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- 2)Calculated values indicate the sum of individual antioxidant effect obtained at the same addition level.
제안 방법
- 이 추출물의 TEAC value는 Rice-Evans 등(12, 13) 의방법에 따라 측정하였다. 7mM ABTS(2, 2'-azino-bis(3-ethylben-zthiazoline-6-sulfonate)에 최종 농도가 2.45 mM이 되도록 potassium persulfte를 첨가하여 ABTS radical cation(ABTS - +)을 만들었다. 이 용액을 734nm에서 흡광도가 0.
- Isoflavone, phenolic acids 및 토코페롤의 표준품과 검정콩(청자콩) 종피에서 추출한 안토시아닌 색소 추출물을 검정콩에 함유되어 있는 동일한 양으로 TEAC법으로 항산화 효과를 측정하였다(12, 13).
- Mill(Takasaki kagaku, Japan)로 분쇄한 검정콩(청자콩)과 대조군으로 노란콩(단원콩)을 10배량의 80% 메탄올로 12시간 저어주면서 2회 반복 추출한 후 여과하고 40oC에서 감압회전농축기 (Buchi Laboratoriums Technik AG, Rotavapor RE-200, Ger-many)로 감압농축한 다음 동결건조하여 80% 메탄올 추출물을 만들었다. 이 추출물의 TEAC value는 Rice-Evans 등(12, 13) 의방법에 따라 측정하였다.
- Phenolic acids 함량 측정: 검정콩 분말 0.1g을 1N NaOH1mL를 가한 후, 100oC에서 30분간 알칼리 가수분해시킨 다음 6N HCl으로 중화시킨 후 메탄올로 2mL이 되도록 정용하고, 이 상층액을 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 HPLC로 분석하였다.콩의 phenolic acids로서 benzoic, caffeic, chlorogenic, ferulic, gentisic, p-coumaric, p-OH benzoic, salicylic, syringic, transcinnamic, vanillic acid의 함량을 측정하였고, Symmetry C18 col-umn(250X4.
- Tocopherol 함량 측정: 분쇄한 검정콩 2.5 g을 250 mL 환저플라스크에 넣고 75% 에탄올 90mL을 가한 후 질소를 충전 시켜 산소를 제거시킨 다음 75oC 수욕조에서 2시간동안 환류 냉각시키면서 지용성 물질들을 가온 추출하였다. 추출액을 여과한 다음, 여액을 250mL 분획여두에 넣고 30mL 헥산으로 3회 반복 추출하여 토코페롤층을 분획하였다.
- 0분까지는 0:100으로 gradient하여 11종의 phenolic acid를 분리 정량하였다17). 검정콩 종피의 anthocyanin 함량 측정: 검정콩의 종피(0.1 g) 만을 분리한 후 1% HCl이 함유된 40% 메탄올 30 mL 첨가하여 4oC에서 24시간 담그어 색소를 추출하였다. 추출된 색소는 0.
- 검정콩의 하나인 청자콩의 항산화 효과를 노란콩 품종인 단원 콩과 비교하였을 때, 검정콩의 항산화 효과가 높게 나타났으므로 본 연구에서는 검정콩의 항산화 효과에 관여할 것으로 여겨지는 항산화 원인물질들 중 genistein과 daidzein 같은 isoflavone과 phenolic acids 및 토코페롤의 함량을 측정하였고,검정콩 종피 색소인 안토시아닌 함량을 측정하였다. 그리고 검정콩의 주요 항산화 원인물질을 구명하기 위하여 검정콩에 함유되어 있는 항산화 물질들의 함량과 동일한 양의 표준품을 이용하여 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)법으로 항산화 효과를 비교하고 이들의 시너지 효과를 측정하였다.
- phenolic acids 및 토코페롤의 함량을 측정하였고,검정콩 종피 색소인 안토시아닌 함량을 측정하였다. 그리고 검정콩의 주요 항산화 원인물질을 구명하기 위하여 검정콩에 함유되어 있는 항산화 물질들의 함량과 동일한 양의 표준품을 이용하여 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)법으로 항산화 효과를 비교하고 이들의 시너지 효과를 측정하였다.
- 02)이 되도록 조정 하고 3 mL ABTS radical cation 용액 에 30 |1L 시 료용액을 첨가하여 30oC에서 6분간 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 시료의 항산화 효과를 Trolox 농도로 비교하여 표시하였다.
