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문제 정의
- 본 실험은 대두 추출물과 홍삼 농축액 분말 혼합물인 APB03(AmorePacific Beauty-03)의 경구반복두여에 대한 피부주름개 선효과를 평가하기 위하여 hairless mouse에서 경구 반복투여 및 UV 반복조사를 통한 효능평가시험을 실시하였다.
- 위와 같은 대두 추출물의 항산화 활성과 홍삼 성분의 피부 구성 세포 보호 효과에 대한 연구 결과로 미루어 이들 물질의 복합물이 피부 보호에 상당한 효과가 있을 것으로 예상하여, 이들 복합 물질 섭취에 대한 피부 보호 효과를 과학적으로 연 구하고자 하였다. 자외선에 의한 피부 조직의 변화뿐만 아니라 전신적인 변화를 관찰하기 위하여 hairless mouse를 동물 모델 로 하여(6-11), 자외선을 조사하여 인위적으로 광노화를 유발시 키면서, 이와 동시에 홍삼 엑기스를 농축하여 분말화한 원료와 대두에서 추출하여 얻은 대두 추출 분말을 혼합한 원료(APB03)를 경구 투여 하면서 자외선으로 인한 피부 주름 생성을 억 제하는 정도를 평가하여 피부 주름 생성 예방 효과를 평가하였다
가설 설정
- 1)Means with the different letter within a column are significantly different at p < 0.05.
제안 방법
- UV 조사: 정상군을 제외한 실험군에 매주 주 3회 동일한 시 간(15:00-16: 30)에 UV를 조사하였다. UV 조사를 위해 태양 광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 램프(UB800, Waldmann Lichttechnik GmbH, Villingen-Schwenningen, Gemiany) [0개를 부착하여 사용하였다.
- 최근 이러한 물질들을 경구 섭취하였을 때, 피부 노화를 예방하는 과학적 작용 기작을 밝히는 연구들이 활발히 수행되고 있다. 기존 연구에서 우리나라에서 전통적으로 섭취해 온 식품 유래 소재 중 피부에 대한 광보호 효능을 갖고 있는 물질들에 대한 스크리닝을 실시하였다. 피부의 광손상에 대한 주요 기작인 반응성 산소종 생성과 피부 구성 성분인 콜라겐 파괴에 대한 보호 효과를 평가하였다.
- 체중 측정은 시험에 사용된 모든 동물 에 대하여 시험 시작 전, 시험기간 중 주 1회 실시하였다. 사 육 상자별로 당일 사료와 음수의 급여총량과 익일 잔량을 매 주 1회 측정하였다.
- 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 을 시험에 사용하였다. 사육 환경은 온도 23±3℃, 습도 50± 5%, 소음 60 db 이하, 취기 20 ppm 이하, 조도 150-300 Lux, 명 암주기 12시 간(07 : 00-19: 0이조명시 간)으로 유지 하였다. 시험 기간 중 동물은 polycarbonate cage(26X42X 18cm, Myungjin Instruments Co.
- 정상군(Control group)과 UV 대조군(UV control group), UV/ APB-03 저용량군(UV/APB-O3(X1) group), UV/APB-03 중간용 량군(UV/APB-03(X5) group)과 UV/APB-03 고용량군(UV/APB03(X10) group)을 두고, 경구로 주 5회 반복 두여하며, 광노화 를 유발하기 위하여 주 3회 UV를 조사가 병행되었다. 시험 기 간 중 임상증상, 체중변화 및 사료 음수 섭취량 등을 관찰하 고, 2회의 피부주형을 채취하여 영상 분석을 실시하였으며 실험 종료 후 피부조직을 채취하여 병리조직학적 검사를 실시하였다.
