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문제 정의
- 본초서에 기재된 토복령의 효능은 독소를 제거함으로써 염증반응에 관여하고, 손상 세포를 정상세포로 회복을 유도하는 것으로 사료된다. 이에 본 연구는 토복령의 항염증 효과와 세포보호효과를 알아보기 위하여 세포독성, NO 생성 저해능, PGE2 생성 저해능, TNF-a 생성 저해능, 항산화효소 단백질의 발현, MAPK 단백질의 발현등을 시행하여 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 5% BSA(in PBS)로 45분 동안 고정 하였다. 1차 Antibody(NF-KB, RB -1638 -P1)S 1:100으로 1% BSA가 포함되어 있는 PBS에 희석한 후 2시간 동안 반응시킨 후 PBS를 이용하여 3번 세척한 후 2차 Antibody(Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti -Rabbit IgG (H+L), 111 J65203)를 1:1000으로 1% BSA가 포함되어 있는 PBS에 희석한 후 1시간 동안 37℃, 어두운 곳에서 반응시켰다. PBS릍 이용하여 3번 세척한 후 2분 동안 DAPI(10㎍/㎕ in PBS) 로 착색하였다 P8S를 이용하여 3번 세척한 후 coverglass에 Mounting medium을 떨어뜨리고 slideglass에 고정했다.
- 7 세포를 1×106 cells/well의 농도로 조정하여 6 well plate에 접종하였다. 24시간 배양 후 무혈청 배지를 이용하여 시료의 최종 농도가 20 ㎕/㎖, 50 ㎕/㎖ 100 ㎕/㎖ 이 되도록 처리한 후 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24 시간 후 배지를 회수하여 12,000rpm으로 5분 동안 워심 분리하여 상층액을 회수하여 -70℃에서 보관하였다.
- 단백질 정량은 BCA용액을 이용하여 BSA를 표준곡선으로 산출하여 측정하였다. 96-well plate에 BSA(1㎍/㎕)를 0, 1, 2, 4, 8, 16 ㎍/㎕에 BCA 용액 100 ㎖를 첨가하여 20분간 37℃에서 방치한 다음 흡광도 540 nm에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 동시에 측정할 샘플을 2 ㎖와 BCA 용액 100 ㎕을 섞은 뒤 20분간 37℃에서 방치한 후 540 nm에서 측정하여 표준곡선을 이용하여 단백질농도를 계산하였다.
- NF-kB/P65(Rel A)Ab-l는 Labvision에서 구입하였으며 2차 Antibody로 사용한 Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) 은 Jackson Lab(USA)에서 구입하여 사용하였다. ELISA reader (PerkinElmer, USA)과 멀티포톤 공초점 레이저 주사 현미경 (Multiphoton Confocal Laser Scanning Microscope system, Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)을 사용하여 실험하였다.
- LPS토 유도된 R㎖264.7세포의 NO생성 억제틀 살펴보기 위하여 NO생성을 억제하는 물질로 대표적으로 알려진 L-NMMA 를 처리하여 대조군으로 사용하였다. 토복령 추출물의 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖농도별로 처리하여 NO 생성억제를 확인 한 결과, 각각 36.
- membrane을 horseradish peroxidase으로 conjugated된 anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG로 다시 1시간동안 상온에서 hybridization하였다. Menbane얀을 PBS-Tween 20으로 4회 세척하고, chemiluminescence (DuPont, NEM)으로 반응시킨 후 Hyperfilm ECL(Amersham Bioscience, USA)으로 감광시켜 단백질을 가시화하였다.
- TNF-a 의 생성 저해능은 Immunoassay kit(eBiosciencez 88-7324, US시를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 아래와 같이 수행하였다. Raw264.
- PBS릍 이용하여 3번 세척한 후 2분 동안 DAPI(10㎍/㎕ in PBS) 로 착색하였다 P8S를 이용하여 3번 세척한 후 coverglass에 Mounting medium을 떨어뜨리고 slideglass에 고정했다. 그 후멀티포톤 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다.
