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문제 정의
- 본 연구에서 사용한 양송이 즙 금 전극이 어느 기간까지 유용하게 사용할 수 있는지를 알아보기 위해 25일간 p-chlorophenol을 이용하여 감응 전류의 변화를 조사하였다. 이때 p-chlorophenol 용액은 매일 만들어 사용하였으며, 실험 동안전극은pH=6.
- 본 연구에서는 우리 주위에서 쉽게 구할 수 있는 양송이 즙-금 전극 바이오센서를 제작하여 페놀을 정량 할 때의 최적 pH, 감응시간, 최적온도, 감도, 안정 성 등 전극의 여러 가지 전기화학적 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Gold 전극과 양송이 즙에 들어 있는 효소인 tyrosinase 를 이용하여 페놀의 농도를 정량하기 위한 바이오센 서의 최적 실험 조건을 다음과 같이 조사하였다.
- 4는 작업전극의 전위에 대한 전류의 의존도를 보여주고 있다. pH=6.53인 0.050 M 인산 완충 용액 에 1.0X 1.0-5 M p-chlorophenol 20 µL를 넣었을 때 나타난 작업전극의 전류를 측정하였다. 본 연구에서는 작업전극의 전위를 0.
- 공기로 포화시킨 완충용액과 질소로 포화시킨 완충 용액에서 2 µM phenol을 넣었을 때 나타나는 감응전류를 비교하였다. 인산완충용액을 5분 동안 질소로 포화시킨 용액에서 phenol에 대한 감응전류는 공기로 포화시킨 완충용액의 신호와 거의 같게 나타났다.
- 양송이 즙은 마이크로피펫을 이용하여 50 μL를 취한 후 금 전극의 표면에 가한 후 셀로판지로 덮어서 고정하였다. 또한, 금 전극은 먼저 증류수로 씻고, 메탄올로 씻은 후 킴와이프스로 잘 닦았다. 이것을 패드 표면 위에 polishing alumina(BAS사 CF-1050) 5방울을 떨어뜨린 후 2분 동안 문질렀다.
- 반응용기는 20 mL 들이 의 부피를 갖는 BAS-Model VC-2 voltammetric cell을 사용하였고, 이 cell을 구멍 뚫린 teflon 마개로 막은 다음 작업 전극, 기준 전극, 백금 보조전극을 마개의 구멍에 각각 고정시키고, 각 전극을 potentiostat에 연결하였다. 작업 전극으로는 시중 금방에서 주문 제작한 지름 8 mm, 두께 2 mm의 순금(99.
- 본 연구에서는 금 전극에 양송이에 들어있는 tyrosinase 효소를 고정시켜 산소 분자의 수산기화 반 응을 통해 페놀을 catechol과 o-quinone으로 바꾸는 산 화반응의 촉매 역할을 하도록 하였다. 정 량분석 신호 는 o-quinone이 catechol로 전기 화학적 환원반응에 대 한 전류를 감응전류로 측정하였다.
- 본 연구에서는 금 전극에 양송이에 들어있는 tyrosinase 효소를 고정시켜 산소 분자의 수산기화 반 응을 통해 페놀을 catechol과 o-quinone으로 바꾸는 산 화반응의 촉매 역할을 하도록 하였다. 정 량분석 신호 는 o-quinone이 catechol로 전기 화학적 환원반응에 대 한 전류를 감응전류로 측정하였다.
- 페놀 화합물은 메탄올에 적정량을 녹여 만들었고, 완충용액은 0.050 M KH2PO4와 0.050 M K2HPO4 용액의 부피 비를 적절히 조합하여 만들었으며, 모든 용액은 항상 실험 직전에 새로 만들어 사용하였다.
- 효소-금 전극의 pH 의존성은 pH=5.9에서 pH=7.7 범위에서 조사하였다. Fig.
대상 데이터
- 또한 기록계는 Kipp & Zonnen recorder를 사용하였다. 기준전극과 보조전극으로 각각 Ag/ AgCl(Model Re-1 BAS)과 백금선 전극을 이용하였으며, 일정량의 시료를 취하기 위하여 Gilson사의 micropipet을 사용하였다.
- 메탄올은 Merck사(99.8%)의 것을 사용하였고 KH2PO4와 K2HPO4는 Shinyo 순정 화학주식 회사의 것을, phenol, catechol은 Aldrich 사의 시약을, p-chlorophenol(JUNSEI 98%)과 p-cresol(KANTO Chemical. Co. 99%)을 사용하였다. 모든 용액은 증류수를 이용하여 만들었다.
- 실험에 사용한 양송이 버섯은 대형 할인점에서 구입하여 5 ℃로 유지된 냉장고에 보관하여 사용하였다.
- 반응용기는 20 mL 들이 의 부피를 갖는 BAS-Model VC-2 voltammetric cell을 사용하였고, 이 cell을 구멍 뚫린 teflon 마개로 막은 다음 작업 전극, 기준 전극, 백금 보조전극을 마개의 구멍에 각각 고정시키고, 각 전극을 potentiostat에 연결하였다. 작업 전극으로는 시중 금방에서 주문 제작한 지름 8 mm, 두께 2 mm의 순금(99.9%) 전극을 사용하였다. 전류법 바이오센서로 페놀 농도를 측정하는 동안 시료 용액은 300 rpm의 속도로 저어주었다.