- 시험물질의 투여: 실험동물은 Table 1에 제시된 바와 같이 정상군(control), UV 대조군(UV control), UV/AP 대두홍삼혼합 분말 저농도군(UV/APB-03(Xl)), UV/AP 대두홍삼혼합분말 중 간농도군(UV/APB-03(X5)), UV/AP 대두홍삼혼합분말 고농도군 (UV/APB-03(X10)) 등 5개 군으로 나누어 실험하였다. 정상군 과 UV 대조군은 체중 kg 당 10mL/kg의 생리식염수를 존대를 이용해 경구 투여하였고, AP 대두홍삼혼합분말 투여군은 고형분 기준으로 각각 체중 kg 당 13.
- 이번 실험에서 APB-03의 세 농도에서 그 피부 주름 생성 예 방 효과를 관찰하였다. 섭취 8주째에서 중간 농도(5X)를 제외한 군에서 예방 효능을 관찰하지 못하여 농도 의존성을 확인 하지 못했으며 또한 12주차에서 모든 군에서 효능이 관찰되었 지만 농도 의존성을 관찰할 수 없었다.
- 임상 중상 관찰 및 체중, 사료 및 음수량 측정: 적응 기간 및 시험 물질 처리 기간 동안 1일 1회 임상 증상의 변화 및 사망여부를 관찰하였다. 체중 측정은 시험에 사용된 모든 동물 에 대하여 시험 시작 전, 시험기간 중 주 1회 실시하였다.
- 위와 같은 대두 추출물의 항산화 활성과 홍삼 성분의 피부 구성 세포 보호 효과에 대한 연구 결과로 미루어 이들 물질의 복합물이 피부 보호에 상당한 효과가 있을 것으로 예상하여, 이들 복합 물질 섭취에 대한 피부 보호 효과를 과학적으로 연 구하고자 하였다. 자외선에 의한 피부 조직의 변화뿐만 아니라 전신적인 변화를 관찰하기 위하여 hairless mouse를 동물 모델 로 하여(6-11), 자외선을 조사하여 인위적으로 광노화를 유발시 키면서, 이와 동시에 홍삼 엑기스를 농축하여 분말화한 원료와 대두에서 추출하여 얻은 대두 추출 분말을 혼합한 원료(APB03)를 경구 투여 하면서 자외선으로 인한 피부 주름 생성을 억 제하는 정도를 평가하여 피부 주름 생성 예방 효과를 평가하였다
- 6-7 주령된 20-25 g 정도의 SPF(specific pathogen free) 암컷 hairless mouse(Skh:HR-a)를 Charles River Laboratories(WiImington, USA)로부터 구입하여 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시켰다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 을 시험에 사용하였다. 사육 환경은 온도 23±3℃, 습도 50± 5%, 소음 60 db 이하, 취기 20 ppm 이하, 조도 150-300 Lux, 명 암주기 12시 간(07 : 00-19: 0이조명시 간)으로 유지 하였다.
- 시험물질의 투여: 실험동물은 Table 1에 제시된 바와 같이 정상군(control), UV 대조군(UV control), UV/AP 대두홍삼혼합 분말 저농도군(UV/APB-03(Xl)), UV/AP 대두홍삼혼합분말 중 간농도군(UV/APB-03(X5)), UV/AP 대두홍삼혼합분말 고농도군 (UV/APB-03(X10)) 등 5개 군으로 나누어 실험하였다. 정상군 과 UV 대조군은 체중 kg 당 10mL/kg의 생리식염수를 존대를 이용해 경구 투여하였고, AP 대두홍삼혼합분말 투여군은 고형분 기준으로 각각 체중 kg 당 13.28 mg(UV/APB-03(Xl)), 66.40 mg (UV/APB-03(X5)), 132.8mg(UV/APB-03(X10))의 시료를 IOmL 식염수에 녹여 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 반복 투 여하였다. 투여기간은 총 12주로 주 5일 동일한 시간(14:00- 15:00)에 투여 하였다.
- 정상군(Control group)과 UV 대조군(UV control group), UV/ APB-03 저용량군(UV/APB-O3(X1) group), UV/APB-03 중간용 량군(UV/APB-03(X5) group)과 UV/APB-03 고용량군(UV/APB03(X10) group)을 두고, 경구로 주 5회 반복 두여하며, 광노화 를 유발하기 위하여 주 3회 UV를 조사가 병행되었다. 시험 기 간 중 임상증상, 체중변화 및 사료 음수 섭취량 등을 관찰하 고, 2회의 피부주형을 채취하여 영상 분석을 실시하였으며 실험 종료 후 피부조직을 채취하여 병리조직학적 검사를 실시하였다.
