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문제 정의
- 본 연구에서는 제주에서 자생하는 감귤류의 하나이며 중요한 한약 소재인 진귤의 과피(진고]) 성분이 어떤 생리활성을 가지고 있는지를 분석하고자 하였다. 또한 생산 시기에 따른 원료공급기간의 한계, 보존 및 가공의 어려움을 극복하고 안정적인 가공식품으로 개발하기 위한 방법의 하나로 진피 추출물을 식품미생물로 발효시키는 과정이 진피가 가진 원래의 생리활성에 어떠한 변화를 가져오는지를 탐색하였다.
- 또한 종양세포에 대한 세포사멸 유발효과는 자유유리기소거 활성과 함께 커진다는 견해도 논의된 바 있다(8). 본 실험에서도 우수한 항산화 활성를 가진 것으로 확인된 진피발효 추출물 이 세포사멸 유발 효과를 가지고 있는지를 조사하였다. CHO IR 세포는 영양결핍성 배지에서의 배양으로 세포사멸이 유발되며 인슐린 처리에 따른 인슐린 수용체의 활성화는 영양결핍성 세포 사멸을 억제한다 (18).
- 감귤류flavonoids의 항산화 작용은 주로 DPPH 소거능 즉정과 같은 화학적 분석 방법과 malondialdehyde를 측정하는 TBARS법들에 의해 주로 측정되고 있으나 세포 수준에 서 직접 항산화 작용을 하는지에 대한 연구결과들은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 배양 중인 HepG2 세포에 강력한활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 일종인 과산화수소 (hydrogen peroxide)를 처리하고 동시에 진피추출물을 더하여 세 포내 ROS의 함량이 실제로 변화하는 지를 조사하였다. 배양중 인 HepG2 세포를 혈청을 제거한 배양액에 3시간 동안 전배양 하고 난 뒤 진귤과피추출물을 30분 동안 전처리하고 이어 10 mM의 고]산화수소(hydrogen peroxide, HQJ와 활성산소 종 형광 표지자인 H2DCFDA(10mM)< 더하였다.
- 본 연구에서는 제주에서 자생하는 감귤류의 하나이며 중요한 한약 소재인 진귤의 과피(진고]) 성분이 어떤 생리활성을 가지고 있는지를 분석하고자 하였다. 또한 생산 시기에 따른 원료공급기간의 한계, 보존 및 가공의 어려움을 극복하고 안정적인 가공식품으로 개발하기 위한 방법의 하나로 진피 추출물을 식품미생물로 발효시키는 과정이 진피가 가진 원래의 생리활성에 어떠한 변화를 가져오는지를 탐색하였다.
- ex Tanaka)의 과피는 전통적으로 매우 중요한 한약재 성분으로 사용되어 왔으나 그 약리학적 효과에 대해서는 과학적인 분석이 되어 있지 못하다. 본 연구에서는 진귤과 피추출물과 과피발효 추출물의 1차 항산화 활성을 검색하여 발효 후 추출물이 더욱 효과적인 활성을 가지고 있는 사실을 발견하였고 이를 바탕으로 대식세포인 Raw264.7 세포에서 산화질소의 생성, 염증 유발 단백질(NOS2, Cox-2)의 수준을 억제할 뿐 아니라 동세포의 생존능을 개선시키는 결과를 얻었다. 그러나 상피세포 유래 세포주인 CHO-IR 세포 및 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포의 생존능은 반대로 발효 후 추출물에 의해 억제되는 것으로 나타났다.
제안 방법
- ROS의 측정을 위해서 세포막투과성 ROS 탐색자(probe)인 2', 7'- dichlorofluorescin diacetate(H, DCFDA)를 사용하여 세포질 내 ROS의 생성과 축적을 측정하였다 (10). 배양이 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 10mM의 H^DCFDA를 함유한 PBS에서 37℃, 10분간 배양한 후 multiwell 형광측정기(Tecan, Austria)를 이용하여 485nm/535nm의 파장에서 형광의 강도를 측정하였다.