이론/모형
- 본 실험의 전류측정은 EG&G Princeton Applied Research Model 264A Scanning Potentiostat을 사용하여 측정 하였다. 또한 기록계는 Kipp & Zonnen recorder를 사용하였다.
성능/효과
- 전극은 4일째까지는 90%이상의 효율을 나타내었 으나 6일째부터는 60%로 감소하였다. 2 µM phenol을 사용하여 15회 반복 측정한 결과 상태 표준 편차는 1.23%이었으며,페놀의 검출한계는2.5X 10-7 M이었다.
- 3은 완충 용액의 농도를 달리 할 경우 나타나는 전류의 변화량을 나타낸 것이다. pH=6.53, 작업 전극의 전위 -0.15 V에서 완충 용액의 농도를 0.010 M에서 0.090 M까지 0.020 M 간격으로 농도를 변화시켰을 때, 완충 용액의 농도가 0.050 M 일 경우 감응 전류가 가장 크게 나타났다. 따라서 본 페놀 정량실험은 완충 용액의 농도를 0.
- 6은 감응 전류의 변화가 가장 크게 나오는 조건들에서 phenol (a), catechol (b), p-cresol (c), 및 p-chlorophcnoL(d)의 농도를 달리 하면서 감응 전류 값 의 변화를 측정한 것을 도시한 것이다. 검정곡선의 감도는 phenol > catechol >p-cresol >p-chlorophcnol의 순으로 나타났다. Table 1에 phenol, catechol, p-cresol, 및 p-chlorophcnol의 직선범위, 상관계수, 겉보기 Michaelis-Menten 상수(#)값을 나타내었다.
- 또한 페놀류 화합물의 양이 증가함에 따라 전류도 비례하여 증가하였으므로 효소 촉매분해반응으로 좋 은 전극임을 알 수 있었다. 검정곡선의 감도는 phenol > catechol >p-cresol >p-chlorophenol의 순으로 나타났 다. 전극은 4일째까지는 90%이상의 효율을 나타내었 으나 6일째부터는 60%로 감소하였다.
- 인산완충용액을 5분 동안 질소로 포화시킨 용액에서 phenol에 대한 감응전류는 공기로 포화시킨 완충용액의 신호와 거의 같게 나타났다. 그러나 30분 동안 질소로 포화시킨 완충용액에서는 공기로 포화된 용액에서 나타난 신호보다 대략 15%정도 신호의 감소가 나타났으며, 1시간 동안 포화시킨 완충용액에서는 대략 45%가 감소하였다. 이것은 이 실험에서 사용한 phenol의 농도가 2 µM로 매우 낮았 으므로 30분〜1시간 동안 질소로 포화시켰다 하더라도 완충용액에는 산소가 효소반응을 일으키는데는 비교적 충분한 양이 남아있기 때문이라고 생각된다24
- 23%이었 다. 또한 기록계의 감도를 조절하여 검출한계를 실험한 결과 페놀의 검출한계는 2.5X10-7 M이었다.
- 또한 페놀류 화합물의 양이 증가함에 따라 전류도 비례하여 증가하였으므로 효소 촉매분해반응으로 좋 은 전극임을 알 수 있었다. 검정곡선의 감도는 phenol > catechol >p-cresol >p-chlorophenol의 순으로 나타났 다.
- Onnerjord등은26 순수한 tyrosinase 효소를 사용하여 페놀을 정량하였을 때 14 일 후 초기 신호의 25%로 감소한 것에 비하여 본 실 험에서의 양송이 버섯 즙을 고정한 금 전극은 40%의 감응도를 유지하였다. 또한, 2 µM phenol을 사용하여 15회 반복 측정한 결과 상태 표준 편차는 1.23%이었 다. 또한 기록계의 감도를 조절하여 검출한계를 실험한 결과 페놀의 검출한계는 2.
- 0-5 M p-chlorophenol 20 µL를 넣었을 때 나타난 작업전극의 전류를 측정하였다. 본 연구에서는 작업전극의 전위를 0.00 V에서부터 -0.20V까지 0.050 V씩 변화시킬 때 -0.15 V의 환원전위에서 가장 큰 감응전류를 보인 후 다시 감소하였다. 따라서 본 실험에서는 감응전류가 높으면서 잡음이 적은 -0.
- 050 M 인산완충용액에서 전극의 감응 전류를 나타낸 것 이 다. 순수하게 분리 된 tyrosinase 효소 전극에 대한 최적 감응 pH 범위는 pH=5〜8로 보고되었으 며, 본 실험에서는 pH=6.0〜6.8로 나타났다. 특히, pH=6.
- 050 M 인산 완충용액에 담가 냉장 보관하였다. 실험 결과 4일째까지는 90%이상의 효율을 나타내었으나 6일째 부터는 60%로 감소하였다. Onnerjord등은26 순수한 tyrosinase 효소를 사용하여 페놀을 정량하였을 때 14 일 후 초기 신호의 25%로 감소한 것에 비하여 본 실 험에서의 양송이 버섯 즙을 고정한 금 전극은 40%의 감응도를 유지하였다.
- 전극은 pH=6.53(0.050 M 인산 완충용액)에서 가장 좋은 감응을 나타내었고, 전극은 -0.10 V-0.15 V의 환원전위에서 가장 좋은 감응을 나타내었다.
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