- 조직병리학적 관찰: 조직 준비를 위해 동물을 희생시킨 후 등쪽 피부를 떼어내어(IX 1cm), filter paper에 편평하게 부착한 후 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4 |im 절편을 잘라 H&E(Hematoxylin & Eosin) stain을 실시하였다.
- 피부의 육안 관찰 및 피부주형의 분석: 주름 예방 효과의 판 정을 위해 군당 8마리씩 8주 및 12주에 hairless mouse의 등쪽 을 디지털카메라(Model C-700, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용 해 근접 촬영하고, 실리콘폴리머 (SILFLO impression material, Flexico, Potters Bar, England)를 이용하여 피부주형 (replica)을 채 취하였다. 채취한 피부주형은 빛의 입사각을 20도로 고정한 후, 주름 그림자 명암 영상을 CCD 카메라(Model SDC-45, Samsung, Seoul, Korea)로 찍어 이미지 파일화를 하고 컴퓨터 영상 분석 시스템 인 Skin Visiometer SV600 software(Courage + Khazaka, Koln, Germany)를 이용하여 R1-R5의 값을 측정하였다. R1-R5 측정법은 다음과 같다.
- UV 조사를 위해 태양 광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 램프(UB800, Waldmann Lichttechnik GmbH, Villingen-Schwenningen, Gemiany) [0개를 부착하여 사용하였다. 첫째 주 및 둘째 주는 1 MED(minimal erythemal dose, 약 55-60 mJ/crrU를, 셋째 주는 2 MED, 넷째 주는 3 MED, 다섯째 주 이후에는 4 MED를 조사하여 실험기 간 중 총 UV 조사량이 109 MED가 되도록 하였다. 이때 UV 조사량은 Waldmann UV meter(Waldmann Lichttechnik GmbH, Villingen-Schwenningen, Germany)를 이용하여 확인하였다.
- 임상 중상 관찰 및 체중, 사료 및 음수량 측정: 적응 기간 및 시험 물질 처리 기간 동안 1일 1회 임상 증상의 변화 및 사망여부를 관찰하였다. 체중 측정은 시험에 사용된 모든 동물 에 대하여 시험 시작 전, 시험기간 중 주 1회 실시하였다. 사 육 상자별로 당일 사료와 음수의 급여총량과 익일 잔량을 매 주 1회 측정하였다.
- 8mg(UV/APB-03(X10))의 시료를 IOmL 식염수에 녹여 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 반복 투 여하였다. 투여기간은 총 12주로 주 5일 동일한 시간(14:00- 15:00)에 투여 하였다.
- 기존 연구에서 우리나라에서 전통적으로 섭취해 온 식품 유래 소재 중 피부에 대한 광보호 효능을 갖고 있는 물질들에 대한 스크리닝을 실시하였다. 피부의 광손상에 대한 주요 기작인 반응성 산소종 생성과 피부 구성 성분인 콜라겐 파괴에 대한 보호 효과를 평가하였다. 피부에 효능을 갖는 소재를 스크리닝 하기 위하여 자체적으로 섬유아 세포주를 이용하여 DPPH assay, collagenase 발현 억제, Type I pN procollagen 생성 실험을 한 결과 여러가지 소재 중 대두 추출물과 홍삼 추출물의 항산화 능은 뛰어나지 못했지만 collagenase 발현 억제, Type 1 pN procollagen 생성능이 무처리 대조군에 비해 개선 효과를 보임 을 확인할 수 있었다.
