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문제 정의
- 발효식품이 주를 이루고 있는 국내 잔반의 특성상 낮은 pH에 대한 선별균주의 내성이 중요한 비F, 단백질 분해 활성이 뛰어난 3종류의 선별균주를 대상으로 음식물쓰레기의 pH 환경에 대한 내성을 확인하기 위하여 pH에 따른 생육도를 조사하였다. 본 실험의 대조구로서 일반적으로 많이 사용되는 균주인 Bacillus subtilis DSM 10 균주 를 이용하였다.
- 본 연구에서는 일차적으로 단백질 분해 활성이 우수하고, 부가적으로 극한 pH, 고염, 다양한 생육억제물질에 대해 내성이 뛰어난 Bacillus 속의 신규 미생물 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 음식물 쓰레기 등의 유기성 쓰레기의 소멸화 능력을 연구하였다. 또한, 분리주를 이용하여 음식물 쓰레기 소멸에 적합한 미생물 종균제를 개발하였다.
- 선별균주들의 자연계에 노출되었을 경우 타오염 미생물에 대한 경쟁우월성을 확인하기 위하여 고온에서의 생육도를 조사하였다. 본 실험을 위하여 각각의 균주를 50 C에서 2일간 진탕 배양한 후 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
제안 방법
- 본 실험의 대조구로서 일반적으로 많이 사용되는 균주인 Bacillus subtilis DSM 10 균주 를 이용하였다. 각각의 균주를 영양 배지(peptone 0.6 %, beef extract 0.3 %, pH 7.0)에 접종하여 50 C에서 2일간 진탕배양하였고, 배양액 1 %를 citrate-phosphate buffer 및 Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer를 이용하여 각각 pH 3에서 pH 9까지 조정한 영양 배지에 접종하여 50 Q에서 2일간 진탕배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 실험의 결과를 [그림3]에 나타내었는데, 대부분의 균주가 pH 5~7사이의 영역에서 흡광도 0.
- 국내 음식물쓰레기의 특성상 고농도로 함유된 소금, 고춧가루, 후추가루 및 겨자 등의 미생물 생육 저해물질에 대한 선별 균주의 내성을 조사하였다. 선별균주를 영양 배지에 접종하여 50 P에서 200 rpm으로 48시간동안 진탕배양하여 사용하였다.
- 균주의 2차 분리를 위하여 영양배지(peptone 0.6 %, beef extract 0.3 %, pH 7.0)가 들어있는 96 well plate에 분리한 균주를 백금이로 한 well에 한 colony 씩 접종하여 50 C 에서 200 rpm으로 48시간동안 진탕 배양한 후, 4 C 냉장실에서 균주를 침전시킨 후, 96 well plate에서 발현된 배양액 20 成를 skim milk agar plate위에 떨어뜨렸다, 37 ℃ incubatoi에 넣어 약 10시간 반응시킨 다음 [그림1]에서와 같이 투명환(clear zone)이 선명하고 지름이 크게 형성된 colony를 선별하였다.
- 선별균주를 영양 배지에 접종하여 50 P에서 200 rpm으로 48시간동안 진탕배양하여 사용하였다. 내성을 조사하기 위하여 각각의 성분들을 농도에 따라 영양 배지에 첨가하였고, 여기에 미생물 배양액 1 %를 접종한 후 50 P에서 48시간 진탕 배양 하였으며 배양된 균의 성장도는 평판도말법 및 흡광광도법을 이용하여 조사하였다. 소금의 경우 0~8 %, 고춧가루의 경우 0~5 %, 후추가루와 겨자의 경우 0~6 % 첨가하여 실험을 실시하였다.
- 그 후, 4 11,000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 회수하여 sample용액을 제조하였다. 대조군은 조효소용액 0.5 ml에 TCA mixture 1 ml을 넣고 측정온도에서 1시간 방치하여 효소의 활성을 제거하였다, 여기에 기질용액을 1 ml 넣고 다시 30분간 반응시킨 뒤, 4 笆, 11,000 g에서 10분간 원심분리하여 그 상층액만을 회수하여 제조하였다. 이렇게 제조된 각각의 sample과 대조구는 Bradford reagent[15]와 동량 섞은 후 분광광도계를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 상대적 효소활성을 결정하였다.
- 68 units/ml 이상의 월등한 단백질 분해능을 보였다. 따라서, 이후의 실험에는 10, 31, 43번 균주를 사용하여 여러 조건에서 선별 균주들의 생육도 및 단백질 분해효소의 활성에 대한 실험을 수행하였다.
- 95를 보여 가장 좋은 성장을 보였다. 또한 선별 균주가 분비하는 단백질 분해효소의 고온에서의 안정성을 확인하기 위하여 다양한 온도 범위에서 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
- 분리된 균주의 음식물 쓰레기 등의 유기성 쓰레기의 소멸화 능력을 연구하였다. 또한, 분리주를 이용하여 음식물 쓰레기 소멸에 적합한 미생물 종균제를 개발하였다.
