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문제 정의
- 이러한 식품들은 알카리성 물질을 많이 함유하고 있는 알카리성 식품인데 지난해 미국 위생국에서 발표한 영양과 건강에 대한 조사 보고서에 따르면 년 간 50만명에 이르는 암으로 인한 사망자의 3분의 1이 과실을 포함한 알카리성 식품을 충분히 섭취했으면 예방할 수 있었을 것이라고 한다. 따라서, 본 연구에서는 알카리성 용액이면서 알카리성 물질을 형성하여 인간의 체액과 혈액의 pH를 조절하고 또한 인체구성 성분인 동시에 인체내에서 삼투압 조절이나 각종 효소의 활성화 인자로서 대사조절 작용을 한다는 무기질의 조성으로 칼륨, 인, 철 등의 무기원소를 함유하고 있는 바로돈을 섭취함으로써 위암세포의 증식을 억제하여 예방할 수 있는지를 확인해 보았다.
- , 2002). 이 연구에서는 사람의 위암 세포인 AGS 세포에서 바로돈 A와 B의 세포고사 유도에 의한 증식억제 효과와 그 메커니즘을 시험해보았다.
제안 방법
- AGS 세포에서 바로돈에 의한 생존율 저하를 확인한 뒤, AGS 세포에서 바로돈에 의한 변화를 관찰하였다. Fig.
- 정량한 세포부유액은 4sample buffer와 혼합하여 12% polyacrylamide gel로 전기영동한 후, 영동이 끝난 gel의 단백질은 nitrocellulose membrane으로 4℃에서 25 V로 10시간 transter한 후 blocking buffer (5% skim milk)와 상온에서 1시간 반응시켰다. Caspase(BD, monoclonal antibody), PARP(Promega, polyclonal antibody), Bel family(SantaCruz, monoclonal antibody) 등 apoptosis와 관련된 protein에 대한 항체를 0.05%의 lween-20°l 함유된 Tris-buffered sample saline(TBS-T)에 1 : 1000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 4℃에서 16시간 반응한 다음 이차항체인 HRP-goat anti-rabbit IgG conjugate와 HRP-goat antimouse IgG conjugateCTBST로 1 : 1000으로 희석)와 상온에서 1시간 반응 후 chemiluminescent detection reagent를 이용하여 X-ray film에 노출시켜 현상하였다.
- 고정된 세포들은 다시ice-cold PBS로 세척해주고, 50 μg/ml의 propidium iodide를 100 |ug/ml의 RNase A와 함께 30분 동안 배양하였다. FACSCalibur를 이용하여 세포주기를 측정하여 세포주기의 arrest 여부를 확인하였다.
- Fig. 1, 2와 3의 결과들을 바탕으로 바로돈은 AGS 세포에 증식을 억제할 수 있는 활성성분을 가지고 있다고 사료되어, 바로돈이 AGS 세포에서 어떠한 기전으로 성장을 억제하고 세포의 증식이 감소하였는지를 알아보기 위하여 바로돈 A와 B를 0.25%와 그보다 높은 농도인 0.33%를 6시간 동안 처치한 후 PI Staining을 하여 FACScan 시험법으로 세포고사의 정도와 동시에 세포성장 억제 요인 중의 하나인 cell cycle arrest를 동시에 알아보고자 하였다. Fig.
- 그러나 바로돈 B 0.2%의 경우 6시간 동안 AGS 세포에 노출되었을 때 세포독성에 의한 세포사가 의심되었으며, 따라서 세포독성이 관찰되지 않은 바로돈 A와 B의 0.25%와 0.33%를 AGS 세포에서 세포고사에 관여하는 유효한 농도로 결정하였다(data not shown).
- 물질 처치 시간이 끝나기 4시간 전 MTT stock solution(5 mg/ml in PBS)을 각 well에 W%(vol/vol) 첨가한 후 4시간 배양하였다. 물질 처치 시간이 끝나면 배지를 저]거하고 각 well 당 200의 DMSO를 첨가하여 purple formazan을 용해시킨 후 ELISA reade로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 무처치군에 비례한 cell viability 혹은 growth의 비율을 산출하였다.
- 사람의 위암세포에서 세포 성장 억제효과를 확인하기 위하여 바로돈은 다음과 같은 농도별로 배지에 희석하여 처치한 후 MTT 시험법으로 조사하였다. 바로돈 A와 B는 각각 0.16%, 0.2%, 0.25%, 0.33%(바로돈 vohjme 양배지 vdume)의 양으로 배지에 첨가하여 AGS 세포를 6시간 동안 배양하였다. 0.
- 사람의 위암세포에서 세포 성장 억제효과를 확인하기 위하여 바로돈은 다음과 같은 농도별로 배지에 희석하여 처치한 후 MTT 시험법으로 조사하였다. 바로돈 A와 B는 각각 0.
대상 데이터
- 세포주 배양. Gastric cancer cell line인 AGS 세포는 한국 세포주은행(KNCC, 서울대학교)에서 분양, 계대 배양하면서 생화학적 및 분자 생물학적 실험을 실시하였다.
- 물질은 연한 갈색이며 사용 기간동안 실온에서 보관하였다. RPMI-1640, FBS, 항생제 및 세포배양에 필요한 성분은 GIBCO BRL사(Grand 이and, NY, USA)로부터 구입하였으며 , 배양용기(75 mm plask와 24 well plate)는 Nunc사(Nalge Nunc International, USA)에서 구입하여 사용하였다. caspase-7, PARR Bax, Bad 등에 대한 항체는 Santa Cruz사(Santa Cruz, CA,USA)에서 구입하였다.