- 피부의 육안 관찰 및 피부주형의 분석: 주름 예방 효과의 판 정을 위해 군당 8마리씩 8주 및 12주에 hairless mouse의 등쪽 을 디지털카메라(Model C-700, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용 해 근접 촬영하고, 실리콘폴리머 (SILFLO impression material, Flexico, Potters Bar, England)를 이용하여 피부주형 (replica)을 채 취하였다. 채취한 피부주형은 빛의 입사각을 20도로 고정한 후, 주름 그림자 명암 영상을 CCD 카메라(Model SDC-45, Samsung, Seoul, Korea)로 찍어 이미지 파일화를 하고 컴퓨터 영상 분석 시스템 인 Skin Visiometer SV600 software(Courage + Khazaka, Koln, Germany)를 이용하여 R1-R5의 값을 측정하였다.
대상 데이터
- 6-7 주령된 20-25 g 정도의 SPF(specific pathogen free) 암컷 hairless mouse(Skh:HR-a)를 Charles River Laboratories(WiImington, USA)로부터 구입하여 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시켰다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 을 시험에 사용하였다.
- UV 조사: 정상군을 제외한 실험군에 매주 주 3회 동일한 시 간(15:00-16: 30)에 UV를 조사하였다. UV 조사를 위해 태양 광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 램프(UB800, Waldmann Lichttechnik GmbH, Villingen-Schwenningen, Gemiany) [0개를 부착하여 사용하였다. 첫째 주 및 둘째 주는 1 MED(minimal erythemal dose, 약 55-60 mJ/crrU를, 셋째 주는 2 MED, 넷째 주는 3 MED, 다섯째 주 이후에는 4 MED를 조사하여 실험기 간 중 총 UV 조사량이 109 MED가 되도록 하였다.
- 피부에 효능을 갖는 소재를 스크리닝 하기 위하여 자체적으로 섬유아 세포주를 이용하여 DPPH assay, collagenase 발현 억제, Type I pN procollagen 생성 실험을 한 결과 여러가지 소재 중 대두 추출물과 홍삼 추출물의 항산화 능은 뛰어나지 못했지만 collagenase 발현 억제, Type 1 pN procollagen 생성능이 무처리 대조군에 비해 개선 효과를 보임 을 확인할 수 있었다. 세포를 이용한 시험관 시험 결과 대두 추출물과 홍삼 추출물을 후보 소재로 선정하였다.
- 시료: 실험에 사용한 APB-03은 대두홍삼혼합분말로 홍삼 농 축액 분말과 대두 추출 분말을 세포 시험 결과 얻어낸 최적 중 량비인 5:8의 비율로 배합한 물질이다. 홍삼 농축액 분말은 4 년근 이상의 홍삼에서 3-5회 반복 추출하여 추출액을 얻은 후 감압 농축한 후 분무 건조하여 분말화한 후, 조사포닌 함량이 105 mg/g 이상이 되도록 제조한 것을 (주)바이웰(Seoul, Korea) 에서 구입하여 사용하였다.
- 사육 환경은 온도 23±3℃, 습도 50± 5%, 소음 60 db 이하, 취기 20 ppm 이하, 조도 150-300 Lux, 명 암주기 12시 간(07 : 00-19: 0이조명시 간)으로 유지 하였다. 시험 기간 중 동물은 polycarbonate cage(26X42X 18cm, Myungjin Instruments Co., Seoul, Korea)에 cage 당 8마리씩 사육하였으며, 사료는 마우스 전용사료(SCF, Incheon, Korea)를 자유 급이 하였으며, 음수는 자외선 소독한 상수도수를 자유 급이 하였다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측 정하고, 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였으며 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다.
- 이 원료는 (주)뉴트렉스(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 음성 대조 군으로 saline(Choongwae Pharma Co., Seoul, Korea)을 사용하였다.
- 대두추출분말은 대두를 열수 추출 하여 분리 과정을 거친 후, 여과하고, 에탄올을 용매로 하여 정 저】, 농축 과정을 거쳐 스프레이 드라이로 건조시켜 분말화한 것으로 전체 이소플라본 함량이 10% 이상이며 다이드제인, 제 니스테인, 글리시테인의 비가 약 4: 1 :5가 되는 원료이다. 이 원료는 (주)뉴트렉스(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 음성 대조 군으로 saline(Choongwae Pharma Co.