- 또한, 음식점에서 많이 이용되는 후추와 겨자에 대한 내성 특성을 조사하였다. 후추와 겨자를 각각 1, 3, 6 % 첨가하여 대조구와 비교하였다.
- 선별 균주를 종균제로 이용하기 위하여, 밀기울 고체배지와 밀기울 혼합배지에 5 %(v/w)되게 접종 하여 45 笆에서 3일간 배양한 후 상온에서 2일간 건조하여 사용하였다. 밀기울고체배지는 중량비로 밀기울 100에 urea 0.2와 tween 80을 0.1의 비율로 혼합한 후, 멸균수 100을 첨가하여 수분량을 조정하여 사용하였으며, 밀기울 혼합배지는 밀기울 200, 쌀겨 100, 커피박 100, urea 0.2 및 tween80 0.1의 비율로 혼합한 후 멸균수 100을 첨가하여 사용하였다.
- 선별균주들의 자연계에 노출되었을 경우 타오염 미생물에 대한 경쟁우월성을 확인하기 위하여 고온에서의 생육도를 조사하였다. 본 실험을 위하여 각각의 균주를 50 C에서 2일간 진탕 배양한 후 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 실험 결과, [그림4]에 나타난 것처럼, 모든 균주가 50 C 에서 흡광도 1.
- 본 연구에서는 일차적으로 단백질 분해 활성이 우수하고, 부가적으로 극한 pH, 고염, 다양한 생육억제물질에 대해 내성이 뛰어난 Bacillus 속의 신규 미생물 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 음식물 쓰레기 등의 유기성 쓰레기의 소멸화 능력을 연구하였다.
- 선별 균주의 종균제로서의 가능성을 확인하기 위하여 고체배양을 실시하였다. 선별 균주를 종균제로 이용하기 위하여, 밀기울 고체배지와 밀기울 혼합배지에 5 %(v/w)되게 접종 하여 45 笆에서 3일간 배양한 후 상온에서 2일간 건조하여 사용하였다. 밀기울고체배지는 중량비로 밀기울 100에 urea 0.
- 균주의 성장에 미치는 pH의 영향을 확인하기 위해 citrate-phosphate buffer 및 Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer로 pH를 조절하여 제조한 뒤 별도로 배양한 각각의 균주를 동량 접종하여 45 ℃에서 200 rpm으로 48시간 배양하였다. 선별 균주의 종균제로서의 가능성을 확인하기 위하여 고체배양을 실시하였다. 선별 균주를 종균제로 이용하기 위하여, 밀기울 고체배지와 밀기울 혼합배지에 5 %(v/w)되게 접종 하여 45 笆에서 3일간 배양한 후 상온에서 2일간 건조하여 사용하였다.
- 선별된 균주를 이용하여 단백질 분해효소 생성을 위한 생육조건을 확인하기 위하여 액체배양을 수행하였는데, nutrient broth (peptone 0.6 %, beef extract 0.3 %, pH 7.0) 배지가 들어있는 500 ml 진탕플라스크에 선별균주를 접종하여 45 'C에서 200 rpm으로 48시간 배양하였다. 균주의 생육은 분광광도계를 이용하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
- 내성을 조사하기 위하여 각각의 성분들을 농도에 따라 영양 배지에 첨가하였고, 여기에 미생물 배양액 1 %를 접종한 후 50 P에서 48시간 진탕 배양 하였으며 배양된 균의 성장도는 평판도말법 및 흡광광도법을 이용하여 조사하였다. 소금의 경우 0~8 %, 고춧가루의 경우 0~5 %, 후추가루와 겨자의 경우 0~6 % 첨가하여 실험을 실시하였다.
- 이것을 1시간동안 반응시켜 단백질 분해능 확인 방법에 따라 측정하였다. 온도변화에 따른효소활성의 변화를 보기 위해 기질용액을 각 균주가 최적 활성을 갖는 pH로 조정하고 이를 조효소 용액과 섞어서 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8(TC로 온도를 변화시키며 효소의 활성을 측정하였 다 .
- 6%(w/v)casein 기질용액을 제조하여 조효소용액과 혼합하였다. 이것을 1시간동안 반응시켜 단백질 분해능 확인 방법에 따라 측정하였다. 온도변화에 따른효소활성의 변화를 보기 위해 기질용액을 각 균주가 최적 활성을 갖는 pH로 조정하고 이를 조효소 용액과 섞어서 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8(TC로 온도를 변화시키며 효소의 활성을 측정하였 다 .