- 4). Raw264.7세포를 혈청제거 배양액에 3시간 동안 전배양 후 진피발효 추출 물(FSE)를 30분간 전처리하였으며 LPS를 각각 15분 또는 24시간 동안 처리하였다. LPS 처리로 Raw264.
- 1% (w/v) Tween-20, TBS-T)으로 상온에서 1시간동안 반응시키고 난 뒤 여러 가지 1차 항체 (1 : 1000-1 : 3000)가 들어있는 TBS-T에서 1시간(250 또는 16시간(400 동안 반응시켰다. TBS-T로 3회 세척하고 HRP- conjugated 2차 항체와 상온에서 30분 반응시킨 뒤 Enhanced Chemiluminescence(ECL) 방법으로 각 band의 영상을 얻었다.
- 7). 다음으로는 Raw264.7 세포에서 LPS 유도성 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다. LPS와 함께 각 분획 추 출물을 24시간 처리하였을 때 DPPH 소거 활성과는 반대로 클 로로포름, 헥산분획에서의 NO 생성 억제 효과가 높았고 부탄 올 분획의 경우 NO 생성 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았다.
- 1). 또한 DPPH 소거능 측정법으로 발효 과정 전후의 진피 추출 물의 항산화 활성을 비교하였다 (Fig. 2).유효소거능을 50% 억제농도로 비교하였을 경우 발효 과정을 거친 진피 추출물의 활성이 발효 전에 비하여 뚜렷하게 증가함을 알 수 있었다.
- ROS의 측정을 위해서 세포막투과성 ROS 탐색자(probe)인 2', 7'- dichlorofluorescin diacetate(H, DCFDA)를 사용하여 세포질 내 ROS의 생성과 축적을 측정하였다 (10). 배양이 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 10mM의 H^DCFDA를 함유한 PBS에서 37℃, 10분간 배양한 후 multiwell 형광측정기(Tecan, Austria)를 이용하여 485nm/535nm의 파장에서 형광의 강도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 배양 중인 HepG2 세포에 강력한활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 일종인 과산화수소 (hydrogen peroxide)를 처리하고 동시에 진피추출물을 더하여 세 포내 ROS의 함량이 실제로 변화하는 지를 조사하였다. 배양중 인 HepG2 세포를 혈청을 제거한 배양액에 3시간 동안 전배양 하고 난 뒤 진귤과피추출물을 30분 동안 전처리하고 이어 10 mM의 고]산화수소(hydrogen peroxide, HQJ와 활성산소 종 형광 표지자인 H2DCFDA(10mM)< 더하였다. 15분 후에 H2DCFDA가 ROS의졸적으로 가수분해되면서 발생하는 형광의 광도로 진귤과피의 항산화 활성을 조사한 결과 기저수준의 ROS뿐 아니라 과산화수소의 첨가로 증가된 세포 내 ROS의 함량은 진귤과 피추출물의 병행처리에 의해 농도의존적으로 감소하였다 (Fig.
- 제주지역에서 2002년 2월부터 2003년 1월까지 친환경 재배법 으로 재배된 진귤을 구입하여 사용하였다. 벗겨낸 진피를 충분히 건조시킨 후 분쇄하여 얻은 분말시료(100 g)를 80% 에탄올 1〔로 설 온에서 7일간 추출한 후 Whatmann GF/C filter로 여과하여 상 등액을 얻은 후 회전농축기로 에탄올을 제거하고 남은 수층 시료를 진 공 동결 건조하여 추출 시료를 얻고 밀봉하여 냉동 보관하였다.
- 앞의 결과에서 진피발효 추출물의 항산화, 항염증, 세포증식억제 효과가 보여졌으나 추출물의 어떤 구성성분이 이러한 역할을 담당하는지를 알기 위해서는 단계별 분획, 순수정제 과정 을 거친 성분들의 활성을 세밀하게 분석하여야 한다. 본 실험에서도 진피발효 추출물을 부탄올, 헥산, 클로로 포름, 에틸아세테이트의 분획 추출물을 얻어 각각의 활성을 조사하였다. DPPH 소거 활성의 경우 에틸아세테이트 분획에서 가장 우수한 소거능이 관찰되었으며 그 뒤로 부탄올, 클로로 포름, 헥산 분획의순이었다 (Fig.
