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문제 정의
- 크게 부각되고 있다. 그러나 지금까지 개발되어진 다양한 천연 및 합성 항산화제들은 독성, 유해성 및 약효면 등에서 한계를 지님으로서 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구의 하나로 천연물이나 약용식물로부터 새로운 항산화제를 개발하기 위하여 토복령에 대하여 항산화 효과 및 항산화 활성 주성분 규명 연구를 실시한 결과 다음과 같은지 견을 얻었다.
- 본 연구는 기존에 연구 개발되어진 천연 항산화제보다 안전하고 우수한 활성을 나타내는 항산화제를 천연물로부터 개발하기 위한 연구의 일환으로 토복령에 대하여 free radical 소거효과는 DPPH법을, 지질 과산화 억제효과는 Ferric- Thiocyanate법 및 Rancimat법을 이용하여 항산화 효과를 검토하였고, 활성 주성분을 규명하였으므로 이를 보고하고자 한다.
- 일반적으로 널리 사용되고 있는 합성 항산화제인 BHA와 BHT는 그 효과와 경제성 면에서 많이 사용해 왔지만 합성 식품 첨가물의 일반적인 회피 현상뿐만 아니라 과량 섭취 시에는 간, 위장점막, 폐, 순환계 등에 심각한 독성 작용을 일으키는 것으로 알려져26)안전한 대체 항산화제의 개발이 요구되어 인체에 무해하고 항산화력이 우수한 천연 항산화제의 개발을 위하여 토복령에 대한 항산화 효과를 연구하였다. 기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 a-tocopherol과 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 토복령 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용시험을 실시한 결과, Table I에 나타낸 바와 같이 토복령의 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에서 BHA와 유사한 강력한 free radical소거효과를 나타내었다.
제안 방법
- 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 나타낸 EtOAc 분획물을 ”-hexane t Acetone으로 단계적으로 극성을 높인 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하여 5개의 소분획인 fraction 1(48 mg), fraction 2(117 mg), fraction 3(85 mg), fraction 4(168 mg) 및 fraction 5(1146 mg)로 나누었다. 항산화 효과를 나타낸 fraction 3과 fraction 4로부터 활성 주성분을 규명하기 위해 계속하여 "-hexane—Acetone으로 단계적으로 극성을 높인 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography로 정제하여 fraction 3으로부터는 화합물 1을 분리하였고, fraction 4로부터는 화합물 2를 얻었다.
- 0.1 M의 초산 완충액 (pH 5.5, 2.0 ml)에 시료의 EtOH 용액 (2.0 ml) 및 2 X 10-4 M DPPH EtOH 용액 (1.0 ml)을 가하여 전량을 5 ml로 하고 실온에 방치한 후, 30분 후 517nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 시료 무첨가의 control의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(㎍)을 toco pherol 및 BHA와 같은 기존의 항산화제를 대조군으로 하여 시험하였다.
- 5 g, 증류수 70 ml, flow rate 20 L/hr, 반응온도 120°C로 하여 산화 안정성을 비교하였다. Antioxidant index(AI)는 각 시료를 첨가한 실험군의 유도기간을 무첨가 군의 유도기간으로 나눈 값으로 구하였다. 이때 시료의 첨가량은 각각 200, 400 및 600 ppm로 하여 3회 반복 측정하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다.
- 0g)를 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 나타낸 EtOAc 분획물을 ”-hexane t Acetone으로 단계적으로 극성을 높인 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하여 5개의 소분획인 fraction 1(48 mg), fraction 2(117 mg), fraction 3(85 mg), fraction 4(168 mg) 및 fraction 5(1146 mg)로 나누었다. 항산화 효과를 나타낸 fraction 3과 fraction 4로부터 활성 주성분을 규명하기 위해 계속하여 "-hexane—Acetone으로 단계적으로 극성을 높인 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography로 정제하여 fraction 3으로부터는 화합물 1을 분리하였고, fraction 4로부터는 화합물 2를 얻었다.
- 0 ml)을 가하여 전량을 5 ml로 하고 실온에 방치한 후, 30분 후 517nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 시료 무첨가의 control의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(㎍)을 toco pherol 및 BHA와 같은 기존의 항산화제를 대조군으로 하여 시험하였다.
- Lim 등2D의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료와 유지 혼합물 2.5 g, 증류수 70 ml, flow rate 20 L/hr, 반응온도 120°C로 하여 산화 안정성을 비교하였다. Antioxidant index(AI)는 각 시료를 첨가한 실험군의 유도기간을 무첨가 군의 유도기간으로 나눈 값으로 구하였다.
- Antioxidant index(AI)는 각 시료를 첨가한 실험군의 유도기간을 무첨가 군의 유도기간으로 나눈 값으로 구하였다. 이때 시료의 첨가량은 각각 200, 400 및 600 ppm로 하여 3회 반복 측정하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다.