- 음식물 쓰레기를 처리할 단백질 분해능이 우수한 미생물을 분리하기 위하여, 분리원으로 충청북도 영동군 근교에서 채취한 부식토 및 퇴비를 사용하였다. 채취한 부식토 및 퇴비 1 g을 멸균 증류수 10 畝에 진탕하여 현탁시킨 후, 순차희석하여 0.5 % skim milk(Difbo)가 첨가된 분리용 평판배지(peptone 0.6 %, beef extract 0.3 %, agar1.5 %)에 도말하고, 50 ℃에서 2일간 배양하였다. 균주가 세포외로 발현한 단백질 분해효소에 의해 skim milk가 분해되어 형성된 투명환(clear zone)의 크기가 큰 colony 만을 선택하여 1차로 선별하였고, 이들 중 상대적으로 활성이 강한 3종의 균주를 선별하여 이후의 실험에 사용하였다.
- 또한, 음식점에서 많이 이용되는 후추와 겨자에 대한 내성 특성을 조사하였다. 후추와 겨자를 각각 1, 3, 6 % 첨가하여 대조구와 비교하였다. 이 결과를 [그림8]과 [그림9]에 각각 나타내었다.
대상 데이터
- 5 %)에 도말하고, 50 ℃에서 2일간 배양하였다. 균주가 세포외로 발현한 단백질 분해효소에 의해 skim milk가 분해되어 형성된 투명환(clear zone)의 크기가 큰 colony 만을 선택하여 1차로 선별하였고, 이들 중 상대적으로 활성이 강한 3종의 균주를 선별하여 이후의 실험에 사용하였다. 균주는 멸균된 이ycer이 stock solution(20 % glycerol)을 사용하여 -70 ℃ 저온 냉동고에 보관하였고, 실험용 균주는 단백질 분해효소의 활성을 유지하기 위해 skim milk 배지에서 계대 배양하여 사용하였다.
- 발효식품이 주를 이루고 있는 국내 잔반의 특성상 낮은 pH에 대한 선별균주의 내성이 중요한 비F, 단백질 분해 활성이 뛰어난 3종류의 선별균주를 대상으로 음식물쓰레기의 pH 환경에 대한 내성을 확인하기 위하여 pH에 따른 생육도를 조사하였다. 본 실험의 대조구로서 일반적으로 많이 사용되는 균주인 Bacillus subtilis DSM 10 균주 를 이용하였다. 각각의 균주를 영양 배지(peptone 0.
- 음식물 쓰레기를 처리할 단백질 분해능이 우수한 미생물을 분리하기 위하여, 분리원으로 충청북도 영동군 근교에서 채취한 부식토 및 퇴비를 사용하였다. 채취한 부식토 및 퇴비 1 g을 멸균 증류수 10 畝에 진탕하여 현탁시킨 후, 순차희석하여 0.
성능/효과
- 위의 실험들을 통하여 분리균주들의 생육특성을 조사 하였고, 그 결과를 토대로 단백질 분해 활성이 가장 좋고 고온에서의 생육도 및 생육 저해 물질에 대한 내성이 강한 10번 균주를 음식물 쓰레기 중의 단백질을 분해하는 미생물 종균제로 선정하였고, 이 균주에 대해, 목원대학교 미생물생태자원연구소에서 Bergy's 매뉴얼 (Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)과 16S rDNA의 부분 염기서열 분석에 따라 균주 동정을 실시한 결과 바실러스 서브틸리스(8ac辺“s s"btilis、)와 높은 상동성(99%)을 보였다. 분리된 균주는 일반적인 바실러스 서브틸리스와는 성장염농도에서 커다란 차이를 보이는 신규 미생물로서 이를 바실러스 서브틸리스 PNV-1 이라 명명하였다.
- 또한, 살균작용을 하는 것으로 알려진 고춧가루에 대해서도 5 %까지 미생물들의 생육에는 전혀 영향이 없는 것으로 나타났다. 대조구도 고춧가루의 실험 농도 범위에서 생육에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났지만, 선별 균주들은 대조구에 비해 2배 전후의 생육도를 나타내었다. 따라서, 국내 음식물 쓰레기에 함유된 고춧가루의 평균 함유량이 0.
- 대조구도 고춧가루의 실험 농도 범위에서 생육에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났지만, 선별 균주들은 대조구에 비해 2배 전후의 생육도를 나타내었다. 따라서, 국내 음식물 쓰레기에 함유된 고춧가루의 평균 함유량이 0.5 %인 점과 음식물 쓰레기의 소멸화 과정에서 농축시의 고춧가루 농도가 5 % 정도임을 고려할 때, 선별균주는 고춧가루에 대한 성장장애가 거의 나타나지 않아 고속 및 연속발효에 적합한 균주로서 그 이용가치가 클 것으로 판단된다.