- 14, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 새 튜브에 옮겨 다음 실험을 수행하였다. 단백질 정량은 BCA용액을 이용하여 BSA를 표준곡선으로 산출하여 측정하였다. 96-well plate에 BSA(1㎍/㎕)를 0, 1, 2, 4, 8, 16 ㎍/㎕에 BCA 용액 100 ㎖를 첨가하여 20분간 37℃에서 방치한 다음 흡광도 540 nm에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
- 단백질을 세포내에서 추출하기 위하여 1X107의 세포당 lysis buffer(10 mM Tris . HC1, pH7.6, 150 mM NaCl, 1% SDS) 100 ㎕로 현탁시켜 얼음 위에서 한 시간 동안 방치하여 완전히 lysis시켜 단백질을 추출하였다. 14, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 새 튜브에 옮겨 다음 실험을 수행하였다.
- 96-well plate에 BSA(1㎍/㎕)를 0, 1, 2, 4, 8, 16 ㎍/㎕에 BCA 용액 100 ㎖를 첨가하여 20분간 37℃에서 방치한 다음 흡광도 540 nm에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 동시에 측정할 샘플을 2 ㎖와 BCA 용액 100 ㎕을 섞은 뒤 20분간 37℃에서 방치한 후 540 nm에서 측정하여 표준곡선을 이용하여 단백질농도를 계산하였다. 추출한 단백질 100 ㎕를 15% SDS-polyacrylamide gel에 전기 영동하여 nitrocellulose membrane으로transfer.
- Substrate Solution을 각 well에 200㎕씩 넣어 준 후 빛이 들어오지 않는 곳에서 30분 동안 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위하여 2NHC1 용액을 각 well당 50㎕씩 넣어준 후 ELISA를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹인 MTT를 20 ㎕씩 각 well 에 넣고 4시간 배양하였다. 배양 후 MTT와 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 we11에 acid isopropanol(0.04N HC1 in iso-propanol) 100 ㎕를 첨가하여 30분간 교반히여 주고, ELISA erader를 이용히여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Raw264.
- 7 세포를 5xl05 cells/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 96well plate에 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 무혈청 배지 90 ㎕씩을 각 well에 넣고, 20, 50, 100 ㎍/㎖ 농도의 토복령 시료를 10 ㎕씩 각 well에 처리한 후 염증 반응 유도인자인 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다, 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다8).세포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포를 5xl05 cells/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 96well plate에 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 무혈청 배지 90 ㎕씩을 각 well에 넣고, 20, 50, 100 ㎍/㎖ 농도의 토복령 시료를 10㎕씩 각 well에 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 mg/㎖의 농도로 녹인 MTT를 20 ㎕씩 각 well에 넣고 4시간 배양하였다.
- 지수증식기의 HEK293세포를 5xl05 cells/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎖씩 96well plate에 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 무혈청배지 90 ㎕씩을 각 well에 넣고, 40, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 토복령 시료를 10 ㎕씩 각 well에 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹인 MTT를 20 ㎕씩 각 well 에 넣고 4시간 배양하였다.
- 24 시간 후 배지를 회수하여 12,000rpm으로 5분 동안 워심 분리하여 상층액을 회수하여 -70℃에서 보관하였다. 상온에서 측정 배지를 녹인 후 Calibrator Diluent를 사용하여 5배 희석하였고, PGE2 standarde 2500, 1250, 625, 312.5, 156, 39의 농도가 되도록 Calibrator Diluent를 이용하여 희석하였다. 희석되어진 시료와 standard를 각 wel1에 100 ㎕씩 넣고, PGE2 conjugate와 PGE2 antibody 용액을 각각 50 ㎖씩 넣어준 후 shaker위에서 2 시간 반응시킨 후 PGE2는 washing buffed 이용하여 4~5번 세척하였다.
- 세포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 L-NMMA틀 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다. 표준검량선의 작성은 sodium nitrate를 표준품으로 사용하였다.
