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문제 정의
- 본 연구에서는 음식물류폐수처리에 있어서 친환경응집 제의 처리효율성을 제고하기 위한 수단으로음식물류 폐수에 성장가능한 유기물분 해 미생물을음식물류폐수를 포함한 다양한 환경으로부터 분리하여 이들을 동정하고 그 특징을 살펴보았다. 분리된 세균들은 '산성 및 염도에 강한 면모를 보여줌으로써 음식물폐수에 적용가능한 미생물제제로서의가능성을 보여주었다.
- 본 연구에서는 음식물류폐수처리에 있어서 친환경응집제의 처리 효율성을 제고하기 위한 수단으로음식물류폐수에 성 장가능한 유기물분해 미 생물을음식물류폐수를 포함한 다양한 환경으로부터 분리하여 섬유소, 지방, 단백질 등, 유기물분해능이 뛰어난 우수균주를 선발하였으며, 이들을 동정하고그 특징을 살펴보았다.
제안 방법
- 동정을 실시하였다. 11균주의 세균으로부터 염색체를 분리한 후 16s-rDNA를 PCR (Polymearase Chain Reaction) 을 통하여증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 27F (5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 를 사용하였다19).
- NB 배지에서 37℃에서 48시간 배양한 각 분리균주의 배양상등액을 조효소액으로 이용하여 효소활성도를 분석하였다.
- 증폭을 위한 primer는 27F (5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 를 사용하였다19). PCR로 증폭된 DNA는 vector 를 이용하여 형질전환 시킨 후, 형질전환된 plasmid DNA를 분리하여 염기서열 분석 후 계통분류학적 비교, 분석을 통하여 균주를 동정하였다.
- 다양한 환경으로부터 섬유소, 지방, 단백질 등 삼성분에 대한 분해능을 갖는 균주를 선별하였으며, 이들을 대상으로 평판배지상의 투명환의 크기를비교하여 삼성분에 대하여 모두 분해능이 우수한것으로 나타난 1L종의 균주를 본 연구에 적용하기위한 최종후보균주로 결정하였다. 이들을 분리원별로 찰펴보면 음식물폐수로부터 6종(FWB-L, FWB-2, FWB-3, FWB-4, FWB-5, & FWB-6), 지렁이의 장으로부터 4종 (0D-1, OD-2, 0D-3, & 0D-4), 축산폐수에서 분리한균주 1종 (0D-8) 으로 구성되어 있다.
- 단백질 분해미생물은 skim milk를 함유하는 TSA배지 (Tryptone 15 g, Soytone 5 g, NaCl 5 g, Siam milk 10 g, Agar 18 g, 증류수 1 C) 에서배양한 후 주위에 투명대를 형성한 집락을 단백질분해미 생물로 판정하였다.
- 균주배양은 NB 배지를 이용하였으며, 120 rpm의 교반속도로 배양하였다. 미생물의 적정 생장정도는 흡광도(600nm)로 측정하였으며 유기물 분해능은 효소활성도를 측정하여적정 조건을 규명하였다.
- 분리 균주들의 효소활성도 측정 결과 3가지 유기물에 전체적으로 활성이 뛰어난 3종의 균주에 대하여 적정 생장 및 유기물 분해능에 미치는 환경인자를 분석하였다. 온도범위는 25CC, 30 C, 37'C로하였고, pH 범위는 pH 5.
- 분리된 균주를 대상으로 NB 배지 에서 전배양한후 동일한 양의 배양액을 동일한 배지에 접종하여 24시간 배 양한 후 배 양 상등액을 조효소액으로 이용하여 효소활성도를 분석하였다 [Table 2]. 결과를 살펴보면 분리된 모든 균주들의 효소활성도가 대체로 우수한 것으로 나타났다.
- 섬유소 분해미생물은 AEcel이 포함된 TSA (Trypticas하 soy agar) 배치 (Tryptone 15 g, Soytone 5 g, NaCl 5 g, CMC 5 g, Agar 18 g, 증류수 1 Q) 에서 30'C로 3일걭 배양 후, 0.1% Congo red 용액을 형성된 집락에 처리하여 주위에 투명대 (clear zone) 를 나타내는 집락을 확인하였다
- 섬유소, 지방, 단백질 등 세 가지 유기물에 대한분해능이 우수한 11개 분리 균주를 대상으로 분자생물학적 동정을 실시하였다. 11균주의 세균으로부터 염색체를 분리한 후 16s-rDNA를 PCR (Polymearase Chain Reaction) 을 통하여증폭하였다.
- 섬유소에 대한 효소활성이 가장 높게 나타난 3종의 미생물, 즉, FWB-5, FWB-6, OD-8 균주에대하여 최적 효소활성을 나타내기 위한 적정 생장온도와 pH를 조사하였다. OD-8 균주와 FWB-5 균주의 경우, 37'C의 온도에서 세 가지의 효소활성이 가장 높게 나타났다 [Table 4].
- 분석하였다. 온도범위는 25CC, 30 C, 37'C로하였고, pH 범위는 pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0으로 설정하였다. 균주배양은 NB 배지를 이용하였으며, 120 rpm의 교반속도로 배양하였다.
- 콜로니의 .주변에 형성되는 투명환의 크기로 유기물 분해 미생물 후보군을 결정하였다.
- 지방 분해미생물은 TBN(Tributyrin) 을 함유하는 TSA배지 (Tryptone 15 g, Soytone 5 g, NaCl 5 g, TBN 5 niC(5%), Agar 18 g, 증류수 995 mC) 에 희석 도말하고 30℃에서 3일간 배양한 후, 주위에 투명대를 형성한 집락을 지방 분해미생물로 판정하였다.