- 소금과 고춧가루에 대한 선별균주의 내성을 조사한 결과를 [그림6]과 [그림7]에 나타내었는데, 선별 균주들은 소금 4% 이하에서 생육에 거의 영향이 없었다. 또한 소금 8 % 농도에서도 대조구에 비해 월등히 높은 생육을 보였으며 특히, 10번 균주는 8 %의 소금 농도에서도 생육에 전혀 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 이 실험을 통하여 음식물 쓰레기의 소멸화 과정에서 염분의 농도가 최대 3 % 전후까지 농축되는 것을 감안할 때에도 음식물 쓰레기의 장기간 연속 소멸화 처리가 가능한 것으로 판단되었다.
- 이 실험을 통하여 음식물 쓰레기의 소멸화 과정에서 염분의 농도가 최대 3 % 전후까지 농축되는 것을 감안할 때에도 음식물 쓰레기의 장기간 연속 소멸화 처리가 가능한 것으로 판단되었다. 또한, 살균작용을 하는 것으로 알려진 고춧가루에 대해서도 5 %까지 미생물들의 생육에는 전혀 영향이 없는 것으로 나타났다. 대조구도 고춧가루의 실험 농도 범위에서 생육에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났지만, 선별 균주들은 대조구에 비해 2배 전후의 생육도를 나타내었다.
- 이 결과를 [그림8]과 [그림9]에 각각 나타내었다. 모든 선별 균주들의 흡광도가 1.5 전후를 보여, 후추로 인한 미생물의 생육저해 현상은 발생하지 않았으며, 특히 겨자의 경우 선별균주들에서 첨가량이 증가할수록 미생물의 생육도가 증가하는 것으로 나타나 선별균주들에 의한 겨자의 분해 및 대사과정에의 이용 가능성도 있는 것으로 나타났다.
- 본 실험을 위하여 각각의 균주를 50 C에서 2일간 진탕 배양한 후 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 실험 결과, [그림4]에 나타난 것처럼, 모든 균주가 50 C 에서 흡광도 1.5 전후를 보여 고온에서의 생육에 문제가 없음을 확인하였고, 특히, 선별 균주 10번은 대조구보다 2.3배 높은 1.95를 보여 가장 좋은 성장을 보였다. 또한 선별 균주가 분비하는 단백질 분해효소의 고온에서의 안정성을 확인하기 위하여 다양한 온도 범위에서 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
- 위의 방법으로 50여개의 신규 균주를 선택하였으며, 이 균주들을 대상으로 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다 그 결과 [그림 2]에서 보여지는 것처럼 10, 11, 14, 22, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 38, 43번 균주 등 13개 미생물에서 05 unit/ml 이상의 효소가 분비되어 우수한 분해능을 보였고, 특히 10, 31, 43번 균주는 0.68 units/ml 이상의 월등한 단백질 분해능을 보였다. 따라서, 이후의 실험에는 10, 31, 43번 균주를 사용하여 여러 조건에서 선별 균주들의 생육도 및 단백질 분해효소의 활성에 대한 실험을 수행하였다.
- 또한 소금 8 % 농도에서도 대조구에 비해 월등히 높은 생육을 보였으며 특히, 10번 균주는 8 %의 소금 농도에서도 생육에 전혀 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 이 실험을 통하여 음식물 쓰레기의 소멸화 과정에서 염분의 농도가 최대 3 % 전후까지 농축되는 것을 감안할 때에도 음식물 쓰레기의 장기간 연속 소멸화 처리가 가능한 것으로 판단되었다. 또한, 살균작용을 하는 것으로 알려진 고춧가루에 대해서도 5 %까지 미생물들의 생육에는 전혀 영향이 없는 것으로 나타났다.
- 0)에 접종하여 50 C에서 2일간 진탕배양하였고, 배양액 1 %를 citrate-phosphate buffer 및 Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer를 이용하여 각각 pH 3에서 pH 9까지 조정한 영양 배지에 접종하여 50 Q에서 2일간 진탕배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 실험의 결과를 [그림3]에 나타내었는데, 대부분의 균주가 pH 5~7사이의 영역에서 흡광도 0.9 이상으로 나타나 넓은 P니 영역에서 성장에 영향이 없는 것을 확인하였다 특히, 균주 3번은 pH가 변화되어도 생육에 거의 영향을 받지 않아 다른 균주들에 비해 강한 내성을 보임을 알 수 있었다.
후속연구
- 10번과 43번 균주의 단백질 분해효소의 최적온도는 50 ℃ 이었으며, 31번 균주는 40, 50℃에서 효소의 활성이 75 % 전후로 비슷하게 나타났다. 이로써 선별된 균주들은 고온에서의 생육 및 단백질 분해 활성에 문제가 없으며 음식물쓰레기 분해에 이용시 50℃ 조건에서 최적 생육 및 활성을 보일 것으로 사료된다.
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