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문제 정의
- 따라서 본 연구에는 신선초의 생리활성을 규명하는 작업의 일환으로써 항산화 활성을 중심으로 항산화 지표 성분을 분리 하였고, 이러한 지표성분의 항산화 활성 및 DNA 손상 억제 여 부를 측정하였다.
제안 방법
- 5)의 조건에서 용출시켜 총 3개의 소 분획물을 얻었다. 총 3개의 분획물에 대한 항산화 활성을 측정하여 다시 가장 활성이 높은 분획에 대해 acetylation(16) 반응 을 진행시키고 이를 "-hexane : chloroform : methanol(6.5 : 3 : 1)의 용매 조건으로 용출한 후 deacetylation(16)을 진행하여 최종 두 개의 단일 화합물을 얻었다.
- DPPH radical 소거법: DPPH radical 소거활성은 에탄올에 녹여 농도별로 희석한 시료 10 ul에 200 |1M DPPH/EtOH 190 μL를 가한 후 37oC에서 30분간 반응시킨 다음 517nm에서 흡 광도를 측정하였으며, 시료 대신 에탄올을 가한 대조구에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도 감소 정도를 조사하였다(17).
- Hydrogen peroxide 소거법: 2mM H2O2를 함유한 phosphate buffer saline(pH 7.4) 600 uL에 일정농도의 시료 300 uL를 가하고 5분 후에 230nm에서 흡광도를 측정하였다(20).
- 분리 정제하였다. Silica gel column chromatography를 통하여 chloroform : acetone : methanol: water의 용매 조건을 점차적으로 변경하면서 소분획으로 나누고 항산화 활성이 가장 높은 소분획에 대해서 acetylation 반응을 실시하고 이를 ^-hexane : ethyl acetate : methanol 용매 조건으로 단일 물질로 분리 한 후 deacetylation 반응을 거쳐 최종 두 개의 단일 화합물을 획득했다. 두 개의 단일 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석을 통해서 진행 한 결과 이 두 화합물을 각각 isoquercitrin과 hyper- oside로 최종 동정하였다.
- 005%의 저농도에서도 50% 이상의 항산화활성을 나타내어 (Table 1) silica gel column chromatography 법을이용하여 ethyl acetate 분획으로부터 항산화 물질을 분리하였다.먼저 ethyl acetate 분획을 silica gel(Merck, 70-230 mesh)과 흡착 시켜 용매를 완전히 제거한 후 silica gel이 chloroform : acetone : methanol: water(5 : 3 : 2 : 0.5)의 용매 조건으로 중진된 column(5 X45 cm)에서 용줄하여 TLC(thin layer chromatography, Merck,60F254) plate 상에서 위치가 비슷한 화합물을 모아 총 6개의 분획(Fr.I-VI)을 얻었다. 6개의 분획물에 대한 항산화 활성 검증 결과 활성이 가장 높게 측정된 Fr.
- 신선초에서 항산화 활성 물질을 분리하기 위해 신선초를 80% 에탄올 추출하고 추출물에 대한 계통 분획을 실시하여 ^-hexane,chloroform, ethyl acetate, ^-butanol 및 water의 종 5가지 분획으로 나누어 항산화 활성을 측정한 결과 ethyl acetate 분획의 활성이 가장 높아 ethyl acetate 분획물로부터 항산화 활성 물질을 분리 정제하였다. Silica gel column chromatography를 통하여 chloroform : acetone : methanol: water의 용매 조건을 점차적으로 변경하면서 소분획으로 나누고 항산화 활성이 가장 높은 소분획에 대해서 acetylation 반응을 실시하고 이를 ^-hexane : ethyl acetate : methanol 용매 조건으로 단일 물질로 분리 한 후 deacetylation 반응을 거쳐 최종 두 개의 단일 화합물을 획득했다.
- 믹서로 분쇄한 시료 100 g과 에탄올의 농도별 추출 시 수율 이 비교적 높았던 80%(v/v) 에탄올 400 mL를 혼합하고, 상온 에서 이틀동안 반복추출 하였다. 이렇게 추출된 시료를 Whatman filter paper(No.2)를 이용하여 여과하고, 이 추출액을 rotary vacuum evaporator(EYELA NE1001S, Japan)로 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결건조하여 에탄올 추출물(12.7g)을 제조하였다.