- 본 실험에서는 검정콩(청자콩)의 항산화 효과를 노란 콩(단원콩)과 비교 측정하기 위해 검정콩과 노란콩을 80% 메탄올로 추출하여 이 추출물의 항산화 효과를 TEAC법으로 비교 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. Fig.
- 45 mM이 되도록 potassium persulfte를 첨가하여 ABTS radical cation(ABTS - +)을 만들었다. 이 용액을 734nm에서 흡광도가 0.70(±0.02)이 되도록 조정 하고 3 mL ABTS radical cation 용액 에 30 |1L 시 료용액을 첨가하여 30oC에서 6분간 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 시료의 항산화 효과를 Trolox 농도로 비교하여 표시하였다.
- 8mL/min로 하였다. 이동상 용매 A : B의 비율은 0분에서 100:0으로 시작하여 25.0분까지 70 : 30, 25.1 분부터 40.0분까지 40 : 60, 40.1분부터 50.0분까지는 0:100으로 gradient하여 11종의 phenolic acid를 분리 정량하였다17). 검정콩 종피의 anthocyanin 함량 측정: 검정콩의 종피(0.
- 1 g) 만을 분리한 후 1% HCl이 함유된 40% 메탄올 30 mL 첨가하여 4oC에서 24시간 담그어 색소를 추출하였다. 추출된 색소는 0.45 |im 여과지로 여과한 다음 HPLC로 분석하였다(11).
- 5 g을 250 mL 환저플라스크에 넣고 75% 에탄올 90mL을 가한 후 질소를 충전 시켜 산소를 제거시킨 다음 75oC 수욕조에서 2시간동안 환류 냉각시키면서 지용성 물질들을 가온 추출하였다. 추출액을 여과한 다음, 여액을 250mL 분획여두에 넣고 30mL 헥산으로 3회 반복 추출하여 토코페롤층을 분획하였다. 토코페롤이 포함된 헥산추출액을 질소충전시킨 후 45oC 수욕조에서 감압농축한 다음, 메 탄올 2mL에 용해 하여 0.
- 45 ㎛ 여과지로 여과하여 HPLC로 분석하였다.콩의 phenolic acids로서 benzoic, caffeic, chlorogenic, ferulic, gentisic, p-coumaric, p-OH benzoic, salicylic, syringic, transcinnamic, vanillic acid의 함량을 측정하였고, Symmetry C18 col-umn(250X4.6mm I.D., Waters, USA)을 사용하였다. 이동상은
- 007 mM Trolox equivalent로 안토시아닌, gentisic acid, p-coumaric acid, ferulic acid보다는 낮은 활성을 나타내었으며, 토코페롤에서는 y-> S-> a-> &-토코페롤 순으로 항산화 효과가 높게 나타났다. 토코페롤의 항산화 효과는 S-> y-> P-> a-토코페롤의 순서로 알려져 있으나(28), 검정콩에 함유되어 있는 토코페롤 함량비 대로 항산화 효과를 측정한 본 연구에서는 토코페롤의 함량과 비례하여 항산화 효과를 나타내었다.
- 추출액을 여과한 다음, 여액을 250mL 분획여두에 넣고 30mL 헥산으로 3회 반복 추출하여 토코페롤층을 분획하였다. 토코페롤이 포함된 헥산추출액을 질소충전시킨 후 45oC 수욕조에서 감압농축한 다음, 메 탄올 2mL에 용해 하여 0.45 ㎛ 여 과지 로 여 과한 후HPLC로 분석하였다. Columne p-Porasil(300X3.
대상 데이터
- 두 가지 용매를 사용하였는데 A용매는 1% 초산을, B용 매는 메탄올이며, 유속은 0.8mL/min로 하였다. 이동상 용매 A : B의 비율은 0분에서 100:0으로 시작하여 25.
- 본 연구에 사용한 검정콩은 청자콩(Glycine max)으로서 영남농업연구소에서 분양받아 사용하였다. 항산화 효과를 측정하기위해 사용된 isoflavone와 phenolic acids의 표준품은 Sigma사(St.
