 매우 높은 발현을 보여주었다. 그러나 Fig. 5에 나타낸 바와 같이 조사된 p53 및 Cdk inhibitor 모두가 전사 수준에서는 발현의 양상에 큰 변화 없이 단백질 발현이 sulforaphane 처리에 따라 다소의 차이를 보이는 것으로 보아 아마도 이들 단백질들은 sulforaphane의 처리에 의한 번역 후 다른 기전에 의하여 조절받을 가능성도 있기 때문에 이에 관한 추가적인 연구가 이루어져야할 것으로 생각된다.

참고문헌 (31)

Ajita, V. S., Dong, X., Karen, J. L., Rajiv, D and Shivendra, V. S. 2004. Sulforaphane induces caspase-mediated apoptosis in cultured PC-3 human prostate cancer cells and retards growth PC-3 xenografts in vivo. Carcinogenesis 25, 83-90

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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