- 시료: 실험에 사용한 APB-03은 대두홍삼혼합분말로 홍삼 농 축액 분말과 대두 추출 분말을 세포 시험 결과 얻어낸 최적 중 량비인 5:8의 비율로 배합한 물질이다. 홍삼 농축액 분말은 4 년근 이상의 홍삼에서 3-5회 반복 추출하여 추출액을 얻은 후 감압 농축한 후 분무 건조하여 분말화한 후, 조사포닌 함량이 105 mg/g 이상이 되도록 제조한 것을 (주)바이웰(Seoul, Korea) 에서 구입하여 사용하였다. 대두추출분말은 대두를 열수 추출 하여 분리 과정을 거친 후, 여과하고, 에탄올을 용매로 하여 정 저】, 농축 과정을 거쳐 스프레이 드라이로 건조시켜 분말화한 것으로 전체 이소플라본 함량이 10% 이상이며 다이드제인, 제 니스테인, 글리시테인의 비가 약 4: 1 :5가 되는 원료이다.
데이터처리
- 각 주별로 피부주형을 분석하고 군별 주름정도를 나타내는 지표(R1-R5)들의 분석치를 통계처리 하였다(Fig. 4). R1-R5값은 주름 정도가 심할수록 큰 값을 보인다.
- , Seoul, Korea)에 cage 당 8마리씩 사육하였으며, 사료는 마우스 전용사료(SCF, Incheon, Korea)를 자유 급이 하였으며, 음수는 자외선 소독한 상수도수를 자유 급이 하였다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측 정하고, 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였으며 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 동물의 개체식별은 피모색소표시법 및 사육 상자별 tag 표시법 을 이용하였다.
- 통계학적 방법: 본 시험에서 얻은 결과치인 체중, 피부 두께 및 피부주형 결과에 대해 one-way ANOVA와 Student “test를 이용하여 대조군과 시험물질투여군 간의 통계학적 유의성을 검 정하였다(/?< 0.05).
이론/모형
- 동물의 개체식별은 피모색소표시법 및 사육 상자별 tag 표시법 을 이용하였다. 실험동물 사육관리는 "Guide for the care and use of laboratory animals'를 기준으로 하였다.
- 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측 정하고, 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였으며 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 동물의 개체식별은 피모색소표시법 및 사육 상자별 tag 표시법 을 이용하였다. 실험동물 사육관리는 "Guide for the care and use of laboratory animals'를 기준으로 하였다.
성능/효과
- UV 조사 기간 중, 육안으 로 관찰 시 정상군에 비해 UV 대조군의 피부주름 증가가 뚜 렷하였으며, APB-03을 투여한 군은 UV 대조군에 비해 주름 증가가 현저히 감소하였으며, 정상군과 비슷할 정도로 피부주 름 상태가 양호하였다. 8주 및 12주에 제작뇐 replica를 image analyzer 분석평가를 실시한 결과, APB-03을 경구 반복 투여한 실험군은 UV 대조군에 비해 전체적으로 주름이 감소하였으며, 실험 12주의 UV/APB-03 고용량군의 피부주름은 UV 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 감소하는 것을 알 수 있었다 (/7<0.이). H&E(Hematoxylin & Eosin) stain을 실시한 결괴-, UV 조사에 의한 표피 및 진피, 피하지방층에서의 손상에 대해 APB-03의 치유능력을 관찰할 수 있었다.
- 5에서 볼 수 있듯이 진피 조직에서의 교원질의 분포 또한, 변형된 구조를 보이는 UV 대조군과 달리 UV/APB-03 고농도 군에서는 UV대조군에서의 손상이 감소된 변화를 관찰할 수 있었다. H&E 염색 결과, UV대조군의 표피두께 증가 및 진피의 염증세포 침윤이 관찰되었고, 진피의 충혈이 관찰되었으나, UV/ APB-03 고농도군에서는 이러한 현상이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 피부 조직 염색 결과를 종합하여 볼 때, UV 조사에 의한 표피 및 진피, 피하지방층에서의 손상에 대해 APB-03의 농 도 의존적인 손상 예방 능력을 관찰할 수 있었다.