- 세포에 대한 비특이적(nonspecific) 상해의 지표가 되는 LDH활성도를 측정하여 시료가 배양세포에 독성을 나타내는지를 조사하였다. 시료처리가 끝난 세포배양액과 LDH assay reagent(Takara, Japan)를 각각 0.
- 세포의 생존, 또는 세포 사멸 여부를 조사하는 또 다른 방법으로 세포 내 DNA특이적인 형광색소인 H33342를 최종 농도가 1 Mg/mL이 되도록 배양 중인 세포에 투여하고 37℃에서 30분간 배양 후 CoolSNAP-Pro color digital camera(Media Cybernetics, Houston, TX, USA)가 장착된 형광현미경 아래에서 관찰하였다(10). 세포핵의 응축 정도와 apoptotic body의 형성 여부를 관찰하여 세포의 생존 또는 세포 사멸의 지표로 삼았다
- 세포의 생존, 또는 세포 사멸 여부를 조사하는 또 다른 방법으로 세포 내 DNA특이적인 형광색소인 H33342를 최종 농도가 1 Mg/mL이 되도록 배양 중인 세포에 투여하고 37℃에서 30분간 배양 후 CoolSNAP-Pro color digital camera(Media Cybernetics, Houston, TX, USA)가 장착된 형광현미경 아래에서 관찰하였다(10). 세포핵의 응축 정도와 apoptotic body의 형성 여부를 관찰하여 세포의 생존 또는 세포 사멸의 지표로 삼았다
- 1 mL씩 섞어 10분간 상온에서 반응시킨 뒤 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이때 기저흡광도는 배양에 사용하지 않은 배양액으로부터 측정하였고 각 실험군의 흡광도로부터 기저흡광도를 제한 값을 실제 LDH 활성도로 계산하였다.
- 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 NOS2 단백질은 발효 과 정 전후의 진피 추출물 처리로 농도의존적인 감소 현상을 보였고 특히, 염증 반응을 직접 유발하는 효소 단백질인 Cox-2 단백질의 증가는 진피발효 추출물의 처리로 더욱 뚜렷하게 감소하였다. 이러한 결과는 발효 과정을 거친 진피 추출물이 강력한 항염증효과를 유발할 것이라는 일차적인 증거가 되는데 이러한 결과를 보다 분명히 증명하기 위하여 동일 실험 모델에서 염증 유발 반응의 초기 현상인 IkB-a 단백질의 인산화와, 세포배양액 내 NO의 함량이 변화하는지를 측정하였다 (Fig. 4). Raw264.
대상 데이터
- 7세포 및 Chinese hamster overy(CHO) 세포들을 한국 세포주은행(서 울)로부터 공여받아 사용하였다. HepG2 및Raw264.7 세포는 100 U/mL penicillin, 100 |ig/mL streptomycin, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum)이 포함된 Dulbecco's Min imal Essential Medium(D-Mem) 액을, CHO 세포는 Ham's F-12 배양액을 사용하였으며 5% CO2 및 37"C가 유지되는 배양기에서 배양되었다. 세포는 T75 배양용기에서 배양된 후 우태아혈청이 제거된 serum-free 배양액에서 일정시간 동안 전배양 (serum-starvation)하고 난 뒤 시료의 처리 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 간암 세포주인 HepG2, 대식세포주의 하나인Raw264.7세포 및 Chinese hamster overy(CHO) 세포들을 한국 세포주은행(서 울)로부터 공여받아 사용하였다. HepG2 및Raw264.
- 발효분말의 용매주출(butanol, hexane, chloroform, ethylacetat아은 Yoo오卜 H\vang(8)의 방법에 따라 수행하였다.실 험에 사용된 시약은 별도로 표시된 것 외에는 모두 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 제주지역에서 2002년 2월부터 2003년 1월까지 친환경 재배법 으로 재배된 진귤을 구입하여 사용하였다. 벗겨낸 진피를 충분히 건조시킨 후 분쇄하여 얻은 분말시료(100 g)를 80% 에탄올 1〔로 설 온에서 7일간 추출한 후 Whatmann GF/C filter로 여과하여 상 등액을 얻은 후 회전농축기로 에탄올을 제거하고 남은 수층 시료를 진 공 동결 건조하여 추출 시료를 얻고 밀봉하여 냉동 보관하였다.