- 함유한 RPMI 1640에 섞은 후 Histopaque 1077을 이용해 임파구만을 분리하였다. 인체 임파구 세포에 시료를 동결건조한 후 PBS에 용해하여 10-1,000 pg/mL사이의 농도로 cell 에 처리하여 냉장고(30분, 4oC)에서 반응시키고 반응이 끝난 임파구 세포에 oxidative stress(100 pM H2O2)를 4oC에서 5분 동안 가한 뒤 oxidative stress에 의한 DNA 손상을 유발시킨 후 comet assay 를 실시하였다 (21).
- 즉, 3개의 분획물을 각각 20 mg methan이에 녹이고 여기에 2mL의 5% KOH를 넣어 교반하면서 2시간 이상 반응 시킨 후일 정량의 DOWEX 50WX4-400 양이온 교환수지를 넣어 중화시키고 여과 감압 농축하여 항산화 활성 검증 후 최종 정제된 단일 물질인 화합물I과 화합물 II를 얻었다.
- 추출액의 분획은 용매의 극성을 이용한 계통 분획을 이용하였다. 즉, 에탄올 추출물을 농축하여 용매를 제거한 물층에 약 2배의 "-hexane을 가하여 "-hexane 분획물(1.
- 화합물의 분자 구조 해석을 위해 기기분석을 실시하였다. 1HNMR, 13C-NMR, HMQC 및 HMBC를 측정하였으며 사용 기기는 Bruker사의 Avance 500 모델을 이용하였다.
- 1). 활성 높은 분획을 silica gel(Merck, 70-230 mesh)이 chloroform : acetone : methanol: water(5 : 3 : 2 : 0.5)의 용 매 조건으로 충진된 column에서 용출시켜 총 6개의 소분획물 을 얻고, 이 중 활성이 높은 분획을 다시 chloroform: acetone : methanol: water(6 : 3 : 2 : 0.5)의 조건에서 용출시켜 총 3개의 소 분획물을 얻었다. 총 3개의 분획물에 대한 항산화 활성을 측정하여 다시 가장 활성이 높은 분획에 대해 acetylation(16) 반응 을 진행시키고 이를 "-hexane : chloroform : methanol(6.
대상 데이터
- 화합물의 분자 구조 해석을 위해 기기분석을 실시하였다. 1HNMR, 13C-NMR, HMQC 및 HMBC를 측정하였으며 사용 기기는 Bruker사의 Avance 500 모델을 이용하였다.
- 실험 재료인 신선초는 用풀무원녹즙에서 유기농 원료로 공 급 받아 사용하였고, 원료를 동결건조하여 분쇄한 후 분말을 냉동고에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- Hydroxyl radical 소거법: Hydroxyl radical 소거 활성은 Fenton reaction에 의해 OH radical을 발생시켜 이에 대한 소거활 성을 측정하였다. 2.
- 분획별 항산화 활성 중에서 가장 활성이 높은 분획을 이용하여 silica gel column chromatography법으로 단일 물질을 분리 하였다(Fig. 1). 활성 높은 분획을 silica gel(Merck, 70-230 mesh)이 chloroform : acetone : methanol: water(5 : 3 : 2 : 0.
- 신선초로부터 분리된 isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성을 DPPH radical 소거법, ABTS radical 소거법, OH radical 소거법 및 H2O2 소거법으로 측정하였다. 4가지 assay 법에서 모두 isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가되는 경향을 보였고, 특히 저농도에서 90% 이상의 radical 소거 활성을 나타내어 강력한 항산화 활성을 보였다.
성능/효과
- 소거법으로 측정하였다. 4가지 assay 법에서 모두 isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가되는 경향을 보였고, 특히 저농도에서 90% 이상의 radical 소거 활성을 나타내어 강력한 항산화 활성을 보였다.
- Isoquercitrin과 hyperoside에 대한 DNA 손상 감소 효과를 측정한 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 negative control(N)과 positive control(P)을 기준^^ isoquercitrin과 hyperosidee 농도별 산화적 손상을 입은 lymphocytes의 DNA 손상에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. Isoquercitrin과 hyperoside의 농도별 활성을 살펴보면 100 μg/mL의 농도에서 50% 이상의 DNA 손상 보호 효과가 나타남을 확인할 수 있는데, comet assay는 다른 분석 실험과 달리 수치로서 시료의 절대적인 값을 표현할 수 없고, 다만 농도 의존적으로 positive contr이에 비해 DNA 손상 보호 효과가 나타남을 표현할 수 있다.