- 1에 나타내었다. 시료로 사용한 청자콩에는 genistein이 43.86 mg%, daidzein이 31.73 mg% 함유되어 있었다. Choi 등 (20)에 의하면 검정콩의 genistein 및 daidzein 함량이 각각 31.
- 분양받아 사용하였다. 항산화 효과를 측정하기위해 사용된 isoflavone와 phenolic acids의 표준품은 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였고, 토코페롤 표준품은 Merck(Germany)사의 토코페롤 동족체들을 사용하였다. 안토시아닌은 Choung 등 (11)에 의한 방법으로 분리, 정제하여 표준품으로 사용하였다.
데이터처리
- 2)a-hValues with different superscript within in a column are significant difference (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 실험결과의 통계처리는 SPSS program을 이용하여 분석하여 mean±SD로 표시하였으며, 각 군간 평균치의 통계적 유의성eone-way ANOVA로 검증한 다음 a = 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 사후 검증하였다.
이론/모형
- Anthocyanin, genistein, gentisic acid 및 y-토코페롤을 검정콩에 들어있는 함량에 동일하게 혼합하여 이들의 시너지 효과를 TEAC 법에 따라 측정하였다.
- Isoflavone 함량 측정: 분쇄한 검정콩 0.1 g을 1N HCl 1 mL 를 첨가하여 100oC 에서 150분간 산가수분해시킨 후 genistein과 daidzein의 함량을 Wang과 Kuan(14)의 방법에 따라 Symmetry C18 column(250X4.6mm I.D., Waters, USA)으로 HPLC(PU 980, Jasco, Japan)를 사용하여 분리, 정량하였다. 이때 사용 한이 동상으로는 메탄올 : 1 mM 초산암모늄(6 : 4, v/v)를 사용하였으며, 유속은 0.
- 검정콩에 함유되어 있는 주요 항산화 관련물질의 항산화 효과를 TEAC법으로 측정하여 Table 4에 나타내었다. 검정콩에 함유되어 있는 안토시아닌, isoflavone, phenolic acids 및 토코페롤들의 항산화 활성을 측정한 결과, phenolic acids 중 gentisic acid의 TEAC value가 3.
- Louis, USA)에서 구입하였고, 토코페롤 표준품은 Merck(Germany)사의 토코페롤 동족체들을 사용하였다. 안토시아닌은 Choung 등 (11)에 의한 방법으로 분리, 정제하여 표준품으로 사용하였다.
- 이 추출물의 TEAC value는 Rice-Evans 등(12, 13) 의방법에 따라 측정하였다. 7mM ABTS(2, 2'-azino-bis(3-ethylben-zthiazoline-6-sulfonate)에 최종 농도가 2.
성능/효과
- Genistein과 daidzein는 0.684+0.004, 0.673 ±0.007 mM Trolox equivalent로 안토시아닌, gentisic acid, p-coumaric acid, ferulic acid보다는 낮은 활성을 나타내었으며, 토코페롤에서는 y-> S-> a-> &-토코페롤 순으로 항산화 효과가 높게 나타났다. 토코페롤의 항산화 효과는 S-> y-> P-> a-토코페롤의 순서로 알려져 있으나(28), 검정콩에 함유되어 있는 토코페롤 함량비 대로 항산화 효과를 측정한 본 연구에서는 토코페롤의 함량과 비례하여 항산화 효과를 나타내었다.
- Tocopherol 함량: 청자콩의 토코페롤 함량을 HPLC로 분석한 결과를 Table 1에 나타내었다. HPLC 분리 패턴은 a-, p-, y-,δ-토코페롤 순으로 용출되었고 검정콩의 동족체별 함량을 측정한 결과, a-토코페롤이 1.99mg%, p-토코페롤 0.47mg%, Y-토코페롤 10.68 mg%, α-토코페롤 3.95 mg%가 함유되어 있으며 , 동족체별 함량은 Y-> 5-> a-> p-토코페롤 순이었다. Lee 등(22) 이 보고한 13종류의 콩의 토코페롤 함량은 콩 종류에 따라 함량의 차이가 많이 나타난다고 보고하였다.
