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문제 정의
- 차나무 종자에 관한 국내 연구는 종자의 일반성분, 종실유의 이화학적 특성과 지방산 조 성에 관한 것과, 세포 노화를 방지(9), 7종의 필수 아미노산을 비롯한 17종의 아미노산의 존재가 영양원 뿐만 아니라 의약용 으로도 이용될 수 있음을 보여주고 있다(10). 따라서 본 연구는 차나무 열매를 종자와 과피로 분리하여 70% 에탄올과 물 을 이용하여 추출물을 조제하고, 그 추출물의 항균활성과 항종 양활성에 대하여 알아보았다.
- 본 연구는 폐기되는 차나무 열매를 이용하여 항균활성과 항 종양활성을 비교하고 이용가능성에 대하여 탐색하고자 하였다. 항균활성과 항종양활성을 알아보기 위하여 70% 에탄올과 물 추출물의 활성을 측정하였다.
가설 설정
- 3)No inhibitory zone was formed.
제안 방법
- 본 연구는 폐기되는 차나무 열매를 이용하여 항균활성과 항 종양활성을 비교하고 이용가능성에 대하여 탐색하고자 하였다. 항균활성과 항종양활성을 알아보기 위하여 70% 에탄올과 물 추출물의 활성을 측정하였다. 항균활성은 식중독균과 몇 종의 병원균, 효모, 곰팡이 등 17균주에 대하여 측정하였고, 항종양 활성은 6종류의 인체 암세포주, 1종류의 정상세포주에 대하여 조사하였다.
- 항균활성과 항종양활성을 알아보기 위하여 70% 에탄올과 물 추출물의 활성을 측정하였다. 항균활성은 식중독균과 몇 종의 병원균, 효모, 곰팡이 등 17균주에 대하여 측정하였고, 항종양 활성은 6종류의 인체 암세포주, 1종류의 정상세포주에 대하여 조사하였다. 차나무 잎, 종자와 과피의 항균활성을 비교한 결과는 종자의 70% 에탄올과 물 추출물에서 효모에 대하여 항 균활성이 높게 나타났다.
- 종자, 과피의 건조분말 10 g에 10배량의 70% 에탄올과 증류 수를 가하여 실온에서 6시간씩 3회 추출하고 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 여과하였다. 각각의 여과액을 합하여 원심분리 한 후 상등액만을 취해 rotary evaporator로 감압농축하여 용매를 완전히 제거시킨 후 동결건조하여 각 추출물의 수율을 계산하였다.
- 2 여과지를 사용하여 여과하였다. 각각의 여과액을 합하여 원심분리 한 후 상등액만을 취해 rotary evaporator로 감압농축하여 용매를 완전히 제거시킨 후 동결건조하여 각 추출물의 수율을 계산하였다. 차잎의 경우도 위와 같은 방법으로 추출하여 제조 하였다.
- 배지는 균주의 특성에 맞게 조 제하여 121oC에서 15분간 가압멸균하여 사용하였다. 모든 시험 은 3반복으로 수행하였다.
- , Rockville, ML, USA)의 배지를 이용하여 배양하였다. SK-MES-1, SW-156, Farrow, SK-OV-3 및 HEC-1B 세포주는 RPMI 1640, HEP-2 세포주는 MEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, heat inactivated)을 함유한 배지를 사용하여 37oC에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 지시 균에 대한 in vitro 항균활성 측정은 paper disc method(11)를 이용하였다. 즉, 멸균된 배지를 petri dish에 15mL씩 분주하여 응 고시키고, broth에서 세균은 37oC에서 24시간, 효모, 곰팡이는 27oC에서 48시간 전배양한 각종 시험균액을 무균적으로 첨가 하여 잘 혼합한 중층용 배지를 5mL씩 기층용 배지 위에 분주 하여 2중의 평판배지를 만들었다. 각 추출물을 멸균된 paper disc에 50 uL씩 흡수시 킨 후, 배지에 올려놓고 난 다음, 세균은 37oC, 효모는 30oC, 곰팡이는 27oC의 incubator에서 24-48시간 배양하여 disc 주변의 inhibition zone(mm)을 측정하였다.