- 토복령을 40 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 항산화효소로 활성산소와 free radical을 제거하는 Catalase 와 SOD 단백질의 발현 정도를 western-blot으로 측정하였다. 그 결과, Catalase 단백질의 경우 발현이 다소 증가함을 확인할 수 있었고, SOD의 발현의 경우 농도가 증가할수록 대조군보다 비교군이 상대적으로 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- )에서 구입하였다. NF-kB/P65(Rel A)Ab-l는 Labvision에서 구입하였으며 2차 Antibody로 사용한 Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) 은 Jackson Lab(USA)에서 구입하여 사용하였다. ELISA reader (PerkinElmer, USA)과 멀티포톤 공초점 레이저 주사 현미경 (Multiphoton Confocal Laser Scanning Microscope system, Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)을 사용하여 실험하였다.
- 또한 catalase, SODZ ERK1/2, p38, JNK는 Santa Cruz Biotechnology(CAz U.S.A.)에서 구입하였다. NF-kB/P65(Rel A)Ab-l는 Labvision에서 구입하였으며 2차 Antibody로 사용한 Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) 은 Jackson Lab(USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 세포주로는 Raw264.7 세포와 HEK 293세 포로서 한국 세포주은행과 한림대학교 TIC에서 분양받아 사용하였다. 분양 즉시, 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone, USA), penicillin(100 units/mL)(Sigma, USA), stieptomycin(100 ㎍ /mL) (Sigma, USA)이 첨가된 Dulbeca/s modified Eagle's medium(DMEMz Hyclone, USA)배지로 5% CO2 / 37℃에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 토복령은 국내에서 재배(전라북도 남원)한것을 사용하였으며, 건조된 토복령 50 g을 3000㎖의 물과 함께 추출하여 동결건조시켜 14.59 g(수득률 29.18%)을 얻었다. 실험에 앞서 실험에 필요한 농도로 조정하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약인 Bovine serum albumin(BSA), 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-Mtrazolium bromide(MTT)z Griess-reagent(modified)/ NG-Methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA), Lipopolysaccharide(LPS), RIPA Buffer, Bicinchoninic acid(BCA)는 Sigma (USA)에서 구입하였다. 또한 catalase, SODZ ERK1/2, p38, JNK는 Santa Cruz Biotechnology(CAz U.
- 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 L-NMMA틀 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다. 표준검량선의 작성은 sodium nitrate를 표준품으로 사용하였다.
데이터처리
- 실험예 사용한 통계프로그램은 SPSS 12 (SPSS Inc, USA)를 이용하였고, 통계방법은 student's T-test와 one-way ANOVA로 하였으며 pwahie가 0.05미만인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 세포보호에 관여하는 단백질 발현 유무를 확인하기 위하여 HEK93세포에 농도별로 토복령을 처리하고 western-blot을 수행하였다. 단백질을 세포내에서 추출하기 위하여 1X107의 세포당 lysis buffer(10 mM Tris .
- 토복령이 HEK293세포에 독성을 나타내는지 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 지수증식기의 HEK293세포를 5xl05 cells/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎖씩 96well plate에 접종한 후 24시간 배양하였다.
성능/효과
- Catalase와 SOD는 활성산소 소거물질인데, HEK 293 세포에 토복령 추출물을 처리 할 경우 신장세포의 대사과정에서 생성되는 프리라디칼을 약간 제거하는 것을 확인할 수 있었다.
- HEK293 신장세포에서의 세포보호효과를 알보기 위하여 토복령 추출물을 각 농도별로 40 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖㎍/㎖로 처리한 결과 대조군과 비교하여 독성을 보이지 않았다(Fig. 3).
- LPS로 유도된 Raw264.7 세포에 염증유발 전사인자인 NF-k B가 핵 내로 이동하는 것에 작용하는지 확인하기 위하여 토복령을 50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖농도로 처리하여 실험한 결과 NF-kB의 저해는 볼 수 없었다(Fig. 2).
- LPS로 유도된 Raw264.7세포의 PGE2의 생성 억제를 확인하기 위하여 토복령을 20 ㎍/㎖을 처리한 결과 값을 측정할 수 없었고, 50 ㎍/㎖, 100㎍/㎖농도에서는 각각 24.2±1, 4%, 42.1±5.3% 의 억제를 보였으나, 양성대조군인 Indometacin 투여군에 비하여 쫗은 결과는 없었다(Table 2).