- 본 실험에서는 특히 gentisic acid가 매우 높은 항산화 효과를 나타내어 콩에 존재하는 다른 phenolic acid에 비해 검정콩의 항산화 효과에 중요한 역할을 담당할 것으로 여겨진다. 검정콩에 함유되어 있는 phenolic acids 중에 benzoic acid가 가장많이 함유되어 있었지만 항산화 활성은 매우 낮게 나타났고 함량이 가장 적은 trans-cinnamic acid도 항산화 활성이 매우 낮았다 또한 hydroxyl(OH)기 2개를 가진 gentisic acid가 1개의 OH 기를 가진 p-coumaric acid보다 함량은 적었으나 항산화 활성은 높음을 알 수 있었다. 검정콩에도 상당량의 phenolic acid이함유되어 있으므로 phenolic acid의 존재 형태, 그 함량이나 이들 phenolic acid의 항산화 효과에 관한 연구가 필요할 것이다.
- 검정콩에 함유되어 있는 안토시아닌, isoflavone, phenolic acids 및 토코페롤들의 항산화 활성을 측정한 결과, phenolic acids 중 gentisic acid의 TEAC value가 3.428±0.009 mM Trolox equivalent로 가장 높았고 종피의 안토시아닌의 TEAC value도 1.516+0.006 mM Trolox equivalent로 높은 항산화 활성을 나타내었다. Phenolic acids의 항산화 효과는 gentisic >p-coumaric > ferulic> syringic > caffeic > chlorogenic > vanillic > p-OH benzoic > salicylic > benzoic acid순이었다.
- Phenolic acids 표준품의 HPLC 에서의 분리패턴은 p-OH benzoic, gentisic, chlorogenic, vanillic, caffeic, syringic, p-coumaric, ferulic, benzoic, salicylic, transcinnamic acid 순으로 용출되었다. 검정콩의 phenolic acids의 함량은 benzoic(126.70 mg%) > p-coumaric(67.68) > salicylic(59.40) > gentisic(43.19) > ferulic(16.57) > syringic(15.04) > chlorogenic (8.00)> caffeic(4.53) > vanillic(2.82) > p-OH benzoic(2.47) > transcinnamic acid(1.00)의 순으로 benzoic, p-coumaric 및 salicylic acid 함량이 비교적 많았고, vanillic, p-OH benzoic 및 transcinnamic acid의 함량이 낮았다. Pratt와 Birac(23)은 콩과 콩 제품에서 주요 항산화제로써 chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid 및 p-coumaric acid를 분리하였고 Pratt 등(24)은 caffeic acid 3.
- 10mM Trolox equivalent를 나타내었다. 농도를 달리 하여도 검정콩이 노란콩보다 항산화 효과가 높았으며 농도가 증가할수록 검정콩과 노란콩의 항산화 효과 차이가 컸다. 검정콩이 노란콩보다 높은 항산화 효과를 나타내는 것은 phenolic compound와 검정콩 종피 색소인 안토시아닌 물질이 상승 작용하여 항산화 효과를 나타내는 것으로 추정되어진다.
- 16%를 나타내었다. 또한 두 종류의 혼합물의 시너지 효과 증가율에서는 안토시아닌을 혼합하였을 때만 20% 넘는 증가율을 나타내었다. 이와 같이 안토시아닌이 혼합하였을 때가 가장 높은 시너지 효과를 나타내어 안토시아닌은 검정콩의 주요 항산화 효과의 원인물질의 역할을 할 뿐만 아니라 phenolic 물질들과 시너지효과를 통해 더욱 더 큰 항산화 효과에 기여하는 것을 알 수 있었다.
- 41 mg이 함유되어 있었다고 보고하였다. 본 실험에서 사용한 청자콩 종피에도 3개의 서로 다른 안토시아닌이 함유되어 있음을 확인할 수 있었으며 안토시아닌 색소 발현은 광, 온도, 호르몬, 영양원 등의 여러 환경요 인에 현저히 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 함량에도 차이가 나타난 것 같다.
- Kim(26)은 무수 대두유와 대두유-물 emulsion system 에서 페놀화합물의 항산화 효과를 비교한 결과 caffeic acid, chlorogenic acid, gentisic acid에 강한 항산화 효과가 있음을 보고하였으며, Lee 등(27)에 의하면 linoleic acidemulsionee caffeic acid가 chlorogenic acid보다 항산화능이 높다고 보고하였다. 본 실험에서도 chlorogenic acid가 caffeic acid 보다 함량은 많았지만 비슷한 항산화능을 나타내어 caffeic acid 가 chlorogenic acid보다 항산화 효과가 높음을 주정할 수 있었다. 본 실험에서는 특히 gentisic acid가 매우 높은 항산화 효과를 나타내어 콩에 존재하는 다른 phenolic acid에 비해 검정콩의 항산화 효과에 중요한 역할을 담당할 것으로 여겨진다.