- 즉, 멸균된 배지를 petri dish에 15mL씩 분주하여 응 고시키고, broth에서 세균은 37oC에서 24시간, 효모, 곰팡이는 27oC에서 48시간 전배양한 각종 시험균액을 무균적으로 첨가 하여 잘 혼합한 중층용 배지를 5mL씩 기층용 배지 위에 분주 하여 2중의 평판배지를 만들었다. 각 추출물을 멸균된 paper disc에 50 uL씩 흡수시 킨 후, 배지에 올려놓고 난 다음, 세균은 37oC, 효모는 30oC, 곰팡이는 27oC의 incubator에서 24-48시간 배양하여 disc 주변의 inhibition zone(mm)을 측정하였다.
- 항균활성이 비교적 뛰어난 종자의 물추출물의 열안정성을 조 사하기 위하여 50mg/mL의 농도로 증류수에 녹여 제균한 후 80oC, 100oC에서 각각 30분 동안 수욕상에서 열처리한 시료와 121oC에서 15분간 autoclave한 시료를 냉각시킨 후 8mm paper disc에 50 μL씩 흡수 및 건조시킨 후 높은 항균활성을 나타낸 Candida albicans, Cryptococcus netformans를 검정균으로 사*용하여 paper disc method를 이용하여 inhibition zone(mm)을 즉정 하였다(12).
- 5 mg/mL) 시 약 50 uL씩 각각 첨가한 후 37oC에서 4시간 추가 배양하여 formazan 형성을 유도시켰 고, 이것을 용해시키기 위하여 dimethyl sufxide(DMSO)를 각 well당 100 μL씩 첨가한 후 plate shaker에서 20분간 교반하였다. Multi well scanning spectrophotometer(microplate autoreader, Bio-Tek instrument, USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 항종양활성은 세포성장 저해율로 평가하였다.
- Multi well scanning spectrophotometer(microplate autoreader, Bio-Tek instrument, USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 항종양활성은 세포성장 저해율로 평가하였다. 저해율 이 50% 이상 일 때를 항종양활성이 있는 것으로 판정하였다.
- 차나무 종자와 과피 중 효모에 대한 비교적 높은 항균활성을 보인 종자 물 추출물의 열안정성을 조사하기 위하여 80oC, 100oC에서 30분, 121oC에서 15분간 열처리한 후 Candida albicans, Cryptococcus neoformans에 대한 inhibition zone을 측정한 결과를 Table 4에 나타내었다. 저지원의 크기가 121oC에서 15 분간 열처리한 경우, 11-12mm 범위로, 항균활성의 잔존률은 78-85%의 분포를 나타내어 항균활성을 유지하는 경향을 나타내었다.
- 종자를 물로 추출하여 100 μg/mL 농도로 종양세 포에 대한 증식억제효과를 측정하였다(Fig. 3). 이 농도에서 볼 때 물 추 출물의 항종양활성은 피부암세포 Farrow에서 67.
- 종자 물 추출물의 각 농도에 대한 종양세포 증식억제효과 측 정의 표적 종양세포주는 억제 효과가 좋은 난소암 세포인 SK- OV-3로 하였고, 독성 측정은 정상세포주인 NIH/3T3 세포를 이용하여 검색하였다(Fig. 4). 그 결과는 10-50μg/mL농도에서도 정 상세포주인 NIH/3T3 세포에서 는 증식 억제 효과가 나타나지 않았다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 시료는 2003년 10월에 한국제다 회사(전 남 장성군)에서 35년생인 차나무(Camellia sinensis L.)의 열매 와 잎을 분양 받아 사용하였다. 열매는 종자와 과피로 분리하여 잘게 분쇄한 후 동결건조시켰다.