- 두 개의 단일 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석을 통해서 진행 한 결과 이 두 화합물을 각각 isoquercitrin과 hyper- oside로 최종 동정하였다. Isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성을 DPPH radical 소거법, ABTS mdical 소거법, OH radical 소거법 및 H2O2 소거법으로 측정한 결과 4가지 assay 법에 대해서 저농도에서 고른 항산화 활성을 나타냈고, 또한 DNA 손상에 대한 보호 효과를 측정한 결과 isoquercitrin과 hyperoside모두 손상된 DNA에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 isoquercitrin과 hyperoside는 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능과 같은 기본적인 항산화 활성과 더불어 DNA 손상에 직접적인 영향을 미치는 OH radical과 HQ?에 대해서 높은 항산화 활성을 나타내면서 동시에 DNA 손상에 대한 보호 효과를 나타냄으로써 다양한 경로의 항산화 메커니즘에 작용한다는 사실을 유추해 볼 수 있으며 산업적으로 유용한 소재로서의 연구가 가능할 것으로 판단된다.
- 5에서 보는 바와 같이 negative control(N)과 positive control(P)을 기준^^ isoquercitrin과 hyperosidee 농도별 산화적 손상을 입은 lymphocytes의 DNA 손상에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. Isoquercitrin과 hyperoside의 농도별 활성을 살펴보면 100 μg/mL의 농도에서 50% 이상의 DNA 손상 보호 효과가 나타남을 확인할 수 있는데, comet assay는 다른 분석 실험과 달리 수치로서 시료의 절대적인 값을 표현할 수 없고, 다만 농도 의존적으로 positive contr이에 비해 DNA 손상 보호 효과가 나타남을 표현할 수 있다.
- Isoquercitrin의 항산화 활성 (Fig. 3)에서 DPPH radical 소거법은 5 μg/mL 농도에서 약 60% 정도의 높은 항산화 활성을 나타냈고, 또한 ABTS radical 소거법 에서도 3 μg/mL 저농도에서 약 55% 정도의 높은 항산화 활성을 나타냈다. 그리고 OH radical 소거법과 H2O2 소거법에서도 각각 25 μg/mL과 10 μg/ mL의 농도에서 50% 이상의 항산화 활성을 나타냈다.
- Silica gel column chromatography를 통하여 chloroform : acetone : methanol: water의 용매 조건을 점차적으로 변경하면서 소분획으로 나누고 항산화 활성이 가장 높은 소분획에 대해서 acetylation 반응을 실시하고 이를 ^-hexane : ethyl acetate : methanol 용매 조건으로 단일 물질로 분리 한 후 deacetylation 반응을 거쳐 최종 두 개의 단일 화합물을 획득했다. 두 개의 단일 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석을 통해서 진행 한 결과 이 두 화합물을 각각 isoquercitrin과 hyper- oside로 최종 동정하였다. Isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성을 DPPH radical 소거법, ABTS mdical 소거법, OH radical 소거법 및 H2O2 소거법으로 측정한 결과 4가지 assay 법에 대해서 저농도에서 고른 항산화 활성을 나타냈고, 또한 DNA 손상에 대한 보호 효과를 측정한 결과 isoquercitrin과 hyperoside모두 손상된 DNA에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 5에서 glucose에 의한 탄소 피크를 관찰할 수 있었고, NaOH, AlCl3, NaOAc 및 NaOAc/H3BO3 shift reagent 첨가시 UV 스펙트럼이 band I, Ⅱ의 bathochromic shift하는 것으로 보아 flavonoid 골격의 C-5, C-7, C-3' 및 C-4'에 free 상태의 OH가 존재하는 화합물임을 알 수 있었다. 이상의 데이터와 문헌자료(22)의 비교를 통해서 화합물 I은 C21H20O12의 분자식을 가지며 분자량 464.4인 isoquercit rin(quercetin-3-O-g-D-glucose)임을 최종 확인하였, 다(Fig. 2).