이론/모형
- 배 양이 완료된 발효액은 급속냉동 후 동결건조하고 건식분쇄기로 분말화하였다. 발효분말의 용매주출(butanol, hexane, chloroform, ethylacetat아은 Yoo오卜 H\vang(8)의 방법에 따라 수행하였다.실 험에 사용된 시약은 별도로 표시된 것 외에는 모두 Sigma사 (St.
- 세포독성 또는 세포의 생존능은 mitochondria의 활성을 측정하기 위하여 MTT 측정법을 사용하였다 (12). 시료의 처리가 끝난 뒤 세포배양액과 동량의 MTT reagent(l mg/mL in D-Mem) 를 섞어 37℃ 에서 30분 동안 더 배양한 후 상층액을 제거하고 200 nL isopropanol을 넣어 발색 반응을 유도하였으며 흡광도는 570-690 nm에서 측정하였다.
- 제주지역의 오랜 민간요법으로 진피는 호흡기계의 감염이나 이로부터 수반되는 염증반응을 완화하는 데 효과가 있는 것으로 구전되어오고 있다. 이러한 사실에 근거한 약리학적 활성을 규명하기 위해 진피 추출물이 염증 작용의 체내 매개체인 nitricxide synthase-2(NOS2) 및 cyclooxygenase-2(Cox-2)의 단백질 함량을 변화시키는지를 이들 단백질에 대한 immunoblotting 방법으로 조사하였다 (Fig. 3).대식세포주인 Raw264.
성능/효과
- 배양중 인 HepG2 세포를 혈청을 제거한 배양액에 3시간 동안 전배양 하고 난 뒤 진귤과피추출물을 30분 동안 전처리하고 이어 10 mM의 고]산화수소(hydrogen peroxide, HQJ와 활성산소 종 형광 표지자인 H2DCFDA(10mM)< 더하였다. 15분 후에 H2DCFDA가 ROS의졸적으로 가수분해되면서 발생하는 형광의 광도로 진귤과피의 항산화 활성을 조사한 결과 기저수준의 ROS뿐 아니라 과산화수소의 첨가로 증가된 세포 내 ROS의 함량은 진귤과 피추출물의 병행처리에 의해 농도의존적으로 감소하였다 (Fig.1). 또한 DPPH 소거능 측정법으로 발효 과정 전후의 진피 추출 물의 항산화 활성을 비교하였다 (Fig.
- 두 실험 결과로부터, DPPH 소거 활성과 NO 생성 억제 활성이 모두 강하게 나타나는 분획은 에틸아세테이트 분획이었다. LPS 를 48시간 처리하여 세포 사멸을 유발하였을 때에도 세포 사멸 을 억제하는 효과는 역시 에틸아세테이트 분획에서 보여졌으며 (Fig. 9A), 헥산, 클로로 포름 분획의 경우 높은 비특이적 세포독성 (LDH 활성)이 관찰되었다 (Fig. 9B).이상의 결과들을 종합하여 보면 진피발효 추출물 분획들 중, Raw264.
- 7 세포에서 LPS 유도성 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다. LPS와 함께 각 분획 추 출물을 24시간 처리하였을 때 DPPH 소거 활성과는 반대로 클 로로포름, 헥산분획에서의 NO 생성 억제 효과가 높았고 부탄 올 분획의 경우 NO 생성 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 두 실험 결과로부터, DPPH 소거 활성과 NO 생성 억제 활성이 모두 강하게 나타나는 분획은 에틸아세테이트 분획이었다.