- LPS로 유도된 Raw264.7세포의 TNF-q의 생성 억제를 확인하기 위하여 토복령을 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖농도로 처리하여 확인한 결과, 각각 0.1±3.3%, 2.7±0.8, 0.4±1.1%의 억제를 보였다(Table 3).
- 그 단백질 중에 ERK, p38, JNK의 발현정도를 살펴본 결과 ERK는 세포 생체반응에서 세포의 생존에 관여하는 단백질로서 토복령 추출물이 증가될 경우 약간 감소하는 경향을 보였다. p38, JNK는 세포사멸에 관여하는 단백질이며, 토복령 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 발현이 점점 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 그 결과, Catalase 단백질의 경우 발현이 다소 증가함을 확인할 수 있었고, SOD의 발현의 경우 농도가 증가할수록 대조군보다 비교군이 상대적으로 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 활성산소에 의해 세포가 손상을 받으며, 여러가지 단백질 발현에 영향을 미친다. 그 단백질 중에 ERK, p38, JNK의 발현정도를 살펴본 결과 ERK는 세포 생체반응에서 세포의 생존에 관여하는 단백질로서 토복령 추출물이 증가될 경우 약간 감소하는 경향을 보였다. p38, JNK는 세포사멸에 관여하는 단백질이며, 토복령 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 발현이 점점 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 본 실험의 경우 Raw264.7세포에 대한 토복령의 직접적인 독성은 없었다 LPS로 유도된 Raw264.7세포에서의 NO생성은 농도 의존적인 억제를 보였으며, 100 ㎍/㎖에서는 대조약물인 L-NMMA 에 비하여 높은 억제능을 보였다(Table 1). PGE2나 TNF-a의 경우 농도별로 의미있는 결과를 나타내지는 않았다(Table 2, 3).
- JNK와 p38은 활성화되고 ERK는 억제된다꺼. 본 연구의 경우 토복령 추출물의 농도가 증가되면서 p38과 JNK의 발현이 억제되는 경향을 보였다(Fig. 5).
- 천연물질을 이용한 항염증제나 세포보호 물질의 개발연구는 전세계적인 추세이다. 본초서에 기재된 토복령의 효능은 독소를 제거함으로써 염증반응에 관여하고, 손상 세포를 정상세포로 회복을 유도하는 것으로 사료된다. 이에 본 연구는 토복령의 항염증 효과와 세포보호효과를 알아보기 위하여 세포독성, NO 생성 저해능, PGE2 생성 저해능, TNF-a 생성 저해능, 항산화효소 단백질의 발현, MAPK 단백질의 발현등을 시행하여 그 결과를 보고하는 바이다.
- 이상의 결과를 보면 토복령 추출물은 세포에 독성이 미약하고, NO의 생성을 억제하며, 세포사멸 신호전달경로에 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 실험에 사용된 방법에 모두 효과적인 결과를 보여주는 것은 아니어서 추후 지속적인 연구가 필요하다고 생각한다.
- 7세포의 NO생성 억제틀 살펴보기 위하여 NO생성을 억제하는 물질로 대표적으로 알려진 L-NMMA 를 처리하여 대조군으로 사용하였다. 토복령 추출물의 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖농도별로 처리하여 NO 생성억제를 확인 한 결과, 각각 36.1±4.7%7 48.3±4.4%, 57.6±4.2%의 억제를 보였다 (Table 1).
후속연구
- 확인할 수 있었다. 그러나 실험에 사용된 방법에 모두 효과적인 결과를 보여주는 것은 아니어서 추후 지속적인 연구가 필요하다고 생각한다.
- PGE2나 TNF-a의 경우 농도별로 의미있는 결과를 나타내지는 않았다(Table 2, 3). 토복령 추출물이 염증을 유발하는 전사인자인 NF-kB의 핵내로 이동하는 것을 방어시켜주는 것인지는 확인하지 못했다.
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