- RPMI-1640, FBS, 항생제 및 세포배양에 필요한 성분은 GIBCO BRL사(Grand 이and, NY, USA)로부터 구입하였으며 , 배양용기(75 mm plask와 24 well plate)는 Nunc사(Nalge Nunc International, USA)에서 구입하여 사용하였다. caspase-7, PARR Bax, Bad 등에 대한 항체는 Santa Cruz사(Santa Cruz, CA,USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 시험물질은 바로돈 S.F(주)에서 공급한 음이온 알칼리 복합광물질 용액이다. 이 물질은 메타 규산나트륨 100중량부에 대하여, 붕사 1-15 중량부, 티오 황산나트륨 10-5-10 4 중량부, 탄산칼륨 30-150중량부, 정제 백당 30-200중량부, 물 100-200 중량부 및 염화나트 륨, 티오황산은 또는 몰리브덴산나트륨 중 선택된 1종 이상을 10 -1 중량부 이내 함유하는 것을 특징으로 하는 알칼리용액 조성물이다.
데이터처리
- ) 를 산출하였다. 통계처리는 Student's t-test에 준하여 처 리하였고 p-value가 최대치 0.05 이하의 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
- 표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 결과이며, 이들의 평균(mean)과 표준편차(standard devaltion, S.D.) 를 산출하였다. 통계처리는 Student's t-test에 준하여 처 리하였고 p-value가 최대치 0.
이론/모형
- MTT assay를 이용한 세포 생존율 측정. Mutiwell plate에 1><105 ceU/ml의 AGS를 파종한 후 cell viability assay의 경우 세포가 80-90%, growth assay의 경우 50% 가량의 confluency에 도달하면 농도별로 희석된 물질을 각 well에 처치하여 cell viability assay는 24시간, growth assay의 경우 12, 24, 48, 72시간 처치한 후 37℃ humidified CO2 incubator에서 배양하였다.
- 바로돈이 위암의 세포고사를 유도하는 메커니즘을 알아보기 위하여 세포고사에 대한 여러 단백질의 변화를 Western blotting을 통하여 관찰하였다. 최근에 apoptosis에 의한 세포고사기작에서 caspase로 이름 붙여진 interleukin-1-b-converting enzyme(ICE) family cystein protease가고사 과정의 중심 역할을 하고 이 효소가 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 같은 기질을 분해하는 것으로 알려져 있다.
- 01 %까지, sub-G1 phase가 증가하여 바로돈 A보다 위암의 성장 억제효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 세포고사의 정량적인 수치를 알아보기 위해 Flow cytometry 시험법을 실시하 였고 그 작용기전을 확인하기 위하여 Western blotting 시험법을 사용하여 caspase family cysteine protease의 활성을 조사하였다.
성능/효과
- 1과 2). 그리고 바로돈 B 를 0.16% 처치하였을 때 바로돈 A와 마찬가지로 AGS 세포의 성장에 어떠한 영향도 미치지 않았으나 0.2%, 0.25%와 0.33%를 처치하였을 때, 모두 60% 이상의 성장 억제효과가 관찰되어 바로돈 A보다 사람의 위암세포 생존률 저하가 더 현저하게 일어나는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 2002). 따라서, 본 연구 결과에서도 공포화된 cluster 외에 남은 세포에서는 형태학적으로 어떠한 영향을 받지 않은 것으로 보아 바로돈 A와 B는 자발적인 공포화를 유도하여 세포고사가 발생하는 것으로 판단된다.
- 33% 처치하였을 경우 sub-G1 phase(M1)가 증가하고 바로돈 B의 경우도 sub- G1 phase(M1)가 농도 의존적으로 증가하여 세포고사가 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 바로돈 B의 경우 대조군에 비하여 바로돈 B를 0.33% 처치하였을 경우(B-3) 13.3%까지, 0.25% 처치하였을 경우(B-4) 9.01 %까지, sub-G1 phase가 증가하여 바로돈 A보다 위암의 성장 억제효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 세포고사의 정량적인 수치를 알아보기 위해 Flow cytometry 시험법을 실시하 였고 그 작용기전을 확인하기 위하여 Western blotting 시험법을 사용하여 caspase family cysteine protease의 활성을 조사하였다.
- 1). 또한, 바로돈 A를 0.25%의 양으로 배지 에 첨가하였을 때는 60% 이상의 AGS 세포 성장 억제효과가 관찰되었고 바로돈 B에서는 0.2%에서 성장 억제효과가 최대인 경향을 보였다(Fig. 1과 2). 그리고 바로돈 B 를 0.
- 2% 처치하였을 때 세포의 생존율이 감소되었다. 또한, 세포 내공포(vacuolation)가 생성되고 세포주기 분석에서 분절된 sub-G1의 세포가 증가하는 것을 보아 세포고사의 특징을 관찰할 수 있었다. 세포 내 공포형성은 대부분의 세포에서 발견되는 lysosomal vacuolation과는 다르다.
- 2002). 본 실험에서는 세포고사에 관련된 Bcl-2 family 중 Bax와 Bad의 변화와, caspase 7의 activation을 시험한 결과, 바로돈은 위암세포의 미토콘드리아를 경유하는 downstream caspase인 caspase 7의 activation과 DNA repair에 관련된 death substrate인 PARP의 cleavage, pro-apoptotic protein인 bax의 up-regulation을 통해 세포고사를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
후속연구
- 그러므로, 사람의 AGS 세포 이외의 위암세포에서 in vitro 시험과 더불어 이종(xenograft) 동물 위암모델을 이용하여 생체 내 항암실험에 대한 연구가 이루어진다면 바로돈은 사람의 위암의 예방과 치료에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
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