- 본 실험에 사용된 균주는 그람 양성균 4종, 그람 음성균 5종, 효모 3종, 곰팡이 5종을 사용하였고 균주의 종류와 배지 및 배 양조건은 Table 1에 나타내었다. 배지는 균주의 특성에 맞게 조 제하여 121oC에서 15분간 가압멸균하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용할 종양세포주는 SK-MES-1 (human lung carcinoma), SW-156(human kidney carcinoma), Farrow(human melanoma carcinoma), HEP-2(human larynx carcinoma), SK- OV-3(human ovary carcinoma) 및 HEC-1B(human endometerial adenocarcinoma)를 사용하였으며, Gibco사(Lfe Technologies, INC., Rockville, ML, USA)의 배지를 이용하여 배양하였다. SK-MES-1, SW-156, Farrow, SK-OV-3 및 HEC-1B 세포주는 RPMI 1640, HEP-2 세포주는 MEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, heat inactivated)을 함유한 배지를 사용하여 37oC에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- 45 um membrane filter로 제균하여 시 료로 사용하였다. 지시 균에 대한 in vitro 항균활성 측정은 paper disc method(11)를 이용하였다. 즉, 멸균된 배지를 petri dish에 15mL씩 분주하여 응 고시키고, broth에서 세균은 37oC에서 24시간, 효모, 곰팡이는 27oC에서 48시간 전배양한 각종 시험균액을 무균적으로 첨가 하여 잘 혼합한 중층용 배지를 5mL씩 기층용 배지 위에 분주 하여 2중의 평판배지를 만들었다.
- 차나무 종자와 과피 추출물에 대한 항종양활성을 알아보기위하여 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하였다(14). 즉 각각 종양세포주 2X105 cells/mL를 100 μL씩 96 well plate에 접종하여 37oC, CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 적절한 농도의 시료를 100 μL 접종하여 48시간 동안 노출시 켰다.
- 종자 물 주줄물을 80, 100oC에서 30분, 121oC에서 15분간 열처리 후 항균활성을 검 색한 결과, 가열온도에 따른 차이는 크게 나타나지 않았다. 항 종양 활성을 검색하기 위하여 MTT assay를 통해 활성을 측정하였다. 과피 추출물에서 전혀 활성이 없었지만 종자 추출물에 서는 큰 활성을 나타내었다.
성능/효과
- 항균활성은 식중독균과 몇 종의 병원균, 효모, 곰팡이 등 17균주에 대하여 측정하였고, 항종양 활성은 6종류의 인체 암세포주, 1종류의 정상세포주에 대하여 조사하였다. 차나무 잎, 종자와 과피의 항균활성을 비교한 결과는 종자의 70% 에탄올과 물 추출물에서 효모에 대하여 항 균활성이 높게 나타났다. 특히, Candida albicans, Cryptococcus neqformanS斗 대하여 항균활성을 보였다.
- 과피 추출물에서 전혀 활성이 없었지만 종자 추출물에 서는 큰 활성을 나타내었다. 극성용매인 70% 에탄올과 물 추 출물의 종양세포 증식억제효과가 높게 나타났으며 그중에서 물 추출물이 70% 에탄올 추출물 보다 높게 항종양 활성이 나타났다. 차나무 종자로부터 추출한 활성물질의 종양세포와 정상세포에 대한 세포독성을 MTT assay로 비교한 결과 50 μg/mL 의 농도에서 난소암 세포인 SK-OV-3는 70%의 억제율을 나타낸 반면 정상세포에서는 10% 미만으로 나타나 정상세포보다 종양세포에 대하여 보다 큰 선택 독성을 나타내는 것으로 보인다.
- 용매에 따른 종자와 과피의 추출물의 수율은 Table 2와 같다. 추출물의 수율을 비교한 결과 종자의 경우는 70% 에탄올 추출물이 15.9%, 물 추출물이 30.6%의 수율을 보였다. 과피의 경우는 70% 에탄올 추출물이 12.