- SE, FSE)를 30분간 전처리 후 bacteria 의 endotoxin?! lipopolysaccharideLPS)를 처리하고 24시간 동안 계속 배양하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 NOS2 단백질은 발효 과 정 전후의 진피 추출물 처리로 농도의존적인 감소 현상을 보였고 특히, 염증 반응을 직접 유발하는 효소 단백질인 Cox-2 단백질의 증가는 진피발효 추출물의 처리로 더욱 뚜렷하게 감소하였다. 이러한 결과는 발효 과정을 거친 진피 추출물이 강력한 항염증효과를 유발할 것이라는 일차적인 증거가 되는데 이러한 결과를 보다 분명히 증명하기 위하여 동일 실험 모델에서 염증 유발 반응의 초기 현상인 IkB-a 단백질의 인산화와, 세포배양액 내 NO의 함량이 변화하는지를 측정하였다 (Fig.
- 7 세포에서의 항산화, 항염 활성, 세포생존능 강화 활성들은 주로 에틸아세테이트 분획의 성분에서 비롯된 것임을 추측할 수 있다. 그러나 CHO-1R 세포의 증식억제 실험에서, 부탄올 분획은 혈청제거 배양액에 24시간 동안 배양했을 때 나타나는 세포 사멸 현상을 강하게 억제하는 것으로 나타났으며, 나머지 분획에서는 모두 세 포증식을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 10). 따라서, 세포의 증식을 억제하는 항종양 성분은 부탄올 분획을 제외한 전 분 획에 모두 포함되어 있으며 구체적으로 어느 성분이 세포 증식 을 억제할 것인지는 각 분획으로부터 보다 정교한 분리 정제 를 거친 성분연구가 수행되어 야 규명될 수 있을 것으로 사료 되었다.
- 5). 그러나 LPS 와 함께 진피발효 추출물을 48시간 동안 병행 처리할 경우 PARP의 가수분해가 억제되었으며 세포생존 능도 증가하였다. 이러한 결과들을 종합하면 진피발효 추출물은 대식세포의 LPS 유발 염증 활성을 강력하게 억제하는 효능을 가지고 있으며 또한 대식세포가 LPS 독성을 극복하여 세포 사멸 현상을 회피하도록 하는 세포생존 능도 증가시키는 것으로 판단된다.
- 7 세포에서 산화질소의 생성, 염증 유발 단백질(NOS2, Cox-2)의 수준을 억제할 뿐 아니라 동세포의 생존능을 개선시키는 결과를 얻었다. 그러나 상피세포 유래 세포주인 CHO-IR 세포 및 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포의 생존능은 반대로 발효 후 추출물에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 진피의 발효 후 추출물이 대식세포의 항염증활성을 증가시키는 반면, 종양 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 다양한 약리 효과를 가지고 있음을 의미한다.
- LPS와 함께 각 분획 추 출물을 24시간 처리하였을 때 DPPH 소거 활성과는 반대로 클 로로포름, 헥산분획에서의 NO 생성 억제 효과가 높았고 부탄 올 분획의 경우 NO 생성 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 두 실험 결과로부터, DPPH 소거 활성과 NO 생성 억제 활성이 모두 강하게 나타나는 분획은 에틸아세테이트 분획이었다. LPS 를 48시간 처리하여 세포 사멸을 유발하였을 때에도 세포 사멸 을 억제하는 효과는 역시 에틸아세테이트 분획에서 보여졌으며 (Fig.
- 7 세포는 LPS의 독성을 극복하지 못하고 세포사멸 과정을 일으키는 것으로 알려져 있다 (16). 본 실험에서도 LPS를 48시간 동안 처리하면 Raw264.7 세포에서 세포 사멸의 대표적 지표 중 하나인 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 가수 분해 가 나타나며 MTT 측정 결과에서도 세포생존 능이 감소하였다 (Fig. 5). 그러나 LPS 와 함께 진피발효 추출물을 48시간 동안 병행 처리할 경우 PARP의 가수분해가 억제되었으며 세포생존 능도 증가하였다.
- 2).유효소거능을 50% 억제농도로 비교하였을 경우 발효 과정을 거친 진피 추출물의 활성이 발효 전에 비하여 뚜렷하게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 진피 성분이 세포 수준에서 직접 생화학적인 항산화 과정을 거쳐 산화스트레스를 극복하며 특히 발효 과정 후에 이러한 생리적 기능이 더욱 증강되었음을 의미하는 것이다.