- 표준품인 tocopherol 및 BHA (butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사 용하였고, 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV spectrophoto- meter를 사용하여 즉정하였고, FT-NMR은 Wrian Mercury 300MHz> 사용하였고, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를 사용하였고 보정은 하지 않았다. 산화 안정도 측정기기로서는 Rancimat 679 METROHM을 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였다. Free radical 소거효과측정용 시약인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며 지질과산화 억제 효과 즉정용 시약인 ammonium thiocyanate, Tween 20, HC1 및 Eton 등은 모두 특급시악을 사용하였고, 식용유지 (soybean, com, palm, lard)는 첨가제가 첨가되지 않은 식용유지를 사용하여 측정하였다. 표준품인 tocopherol 및 BHA (butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사 용하였고, 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다.
- 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV spectrophoto- meter를 사용하여 즉정하였고, FT-NMR은 Wrian Mercury 300MHz> 사용하였고, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를 사용하였고 보정은 하지 않았다. 산화 안정도 측정기기로서는 Rancimat 679 METROHM을 사용하여 측정하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용한 토복령은 강원도 원주시 소재 약업사에서 구입하여 음건하고 세절하여 실험 재료로 사용하였으며 , 표본은 상지대학교 바이오산업공학과 응용천연물표본 실에 보관중이다.
- Free radical 소거효과측정용 시약인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며 지질과산화 억제 효과 즉정용 시약인 ammonium thiocyanate, Tween 20, HC1 및 Eton 등은 모두 특급시악을 사용하였고, 식용유지 (soybean, com, palm, lard)는 첨가제가 첨가되지 않은 식용유지를 사용하여 측정하였다. 표준품인 tocopherol 및 BHA (butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사 용하였고, 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV spectrophoto- meter를 사용하여 즉정하였고, FT-NMR은 Wrian Mercury 300MHz> 사용하였고, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를 사용하였고 보정은 하지 않았다.
이론/모형
- 토복령 분획물 및 항산화 활성 주성분의 DPPH 라디칼 소거작용의 측정 - Uchiyama 등21)의 방법을 약간 변형시킨 Yoshikawa 등끄)의 방법에 의해 다음과 같이 측정하였다. 0.
- 토복령 분획물 및 항산화 활성 주성분의 Rancimat법에의한 지질 과산화 억제 활성 측정 - Rancimat법은 Chen 등2위과 Lim 등2D의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료와 유지 혼합물 2.
- 토복령 분획물의 Ferric-Thiocyanate법에 의한 지질 과산화 억제활성 측정 - Ferric-Thiocyanate법은 Inatani 등끄)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료의 EtOH 용액 (2.
성능/효과
- 또한 TLC 및 HPLC 분석에서 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin, 화합물 2는 (-)-epicatechin임을 추정할 수 있었다. 최종적으로 화합물 1의 및 13C-NMR 등의 기기 분석치를 표준품 및문헌치2"9의 spectral data와 비교 분석한 결과 화합물 1의 구조는 Fig. 2에 나타낸 것과 같이 quercetin으로 동정하였으며, 화합물 2의 ’H 및 13C-NMR 등의 기기 분석치를 표준품 및 문헌치30-32)의 spectral data와 비교 분석한 결과 화합물 2의 구조는 Fig. 2에 나타낸 것과 같이 (-)-epicatechin 으로 동정하였다.
- 1. 토복령 의 용매 별 분획 물에 대하여 DPPH법, Ferric- Thiocyanate법 및 Rancimat법에 의해 항산화 활성을 측정한 결과, 토복령의 EtOAc 분획물이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
- 2. 토복령의 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 우수한 항산화 효과를 나타낸 EtOAc 분획물에 대하여 항산화 활성을 검토하면서 소분획 및 주성분 단리를 실시한 결과 소 분획물 3과 4로부터 각각 화합물 1과 2를 분리하였다.
- 3. 분리된 화합물 1과 2의 기기 분석치를 표준품 및 문헌치의 spectral data와 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin 으로 화합물 2는 (-)-epicatechin으로 동정하였다.
- 4. 단리 된 quercetin과 (-)-epicatechin의 항산화 활성 을 DPPH법 및 Rancimat법에 의해 실시한 결과 quercetin과 (-)- epicatechin 모두 대조군인 oc-tocopherol보다는 우수하고, BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 보였다.
- 이들 중 토복령의 EtOAc 분획물은 54일 이상을 유지함으로서 천연 항산화제인 a-toco- pherol 보다는 월등히 우수하고, 합성 항산화제인 BHA와는 유사한 강력한 지질 과산화 억제 효과를 보였다. Rancimat 법에 의한 지질 산패 억제실험 결과 또한 Table II에 나타낸 것과 같이 토복령의 EtOAc 분획물이 4종의 식용유지(soybean, com, lard, palm oil)에서 a-tocopherol 보다는 우수하고 BHA 보다는 약간 우수한 지질 산패 억제 효과를 보였다.