- 이). H&E(Hematoxylin & Eosin) stain을 실시한 결괴-, UV 조사에 의한 표피 및 진피, 피하지방층에서의 손상에 대해 APB-03의 치유능력을 관찰할 수 있었다.
- 시험물질을 투여한 모든 동물에서 시험 전 기간을 통해 사 망한 동물은 없었으며, 본 시험물질에 의한 것이라고 인정되는 임상증상, 행동이상 및 체중변화 등도 관찰되지 않았으며, 부 검시에도 본 시험물질의 투여에 기인한 것으로 사료되는 어떠 한 육안적 병변도 관찰되지 않았다. UV 조사 기간 중, 육안으 로 관찰 시 정상군에 비해 UV 대조군의 피부주름 증가가 뚜 렷하였으며, APB-03을 투여한 군은 UV 대조군에 비해 주름 증가가 현저히 감소하였으며, 정상군과 비슷할 정도로 피부주 름 상태가 양호하였다. 8주 및 12주에 제작뇐 replica를 image analyzer 분석평가를 실시한 결과, APB-03을 경구 반복 투여한 실험군은 UV 대조군에 비해 전체적으로 주름이 감소하였으며, 실험 12주의 UV/APB-03 고용량군의 피부주름은 UV 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 감소하는 것을 알 수 있었다 (/7<0.
- UV 조사 기간 중, 육안으로 관찰 시 정상군에 비해 UV 대 조군의 피부주름 증가가 뚜렷하였으며, APB-03을 투여한 군은 UV 대조군에 비해 주름 증가가 적고, 피부주름 상태가 양호하 였다(Fig. 3).
- 시험 물 질 투여 8주후 피부 영상 분석 결과 APB-03(5X)군에서 총 5 가지 주름 지표 중 주름 깊이를 나타내는2개 지표(Rl, R2)에서 UV대조군에 비해 25% 정도의 감소치를 보여 UV 대조군 과 통계적 유의성을 가진 결과를 보여주었으나, 다른 군에서는 감소하는 경향성만 보였을 뿐 통계적으로는 유의성을 갖지 못 하였다. 그러나 시험 물질 투여 후 12주에서는 APB-03을 경구 반복 투여한 모든 군에서 UV 대조군에 비해 5가지 주름 지표 상에서 30-40%의 감소치를 나타내었으며, 모든 수치가 통계적 으로 유의성 있게 감소하였다(p< 0.01). 시험 물질을 12주 투여 하였을 때 자외선으로 인한 굵은 주름 생성뿐만 아니라 미세 한 주름도 예방할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었、다.
- 섭취 8주째에서 중간 농도(5X)를 제외한 군에서 예방 효능을 관찰하지 못하여 농도 의존성을 확인 하지 못했으며 또한 12주차에서 모든 군에서 효능이 관찰되었 지만 농도 의존성을 관찰할 수 없었다. 모든 군에서 부검 소견 시 이상 징후를 발견할 수 없었던 것으로 미루어 볼 때 이들 농도에서 독성은 없는 것으로 판명되며, 이미 저농도에서도 그 효능을 나타내기에 충분한 농도인 것으로 생각된다. 추후 더 낮은 농도에서 실험을 실시하여 가장 효율적인 농도를 찾아낼 수 있을 것으로 생각된다.
- 시험 결과, UV 비조사군과 UV 조사군을 비교해 보았을 때, UV 조사에 의해 약 3배 정도의 표피 두께 증가를 관찰할 수 있었으며, APB-03 고농도 투여 시 표피 두께가 UV 대조군에 비해 20% 가량 줄어드는 양상을 관찰할 수 있었다(Table 3). Fig.