- 그러나 상피세포 유래 세포주인 CHO-IR 세포 및 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포의 생존능은 반대로 발효 후 추출물에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 진피의 발효 후 추출물이 대식세포의 항염증활성을 증가시키는 반면, 종양 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 다양한 약리 효과를 가지고 있음을 의미한다.
- 그러나 LPS 와 함께 진피발효 추출물을 48시간 동안 병행 처리할 경우 PARP의 가수분해가 억제되었으며 세포생존 능도 증가하였다. 이러한 결과들을 종합하면 진피발효 추출물은 대식세포의 LPS 유발 염증 활성을 강력하게 억제하는 효능을 가지고 있으며 또한 대식세포가 LPS 독성을 극복하여 세포 사멸 현상을 회피하도록 하는 세포생존 능도 증가시키는 것으로 판단된다.
- 7 세포내 IkB-a 단백질의 인산화(15분 처리군)가 증가하고 배양액 내 NO의 농도 및 NOS2, Cox-2 단백질 수준이 급격히 증가(24시간 처리군)하였는데 발효를 거친 진피 추출물을 처리하면 이러한 증가들이 농도의존적으로 감소하였다. 이러한 실험조건에서 진피발효추 출물의 처리는 비특이적 세포독성의 지표인 LDH 활성을 증가시키지 않았으며 세포의 정상적인 영양대사를 보여주는 포도당이용 활성에도 변화를 일으키지 않았다 (결과 표시하지 않음). 그러나 LPS를 장기간 (2일 이상) 처리하면 Raw264.
- 9B).이상의 결과들을 종합하여 보면 진피발효 추출물 분획들 중, Raw264.7 세포에서의 항산화, 항염 활성, 세포생존능 강화 활성들은 주로 에틸아세테이트 분획의 성분에서 비롯된 것임을 추측할 수 있다. 그러나 CHO-1R 세포의 증식억제 실험에서, 부탄올 분획은 혈청제거 배양액에 24시간 동안 배양했을 때 나타나는 세포 사멸 현상을 강하게 억제하는 것으로 나타났으며, 나머지 분획에서는 모두 세 포증식을 억제하는 것으로 나타났다(Fig.
- CHO IR 세포는 영양결핍성 배지에서의 배양으로 세포사멸이 유발되며 인슐린 처리에 따른 인슐린 수용체의 활성화는 영양결핍성 세포 사멸을 억제한다 (18).진피 발효추출물을 영양결핍 배지에서 배양 중인 CHO-IR 세포에 24시간 동안 단독 처리 하였을 때 고 농도(Img/mL) 처리군에서 영양결핍성 세포 사멸 현상이 가속되었으며 인슐린의 세포 사멸 억제 효과도 저해되었다(Fig. 6).이 러한 세포 사멸 유발효괴는 사람의 간암세포주인 HepG2 세포 에서도 유사하게 나타났다(결과 표시하지 않음).
후속연구
- 10). 따라서, 세포의 증식을 억제하는 항종양 성분은 부탄올 분획을 제외한 전 분 획에 모두 포함되어 있으며 구체적으로 어느 성분이 세포 증식 을 억제할 것인지는 각 분획으로부터 보다 정교한 분리 정제 를 거친 성분연구가 수행되어 야 규명될 수 있을 것으로 사료 되었다.
- 그러나 이러한 세포사멸 유발효과는 고농도의 처리군에서만 보여지며 저농도의 진피발효 추출물 처리군에서는 분명하지 않았다. 아직, 동일 실험 조건에서 항산화 활성의 정도와 종양 세포 증식억제 효과 사이의 자세한 기전은 알려지고 있지 않으며 여러 다양한 실험조건에서 검증되어야 할 것으로 사료된다.
- 앞의 결과에서 진피발효 추출물의 항산화, 항염증, 세포증식억제 효과가 보여졌으나 추출물의 어떤 구성성분이 이러한 역할을 담당하는지를 알기 위해서는 단계별 분획, 순수정제 과정 을 거친 성분들의 활성을 세밀하게 분석하여야 한다. 본 실험에서도 진피발효 추출물을 부탄올, 헥산, 클로로 포름, 에틸아세테이트의 분획 추출물을 얻어 각각의 활성을 조사하였다.
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