- 종자와 과피의 항균활성 결과는 잎과 비교하여 Table 3과 같이 나타내었다. 용매에 따른 항균활성은 70% 에탄올 추출물이 물 추출물 보다 생육억제효과가 우수하게 나타났고 농도에 따른 활성도 50mg/mL에서 100mg/mL로 높아짐에 따라 생육억 제효과는 높아졌다. 잎 추출물은 세균에 대해서 Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Enterococcus hirae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, 곰팡이인 Penicillium nalgiovens에서 항균활성을 보였고 그 중에 70% 에탄올 추출물 의 100mg/mL 농도에서 Staphylococcus aureus균에 대하여 22mm의 inhibition zone을 나타내었다.
- 용매에 따른 항균활성은 70% 에탄올 추출물이 물 추출물 보다 생육억제효과가 우수하게 나타났고 농도에 따른 활성도 50mg/mL에서 100mg/mL로 높아짐에 따라 생육억 제효과는 높아졌다. 잎 추출물은 세균에 대해서 Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Enterococcus hirae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, 곰팡이인 Penicillium nalgiovens에서 항균활성을 보였고 그 중에 70% 에탄올 추출물 의 100mg/mL 농도에서 Staphylococcus aureus균에 대하여 22mm의 inhibition zone을 나타내었다. 종자 주줄물은 그람양성균 인 Micrococcus luteus, Enterococcus hirae, 그람음성균인 Salmonella typhimurium, 곰팡이인 Alternaria alternata, Rhizoctonia solan/에서 억제효과가 나타났으며 특히 효모인 Candida albicans, Cryptococcus neofo-mans에 대해서도 효과가 나타났다.
- 잎 추출물은 세균에 대해서 Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Enterococcus hirae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, 곰팡이인 Penicillium nalgiovens에서 항균활성을 보였고 그 중에 70% 에탄올 추출물 의 100mg/mL 농도에서 Staphylococcus aureus균에 대하여 22mm의 inhibition zone을 나타내었다. 종자 주줄물은 그람양성균 인 Micrococcus luteus, Enterococcus hirae, 그람음성균인 Salmonella typhimurium, 곰팡이인 Alternaria alternata, Rhizoctonia solan/에서 억제효과가 나타났으며 특히 효모인 Candida albicans, Cryptococcus neofo-mans에 대해서도 효과가 나타났다. 주줄용 매 조건에 따른 차이는 나타나지 않았다.
- 과피 추출물은 Enterococcus hirae 이외에는 실험에 사용한 어느 균주에서도 항균활 성이 나타나지 않았다. 향균활성 스펙트럼 상에서 잎 추출물과 종자 추출물의 경우 균류에 따른 억제효과의 차이가 나타났다. 즉, 잎 추출물의 경우는 주로 세균류에 대해 항균활성을 보였 고, 종자 추출물에서는 효모와 곰팡이의 일부 균속에 대해서 항균활성이 나타났다.
- 향균활성 스펙트럼 상에서 잎 추출물과 종자 추출물의 경우 균류에 따른 억제효과의 차이가 나타났다. 즉, 잎 추출물의 경우는 주로 세균류에 대해 항균활성을 보였 고, 종자 추출물에서는 효모와 곰팡이의 일부 균속에 대해서 항균활성이 나타났다. 이러한 균류에 따른 항균활성 차이는 잎 과 종자의 항균 활성물질이 서로 다른 것이라 사료된다.
- 저지원의 크기가 121oC에서 15 분간 열처리한 경우, 11-12mm 범위로, 항균활성의 잔존률은 78-85%의 분포를 나타내어 항균활성을 유지하는 경향을 나타내었다. 가열 온도가 증가함에 따라 저지원의 크기가 다소 감소하는 경향을 나타내었지만 항균활성이 잔존해 열에 비교적 안정한 것으로 판단되었다.
- 그 중에서도 자궁 암세포인 HEC-1B 세포에서 가장 낮은 증식억제율을 나타내었다. 70% 에탄올 추출물에서는 종양세포주마다 약간의 차이는 있으나 약 30-40% 정도의 증식억제율이 나타났고, 물 추출물 에서는 동일 농도에서 약 10% 정도의 억제효과가 나타나 과 피의 경우는 70% 에탄올로 추출 시에 종양세포 증식물질이 추 출되는 것으로 보인다.
