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문제 정의
- 이러한 연구결과로 미루어 솔잎은 다양한 약리 활성을 가진 천연식물로서 당뇨의 치료 및 예방 효과가 있을 가능성을 고려해 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 정상 흰쥐에 streptozotocin을 주사하여 당뇨를 유발시킨 후 솔잎 증류액을 일정 기간 복강투여한 후 혈당 변화, 구강내당능검사(0G TT), 혈액학적 지수 및 조직병리학적 관찰을 통해 항당뇨 효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 12시간 이상 절식시킨 후 미정맥에서 얻은 전혈을 혈당측정기(Glucocard □, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 경구당부하 검사는 실험 종료 3일 전에 12시간 절식시킨 다음 미정맥에서 채혈하여 공복시 혈당 수준을 측정하여 초기 혈당으로 한 후 75% glucose 용액(0.15 g glucose/100 g BW)을 intubation tube-f- 사용하여 경구투여하고 30, 60, 120, 180분에 미정맥으로부터 채혈하여 정맥혈의 혈당 농도변화를 혈당측정기(Glucocard U, Japan)로 측정하였다.
- 실험기간중 식이와 물은 자유롭게 섭취시키고, 명암주기는 12시간 '간격으로 유지하였다. 당뇨를 유발시키기 위하여 실험동물을 12시간 이상을 절식시킨 후streptozotocin(STZ) 50 ㎎/㎏을 생리식염수에 녹여서 꼬리정맥 헤-주사하였고, 정상군은 동량의 생리식염수를 주사하였다. 당뇨 유발의 확인은 24시간 후 미정 맥에서 채 혈하여 혈당농도를 측정하고 180 mg/dL 이상인 동물만 실험에 사용하였다.
- 솔잎 증류액의 투여가 당뇨쥐의 내당능에 미치는 영향을 알아보고자 포도당을 경구 투여한 후 시간별로 .채혈하여 경구 당부하 검사에 의해 측정한 결과를 Fig.
- 예비 사육하였다. 실험군은 1개의 정상대조군(NC) 과 3개의 당뇨 유발군으로 나누었고, 당뇨 유발군은 당뇨 대 조군(DM), 솔잎 저용량 투여군(LP) 및 솔잎 고용량 투여군(HP) 으로 나눈 후 2주간 사육하였다. 실험식이는 일반식이를 4군 모두에게 공급하였고, LP군은 5㎎/㎏의 솔잎 증류액을, HP 군은 10 ㎎/㎏의 솔잎 증류액을, 정상 대조군에는 생리식염수를 매일 복강투여하였다.
- 실험기간 15일, 동안 3일 간격으로 동물의 체중을 측정하여 체중의 변화 상태를 비교하였다.
- 실험군은 1개의 정상대조군(NC) 과 3개의 당뇨 유발군으로 나누었고, 당뇨 유발군은 당뇨 대 조군(DM), 솔잎 저용량 투여군(LP) 및 솔잎 고용량 투여군(HP) 으로 나눈 후 2주간 사육하였다. 실험식이는 일반식이를 4군 모두에게 공급하였고, LP군은 5㎎/㎏의 솔잎 증류액을, HP 군은 10 ㎎/㎏의 솔잎 증류액을, 정상 대조군에는 생리식염수를 매일 복강투여하였다. 실험기간중 식이와 물은 자유롭게 섭취시키고, 명암주기는 12시간 '간격으로 유지하였다.
- 15분간 원심분리하여 혈청분리 후 분석 전까지 -70℃급속냉동시켜 보관하였다. 임상학적 검사를 위하여 임상화학적 자동분석기(Hitachi-747, Hitachi medical, , Japan)를 사용하여간기능 지수를 나타내는:, total protein, albumin, aspartate aminotransferase(AST), alanine ami- notransferase(ALT), alkaline phosphatase(ALP), 신장기능지 수를 나타내는 creatinine, blood urea nitrogen(BUN), uric acid(UA), calcium(Ca2+), inorganic phosphorus(IP), 혈 중지 질농도를 알아보기 위하여 total cholesterol, triglyceride (TG), high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C), low density lipoprotein-cholesteroKLDL-C)# 측정하였다.