대상 데이터
- 11균주의 세균으로부터 염색체를 분리한 후 16s-rDNA를 PCR (Polymearase Chain Reaction) 을 통하여증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 27F (5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 를 사용하였다19). PCR로 증폭된 DNA는 vector 를 이용하여 형질전환 시킨 후, 형질전환된 plasmid DNA를 분리하여 염기서열 분석 후 계통분류학적 비교, 분석을 통하여 균주를 동정하였다.
이론/모형
- 5) 에 녹여 만든 기질용액 600 μ1에 조효소액 120E를 첨가하여 60'C에서 10분간 반응시킨 후 TCA 용액 600 μ1를 첨가하여 9, 000g에서 10분간 원심분리하였다. 상징액을 취해 Lowry method18'5. 정량하였다.
성능/효과
- 11종의 유기물분해미생물을 대상으로 분자생물학적 동정을 실시한 결과, 2 종을 제외한 모든 균주가 Bacillus 속의 균주로 동정되었다〔Table 3]. Bacillus는 Pseudomonas 속의 균주와 함께각종 난분해성 물칠의 정화용 세균으로 이용되는가장 일반적인 균종이다.
- OD-8 균주와 FWB-5 균주의 경우, 37'C의 온도에서 세 가지의 효소활성이 가장 높게 나타났다 [Table 4]. FWB-6 균주는 25'C에서도 단백질 미 지질효소 활성도가 높게나타났으며 섬유소 분해효소의 활성은 37'C에서가장 높게 나타났다. pH를 달리했을 경우엔 3종의균주 모두 pH 7.
- 결과를 살펴보면 분리된 모든 균주들의 효소활성도가 대체로 우수한 것으로 나타났다. 특히, 축산폐수에서 분리한 0D-8 균주와 음식물류폐수로부터분리한 FWB-5, FWB-6 균주가 섬유소 분해능이 높은 것으로 조사되었다.
- Bacillus는 Pseudomonas 속의 균주와 함께각종 난분해성 물칠의 정화용 세균으로 이용되는가장 일반적인 균종이다. 또한 토양 내에 존재하는단백질 분해효소의 80% 이상이 주로 Bacilhis 속의 세균들로부터 유래되며, 포자를 형성함으로써극한 환경에서의 생존력을 지니고 있어 야외용 미생물 종균제로 적용하기 위한 제형화에 매우 간편하고 우수한 생존력을 보이는 균주로서 본 연구의목적에 매우 부합되는 균종이라 할 쑤 있다. 지렁이 체액으로부터 분리 한 4종의 분리균주 역시 2종은Bacillus 속으로 밝혀졌으며 나머지 2종은 Enterobacter sp.
- 이들을 분리원별로 찰펴보면 음식물폐수로부터 6종(FWB-L, FWB-2, FWB-3, FWB-4, FWB-5, & FWB-6), 지렁이의 장으로부터 4종 (0D-1, OD-2, 0D-3, & 0D-4), 축산폐수에서 분리한균주 1종 (0D-8) 으로 구성되어 있다. 분리된 균주의 선택배지상의 투명환 형성에 따른 유기물 분해능을 살펴보면, 분리균주 대부분 단백질 및 지방에 대한 분해능이 우수한 것으로 나타났으며, 섬유, 소 분해능은 지렁이에서 분리한 균주와 비교하여음식물폐수에서 분리한 6종의 모든 균주와 축산폐수에서 분리한 균주에서 우수한 것으로 나타났다 [Table 1] 이는 음식물류폐기물의 주성분이 섬유소임을 상기할 때, 음식물폐수 내 균주들이 폐수내 섬유소분해에 적응된 결과를 반영한 것으로 판단되어 진다.
- 분리된 세균들은 '산성 및 염도에 강한 면모를 보여줌으로써 음식물폐수에 적용가능한 미생물제제로서의가능성을 보여주었다. 특히.
- 특히, 축산폐수에서 분리한 0D-8 균주와 음식물류폐수로부터분리한 FWB-5, FWB-6 균주가 섬유소 분해능이 높은 것으로 조사되었다. 지방분해 효소활성도역시 음식물폐수로부터 분리된 균주들이 전반적으로 높은 것으로 나타났다. 그러나 평판배지 상에서조사된 결과와 달리 섬유소 분해효소의 활성은 분리원에 상관없이 유사한 값을 보여주고 있는데 이는 사용된 배지의 성분조성의 차이 때문인 것으로추론된다.
- 결과를 살펴보면 분리된 모든 균주들의 효소활성도가 대체로 우수한 것으로 나타났다. 특히, 축산폐수에서 분리한 0D-8 균주와 음식물류폐수로부터분리한 FWB-5, FWB-6 균주가 섬유소 분해능이 높은 것으로 조사되었다. 지방분해 효소활성도역시 음식물폐수로부터 분리된 균주들이 전반적으로 높은 것으로 나타났다.
후속연구
- 특히. 동정결과 대부분이 BaciZZus속으로 밝혀져 미생물제형화에 유리한 균주의 확보가 가능해졌으며 차후, 음시물폐수에서균주의 순응실험 및 혼합배양실험을 통하여 폐수내 유기물분해능을 극대화시킬수 있을 것으로 기대된다.
- 평판배지에서 사용된 배지는 Avicel이첨가된 섬유소분해 선택배지 였으나, 효소활성도에사용된 배지는 일반 NA배지로써 섬유소 성분이첨가되지 않은 배지이다. 이 같은 결과로 보건데분리된 세균에 있어서 배양액내 섬유소 성분의 존재유무가 섬유소 분해능 또는 섬유소 분해효소의활성도를 증가시키는 유도작용을 할 것으로 추측되어 진다. 한편, 대조군으로 대장균을 대상으로한 실험결과 삼성분에 대한 효소활성도가 매우 미미 한 것으로 조사되었다.
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