- 또한 안토시아닌을 제외한 나머지 세 종류 화합물을 혼합하였을 때는 예상되는 시너지 효과와 실제 측정된 값의 차이가 가장 적었다. 안토시아닌과 y-토코페롤을 혼합하였을 때 시너지효과의 증가율은 35.04±0.23%로 가장 높았으며, 안토시아닌과 genistein의 증가율도 27.30±0.33%로 높았다. 측정값과 예상되는 값의 차이가 가장 많이 난 안토시아닌, gentisic acid 및 y-토코페롤을 혼합물은 22.
- 2와 같다. 이들의 시너지 효과를 살펴보기 위해 두 종류에서 네 종류 화합물을 혼합하여 TEAC법으로 측정한 결과 안토시아닌, gentisic acid 및 y-토코페롤을 혼합했을 때 측정값과 예상되는 값의 차이가 가장 많이 나타난 반면, genistein과 y-토코페롤의 차이는 거의 나타나지 않았다. 또한 안토시아닌을 제외한 나머지 세 종류 화합물을 혼합하였을 때는 예상되는 시너지 효과와 실제 측정된 값의 차이가 가장 적었다.
- 또한 두 종류의 혼합물의 시너지 효과 증가율에서는 안토시아닌을 혼합하였을 때만 20% 넘는 증가율을 나타내었다. 이와 같이 안토시아닌이 혼합하였을 때가 가장 높은 시너지 효과를 나타내어 안토시아닌은 검정콩의 주요 항산화 효과의 원인물질의 역할을 할 뿐만 아니라 phenolic 물질들과 시너지효과를 통해 더욱 더 큰 항산화 효과에 기여하는 것을 알 수 있었다.
- 33%로 높았다. 측정값과 예상되는 값의 차이가 가장 많이 난 안토시아닌, gentisic acid 및 y-토코페롤을 혼합물은 22.9±0.21%의 증가율을 나타내었으며 네 종류의 혼합물은 17.44 ±0.16%를 나타내었다. 또한 두 종류의 혼합물의 시너지 효과 증가율에서는 안토시아닌을 혼합하였을 때만 20% 넘는 증가율을 나타내었다.
후속연구
- 검정콩에 함유되어 있는 phenolic acids 중에 benzoic acid가 가장많이 함유되어 있었지만 항산화 활성은 매우 낮게 나타났고 함량이 가장 적은 trans-cinnamic acid도 항산화 활성이 매우 낮았다 또한 hydroxyl(OH)기 2개를 가진 gentisic acid가 1개의 OH 기를 가진 p-coumaric acid보다 함량은 적었으나 항산화 활성은 높음을 알 수 있었다. 검정콩에도 상당량의 phenolic acid이함유되어 있으므로 phenolic acid의 존재 형태, 그 함량이나 이들 phenolic acid의 항산화 효과에 관한 연구가 필요할 것이다.
- 본 실험에서도 chlorogenic acid가 caffeic acid 보다 함량은 많았지만 비슷한 항산화능을 나타내어 caffeic acid 가 chlorogenic acid보다 항산화 효과가 높음을 주정할 수 있었다. 본 실험에서는 특히 gentisic acid가 매우 높은 항산화 효과를 나타내어 콩에 존재하는 다른 phenolic acid에 비해 검정콩의 항산화 효과에 중요한 역할을 담당할 것으로 여겨진다. 검정콩에 함유되어 있는 phenolic acids 중에 benzoic acid가 가장많이 함유되어 있었지만 항산화 활성은 매우 낮게 나타났고 함량이 가장 적은 trans-cinnamic acid도 항산화 활성이 매우 낮았다 또한 hydroxyl(OH)기 2개를 가진 gentisic acid가 1개의 OH 기를 가진 p-coumaric acid보다 함량은 적었으나 항산화 활성은 높음을 알 수 있었다.
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