- 피부 주형 분석 결과 정상군과 UV 대조군을 비교해 보았을 때, 자외선 조사는 각 지표에서 4-5배 정도의 증가치를 보여 자외선이 확실하게 피부 주름을 유발하는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. 시험 물 질 투여 8주후 피부 영상 분석 결과 APB-03(5X)군에서 총 5 가지 주름 지표 중 주름 깊이를 나타내는2개 지표(Rl, R2)에서 UV대조군에 비해 25% 정도의 감소치를 보여 UV 대조군 과 통계적 유의성을 가진 결과를 보여주었으나, 다른 군에서는 감소하는 경향성만 보였을 뿐 통계적으로는 유의성을 갖지 못 하였다. 그러나 시험 물질 투여 후 12주에서는 APB-03을 경구 반복 투여한 모든 군에서 UV 대조군에 비해 5가지 주름 지표 상에서 30-40%의 감소치를 나타내었으며, 모든 수치가 통계적 으로 유의성 있게 감소하였다(p< 0.
- 01). 시험 물질을 12주 투여 하였을 때 자외선으로 인한 굵은 주름 생성뿐만 아니라 미세 한 주름도 예방할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었、다.
- 시험물질을 투여한 모든 동물에서 시험 전 기간을 통해 사 망한 동물은 없었으며, 본 시험물질에 의한 것이라고 인정되는 임상증상, 행동이상 및 체중변화 등도 관찰되지 않았으며, 부 검시에도 본 시험물질의 투여에 기인한 것으로 사료되는 어떠 한 육안적 병변도 관찰되지 않았다. UV 조사 기간 중, 육안으 로 관찰 시 정상군에 비해 UV 대조군의 피부주름 증가가 뚜 렷하였으며, APB-03을 투여한 군은 UV 대조군에 비해 주름 증가가 현저히 감소하였으며, 정상군과 비슷할 정도로 피부주 름 상태가 양호하였다.
- 이번 실험에서는 효능 물질들이 피부 손상 예방 효과를 나 타낸다는 것을 실험 동물에서 증명하였다. 이 사실을 뒷받침하기 위해 그 작용 메카니즘에 대한 분자 생물학적 연구가 차후 필요할 것으로 생각된다.
- 이상의 실험결과를 종합해 볼 때, 암컷 hairless mouse에서 APB-03의 경구 반복 두여 시 UV 조사로 유도된 광노화의 억 제 및 피부주름예방효과가 확인되었다.
- 투여 전 각 동물은 25.77±1.44-26.77± 1.36 g으로 고른 체중 범위를 나타내었으며, 시험물질 투여기간 중 정상군을 포함한 시험군 모두가 체중 증가를 나타내어 최종 체중범위는 29.47 ±1.56-30.26±2.29 g이였다. 전 시험기간 중 체중에 대한 통계 적인3 <0.
- 표피의 비후화는 시험 물질군의 모든 농도에서 확연한 예방 효과를 볼 수 없었으나, 진피 층의 염증 세포 침윤 정도 등은 농도 의존적인 패턴으로 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 효능 물질들이 혈액을 통해 공급되는 점을 고려할 때, 자외선으로 인한 직접적인 손상을 입게 되는 표피층보다는 진피층의 손상 을 예방하는 효과가 있다고 추론할 수 있다
- H&E 염색 결과, UV대조군의 표피두께 증가 및 진피의 염증세포 침윤이 관찰되었고, 진피의 충혈이 관찰되었으나, UV/ APB-03 고농도군에서는 이러한 현상이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 피부 조직 염색 결과를 종합하여 볼 때, UV 조사에 의한 표피 및 진피, 피하지방층에서의 손상에 대해 APB-03의 농 도 의존적인 손상 예방 능력을 관찰할 수 있었다.
- R1-R5값은 주름 정도가 심할수록 큰 값을 보인다. 피부 주형 분석 결과 정상군과 UV 대조군을 비교해 보았을 때, 자외선 조사는 각 지표에서 4-5배 정도의 증가치를 보여 자외선이 확실하게 피부 주름을 유발하는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. 시험 물 질 투여 8주후 피부 영상 분석 결과 APB-03(5X)군에서 총 5 가지 주름 지표 중 주름 깊이를 나타내는2개 지표(Rl, R2)에서 UV대조군에 비해 25% 정도의 감소치를 보여 UV 대조군 과 통계적 유의성을 가진 결과를 보여주었으나, 다른 군에서는 감소하는 경향성만 보였을 뿐 통계적으로는 유의성을 갖지 못 하였다.