- 종자의 추출용매 조건에 따른 종양세포 증식 저해로는 과피 추출물보다 동일 농도에서 우수한 효과가 나타났다. 종자 추출 물 역시 과피와 마찬가지로 70% 에탄올 및 물과 같은 극성 용 매에서의 추출 시 종양세포에 대한 증식억제효과는 종자가 과 피보다도 동일 농도 대비 우수한 억제효과를 나타내었다.
- 종자 추출 물 역시 과피와 마찬가지로 70% 에탄올 및 물과 같은 극성 용 매에서의 추출 시 종양세포에 대한 증식억제효과는 종자가 과 피보다도 동일 농도 대비 우수한 억제효과를 나타내었다. 즉 종자 추출물은 자궁암 세포인 HEC-1B 종양세포주만 제외하고는 모든 종양세포주에서 약 90% 이상의 증식억제효과가 나타났다. 종자의 경우는 물 추출 시에도 그 활성이 상당히 유지되 었으며, 용매가 극성일수록 증식억제 활성물질이 잘 추출되는 것으로 사료된다.
- 3). 이 농도에서 볼 때 물 추 출물의 항종양활성은 피부암세포 Farrow에서 67.1%, 후두암세 포인 HEP-2에서 92.4%오+ 난소암세포인 SK-OV-3에서 97.1%로 나타났고 70% 에탄올로 추출한 물질은 물 추출물보다 항종양 활성이 다소 떨어졌다.
- 본 연구자들은 항균 및 항암활성을 나타낸 차나무의 물 추 출물로부터 사포닌이 들어 있음을 확인하였다(결과 미제시). 따라서 단정할 수는 없으나 차나무 종자의 물 추출물의 항균 및 항암활성 성분은 사포닌류인 것으로 추정할 수 있겠으며, 이에 대한 종자의 물 추출물의 추가적 정제 및 동정과 함께 항종양 활성에 대한 활성기전에 관한 규명이 필요하리라 생각된다.
- 차나무 잎, 종자와 과피의 항균활성을 비교한 결과는 종자의 70% 에탄올과 물 추출물에서 효모에 대하여 항 균활성이 높게 나타났다. 특히, Candida albicans, Cryptococcus neqformanS斗 대하여 항균활성을 보였다. 종자 물 주줄물을 80, 100oC에서 30분, 121oC에서 15분간 열처리 후 항균활성을 검 색한 결과, 가열온도에 따른 차이는 크게 나타나지 않았다.
- 특히, Candida albicans, Cryptococcus neqformanS斗 대하여 항균활성을 보였다. 종자 물 주줄물을 80, 100oC에서 30분, 121oC에서 15분간 열처리 후 항균활성을 검 색한 결과, 가열온도에 따른 차이는 크게 나타나지 않았다. 항 종양 활성을 검색하기 위하여 MTT assay를 통해 활성을 측정하였다.
- 극성용매인 70% 에탄올과 물 추 출물의 종양세포 증식억제효과가 높게 나타났으며 그중에서 물 추출물이 70% 에탄올 추출물 보다 높게 항종양 활성이 나타났다. 차나무 종자로부터 추출한 활성물질의 종양세포와 정상세포에 대한 세포독성을 MTT assay로 비교한 결과 50 μg/mL 의 농도에서 난소암 세포인 SK-OV-3는 70%의 억제율을 나타낸 반면 정상세포에서는 10% 미만으로 나타나 정상세포보다 종양세포에 대하여 보다 큰 선택 독성을 나타내는 것으로 보인다.
후속연구
- 본 연구자들은 항균 및 항암활성을 나타낸 차나무의 물 추 출물로부터 사포닌이 들어 있음을 확인하였다(결과 미제시). 따라서 단정할 수는 없으나 차나무 종자의 물 추출물의 항균 및 항암활성 성분은 사포닌류인 것으로 추정할 수 있겠으며, 이에 대한 종자의 물 추출물의 추가적 정제 및 동정과 함께 항종양 활성에 대한 활성기전에 관한 규명이 필요하리라 생각된다.
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