- 기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 a-tocopherol과 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 토복령 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용시험을 실시한 결과, Table I에 나타낸 바와 같이 토복령의 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에서 BHA와 유사한 강력한 free radical소거효과를 나타내었다. 계속하여 보다 상세한 항산화 효과시험을 위해 불포화지방산인 linoleic acid를 이용하여 불포화지방산의 과산화 정도를 장기보관에 따른 억제율로 항산화 활성을 측정하는 Ferric-Thiocyanate법에 의한 지질 과산화 억제 시험 결과 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 Control 군이 거의 과산화가 일어남에 비하여 합성 항산화제인 BHA를 첨가한 군은 57일 만에 과산화가 일어났으며, 토복령의 n- hexane과 H2O 분획물을 첨가한 군은 36일 이상, 토복령의 MeOH, EtOAc 및 BuOH 분획물을 첨가한 군에서는 51일 이상에서 과산화가 일어났다. 이들 중 토복령의 EtOAc 분획물은 54일 이상을 유지함으로서 천연 항산화제인 a-toco- pherol 보다는 월등히 우수하고, 합성 항산화제인 BHA와는 유사한 강력한 지질 과산화 억제 효과를 보였다.
- 기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 a-tocopherol과 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 토복령 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용시험을 실시한 결과, Table I에 나타낸 바와 같이 토복령의 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에서 BHA와 유사한 강력한 free radical소거효과를 나타내었다. 계속하여 보다 상세한 항산화 효과시험을 위해 불포화지방산인 linoleic acid를 이용하여 불포화지방산의 과산화 정도를 장기보관에 따른 억제율로 항산화 활성을 측정하는 Ferric-Thiocyanate법에 의한 지질 과산화 억제 시험 결과 Fig.
- 얻어진 화합물 1과 2는 미황색 분말로 FeCl3 시험에서 녹색을, 아니스알데히드-황산 시액에서 오렌지색을 나타내어 flavan계 물질로 추정되었고, IR에서 수산기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 TLC 및 HPLC 분석에서 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin, 화합물 2는 (-)-epicatechin임을 추정할 수 있었다. 최종적으로 화합물 1의 및 13C-NMR 등의 기기 분석치를 표준품 및문헌치2"9의 spectral data와 비교 분석한 결과 화합물 1의 구조는 Fig.
- 정제하여 fraction 3으로부터 화합물 1을 fraction 4로부터 화합물 2를 얻었다. 얻어진 화합물 1과 2는 미황색 분말로 FeCl3 시험에서 녹색을, 아니스알데히드-황산 시액에서 오렌지색을 나타내어 flavan계 물질로 추정되었고, IR에서 수산기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 TLC 및 HPLC 분석에서 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin, 화합물 2는 (-)-epicatechin임을 추정할 수 있었다.
- 1에 나타낸 것과 같이 Control 군이 거의 과산화가 일어남에 비하여 합성 항산화제인 BHA를 첨가한 군은 57일 만에 과산화가 일어났으며, 토복령의 n- hexane과 H2O 분획물을 첨가한 군은 36일 이상, 토복령의 MeOH, EtOAc 및 BuOH 분획물을 첨가한 군에서는 51일 이상에서 과산화가 일어났다. 이들 중 토복령의 EtOAc 분획물은 54일 이상을 유지함으로서 천연 항산화제인 a-toco- pherol 보다는 월등히 우수하고, 합성 항산화제인 BHA와는 유사한 강력한 지질 과산화 억제 효과를 보였다. Rancimat 법에 의한 지질 산패 억제실험 결과 또한 Table II에 나타낸 것과 같이 토복령의 EtOAc 분획물이 4종의 식용유지(soybean, com, lard, palm oil)에서 a-tocopherol 보다는 우수하고 BHA 보다는 약간 우수한 지질 산패 억제 효과를 보였다.
- 이상의 항산화 실험 결과, 우수한 효과를 나타낸 EtOAc 분획물에 대하여 활성 주성분을 분리하기 위하여 소 분획하여 얻어진 5종의 소분획물에 대해서 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용을 실시한 결과, Table III에 나타낸 것과 같이 fraction 4의 소분획물은 a-tocopherol 보다는 우수하고 BHA보다 다소 미흡하나 fraction 3의 소분획물은 BHA와 동일한 우수한 효과를 나타내었다. 우수한 효과를 나타낸 fraction 3과 fraction 4 소분획 물을 재차 silica gel column Ta미e III.
- 토복령의 항산화 활성 주성분으로 단리 한 quercetin과 (-)- epicatechin에 대해서도 분획물과 같은 항산화 실험을 실시한 결과, DPPH법을 이용한 free radical 소거효과는 Table IV에 나타낸 바와 같이 a-tocopherol 보다는 우수하고 BHA 와는 거의 유사한 효과를 나타내었고, Rancimat법에 의한 지질 산패 억제 실험을 실시한 결과에서는 Table V에 나타낸 것과 같이 quercetin과 (-)-epicatechin 모두 4종의 식용유지에서 대조군인 a-tocopherol과 BHA 보다는 우수한 효과를 보였으며 특히 (-)-epicatechin은 lard oil에서 강력한 지질 산패 억제 효과를 보였다.
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