- 피부 주형 분석에서 APB-03은 경구 섭취 12주 후에 모든 투 여군에서 통계적으로 유의한 수준으로 자외선으로 인한 주름 생성을 예방해주는 결과를 보여주었으나 8주에서는 일부 군에 서만 효과가 확인되어 주름 생성 예방 효과를 명확히 관찰할 수 없었다. 이것은 두 물질을 섭취 후, 그 유효 성분들이 작용 부위까지 효능을 나타낼 수 있는 유효 농도로 포화 될 때까지 시간이 소요된다는 것과, 이들 물질이 피부에서 반응성 산소종 을 직접 제거하는 것과 같이 피부에 대해 1차적인 방어 효능 을 나타내는 것이 아니라 이 물질들의 대사체가 피부 세포에서 효능을 나타내는 것으로 생각할 수 있다.
- 피부의 광손상에 대한 주요 기작인 반응성 산소종 생성과 피부 구성 성분인 콜라겐 파괴에 대한 보호 효과를 평가하였다. 피부에 효능을 갖는 소재를 스크리닝 하기 위하여 자체적으로 섬유아 세포주를 이용하여 DPPH assay, collagenase 발현 억제, Type I pN procollagen 생성 실험을 한 결과 여러가지 소재 중 대두 추출물과 홍삼 추출물의 항산화 능은 뛰어나지 못했지만 collagenase 발현 억제, Type 1 pN procollagen 생성능이 무처리 대조군에 비해 개선 효과를 보임 을 확인할 수 있었다. 세포를 이용한 시험관 시험 결과 대두 추출물과 홍삼 추출물을 후보 소재로 선정하였다.
후속연구
- 이 사실을 뒷받침하기 위해 그 작용 메카니즘에 대한 분자 생물학적 연구가 차후 필요할 것으로 생각된다. 또한 대두 추출물과 홍삼 농축액 분 말 혼합물의 섭취의 정확한 시너지 효과와 적정 농도, 적정 섭 취 기간에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 이번 실험에서는 효능 물질들이 피부 손상 예방 효과를 나 타낸다는 것을 실험 동물에서 증명하였다. 이 사실을 뒷받침하기 위해 그 작용 메카니즘에 대한 분자 생물학적 연구가 차후 필요할 것으로 생각된다. 또한 대두 추출물과 홍삼 농축액 분 말 혼합물의 섭취의 정확한 시너지 효과와 적정 농도, 적정 섭 취 기간에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 이것은 두 물질을 섭취 후, 그 유효 성분들이 작용 부위까지 효능을 나타낼 수 있는 유효 농도로 포화 될 때까지 시간이 소요된다는 것과, 이들 물질이 피부에서 반응성 산소종 을 직접 제거하는 것과 같이 피부에 대해 1차적인 방어 효능 을 나타내는 것이 아니라 이 물질들의 대사체가 피부 세포에서 효능을 나타내는 것으로 생각할 수 있다. 이런 점에서 피부 에 대해 직접적인 보호 효과를 갖는 피부 외용제 도포와 동시 실행 시 시너지 효과를 볼 수 있을 것으로 기대된다.
- 모든 군에서 부검 소견 시 이상 징후를 발견할 수 없었던 것으로 미루어 볼 때 이들 농도에서 독성은 없는 것으로 판명되며, 이미 저농도에서도 그 효능을 나타내기에 충분한 농도인 것으로 생각된다. 추후 더 낮은 농도에서 실험을 실시하여 가장 효율적인 농도를 찾아낼 수 있을 것으로 생각된다. 또한 12주차에 모든 군에서 확실한 예방 효과를 관찰할 수 있었던 사실로부터 농도시험 물질의 농 도보다는 시험 물질의 섭취 기간이 주름 예방 효과에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
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