- 추출물에 대한 분획별 항산화 활성을 측정한 결과 ethyl acetate 분획이 시료 농도 0.01%에서 95% 이상의 높은 항산화 활성을 나타내고 0.005%의 저농도에서도 50% 이상의 항산화활성을 나타내어 (Table 1) silica gel column chromatography 법을이용하여 ethyl acetate 분획으로부터 항산화 물질을 분리하였다.먼저 ethyl acetate 분획을 silica gel(Merck, 70-230 mesh)과 흡착 시켜 용매를 완전히 제거한 후 silica gel이 chloroform : acetone : methanol: water(5 : 3 : 2 : 0.
- 화합물 II 역시 황색 분말상으로 UV 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼이 화합물 [과 매우 유사하였고, 차이점은 1H-NMR 스펙트럼에서 당의 55.34(J= 8.0Hz, d)에서의 anomeric proton과 13C-NMR 스펙트럼의 5102.9, 76.0, 73.8, 72.1, 68.7 및 61.2으로 당부분이 galatose로 치환됨을 추정할 수 있었다 이상의 데이터와 문헌자료(23)의 비교를 통해서 화합물 Ⅱ는 C21H20O12의분자식을 가지며 분자량 464.4인 hyperoside(quercetin-3-O-&-D- galactose)임을 최종 확인하였다(Fig. 2).
- 화합물 I은 황색 분말상으로 1H-NMR 스펙트럼에서S5.22(J = 7.5Hz, d)에서의 anomeric proton과 13C-NMR 스펙트럼에서 5103.1, 77.4, 76.8, 74.5, 70.3 및 61.5에서 glucose에 의한 탄소 피크를 관찰할 수 있었고, NaOH, AlCl3, NaOAc 및 NaOAc/H3BO3 shift reagent 첨가시 UV 스펙트럼이 band I, Ⅱ의 bathochromic shift하는 것으로 보아 flavonoid 골격의 C-5, C-7, C-3' 및 C-4'에 free 상태의 OH가 존재하는 화합물임을 알 수 있었다. 이상의 데이터와 문헌자료(22)의 비교를 통해서 화합물 I은 C21H20O12의 분자식을 가지며 분자량 464.
후속연구
- Isoquercitrine 일반적으로 천연물에 존재하는 flavonoids의 일종으로 여러 식물에서 분리되고 있지만 본 실험에서 사용된 재료인 신선초에서 isoquercitrin의 분리에 대한 보고는 현재 거의 알려져 있지 않은 상태이므로 생리활성에 관한 보충 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 상태이다. 따라서 본 연구를 계기로 하여 항산화와 관련된 생리활성에 관한 심도있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 한가지 assay법에 의존하지 않고 DPPH radical 소거법과 ABTS radical 소거법과 같은 기초적인 활성 측정과 함께 DNA 손상과 같은 체내 분자레벨에서의 산화적 손상과 밀접한 관련이 있는 OH radical과 H2O2 소거 활성이 높다는 것은 앞으로 isoquercitrin을 비롯한 유사 flavonoids에 대한 심층 연구를 통해서 이러한 소재를 산업적으로 유용하게 적용할 수 있는 가능성을 시사한다고 볼 수 있다.
- Isoquercitrin과 hyperoside에 대한 항산화 활성을 DPPH radical 소거법, ABTS mdical 소거법, OH radical 소거법 및 H2O2 소거법으로 측정한 결과 4가지 assay 법에 대해서 저농도에서 고른 항산화 활성을 나타냈고, 또한 DNA 손상에 대한 보호 효과를 측정한 결과 isoquercitrin과 hyperoside모두 손상된 DNA에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 isoquercitrin과 hyperoside는 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능과 같은 기본적인 항산화 활성과 더불어 DNA 손상에 직접적인 영향을 미치는 OH radical과 HQ?에 대해서 높은 항산화 활성을 나타내면서 동시에 DNA 손상에 대한 보호 효과를 나타냄으로써 다양한 경로의 항산화 메커니즘에 작용한다는 사실을 유추해 볼 수 있으며 산업적으로 유용한 소재로서의 연구가 가능할 것으로 판단된다.
- 이후 위의 실험에서 DNA 손상에 대한 보호 효과가 확인된isoquercitrin과 hyperoside 이외에 유사한 구조를 가지고 있는 flavonoids 의 활성을 서로 비교하여 구조의 차이에 따른 활성의 변화를 측정하여 구조와 활성간의 상관성을 조사하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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