- 적출한 간 및 췌장조직을 10% 중성 포르말린에 고정하여 탈수한 후 침 투과정을 거쳐 파라핀에 포매하고 5 Um의 박 절편을 만들어 hematoxylin-eosin염 색하여 광학현미경(Leica, Germany)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 、실험 동물은 체중 180±10 g의 Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐를 대한실험동물센터 에서 구입하여 실험에 사용하였고, 환경에 적응시키기 위해 고형사료(삼양사료 주식회사) 로일간.예비 사육하였다.
- 당뇨를 유발시키기 위하여 실험동물을 12시간 이상을 절식시킨 후streptozotocin(STZ) 50 ㎎/㎏을 생리식염수에 녹여서 꼬리정맥 헤-주사하였고, 정상군은 동량의 생리식염수를 주사하였다. 당뇨 유발의 확인은 24시간 후 미정 맥에서 채 혈하여 혈당농도를 측정하고 180 mg/dL 이상인 동물만 실험에 사용하였다.
- 2%)을 얻고 이를 5배 농축하여 시료로 사용하였다. 원액의 제조는 (주)선호 바이오텍에서 행하였다.
데이터처리
- 각 결과들은 ANOVA 분석을 '통해 실험군별로 평균 土 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군 간의 평균치의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 사후 검정하였다.
- 실험 결과는 SPSS program을 이용하여 분석하였다. 각 결과들은 ANOVA 분석을 '통해 실험군별로 평균 土 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군 간의 평균치의 통계적 유의성은 p<0.
성능/효과
- NC군에 비하여 당뇨 유발군에서 혈중 creatinine 농도가 높게 나타났으나 유의적인 차이가 없었다. BUNe NC군 13.14 + 1.95 mg/dL 대비 DM군 35.78 ±9.50 mg/dL로 약 2.7 배, LP군은 30.89 + 8.05 mg/dL로 2.35배, HP군은 27.40 + 7.49mg/dL로 2.08배 증가하여 용량 효과적으로 유의하게 억제됨을 보였다 (p<0.05). 당뇨병성 신증에 선행하여 신장의 기능 상태를 반영하는 지표로서 creatinine, BUN 등을 측정하는데 creatininee 근육 내의 creatinine.
- LP군에서도 60분에 가장 높은 혈당치를 보였으며 유의적인 감소를 보이면서 감소하였으나 공복혈당 수준보다는 높았다. HP군도 60분에서 가장 높은 혈당치를 나타냈고 LP군과 비교 시 유의성은 없었으나 120분과 180분에서 점차적으로 감소하였다.
- Uric acid는 NC군에 비해 DM군에서 상승하는 경향을 보였고 솔잎 투여군은 DM군과 비교시 낮아지는 경향을 보였으나 모두 유의성 은 없었다. Uric acid는 purine 대사의 최 종산물로 사람의 경우 대부분 조직 속에 있는 purine에서 유래하는 것으로 purine 대사의 유전적 결함, 요소의 과잉 생산이
- 당뇨로 인한 만성 신부전의 경우 creatininee 사 구체 여과율이 감소하여 혈중. creatinine의 농도가 높아진다고 사료되나 본 실험에서 creatinine 농도는 당뇨 유발 군에서 증가하는 경향이 보이긴 했으나 유의적 인 차이가 없음은 신장 기능의 저하를 추측할 수 있으나 심각한 합병증상은 나타나지 않은 것으로 볼 수 있다. DM군에서 BUN의 증가는 단백질 및 아미노산의 분해증가, 탈수상태, 신장기능 부전에 따른 신장의 요소 배설 감소 등에 기 인할 수 있는데, creatinine의 경우로 미루어 보아 신장 기능 부전 때문이라기보다는 인 슐린 부족으로 인해 당이 에너지로 쓰이지 못하기 때문에 체내에 저장된 단백질이나 아미노산의 분해 증가에 따른 간의 요소 합성 및 배설 증가와 다뇨로 인한 탈수상태에 의해 BUN의 농도가 높아진 것으로 사료된다.
- 3). 각 군에 있어서 혈당의 변화곡선을 보면 NC군은 포도당 투여 30분에서 혈당수준이 가장 높게 증가하였다가 120분에서 공복시 수준으로 감소하였고 180분에는 78.57 mg/dL로 공복시 수준보다 낮았다. DM군은 60분에서 혈당치가 가장 높았으며, 180분에는 크게 감소하였으나 공복시 수준보다는 높았다.
- 그러나 ALT의 경우는 NC군과 비교시세 군의 당뇨 유발군 모두에서 활성이 유의적으로 증가했으며 DM군과 비교 시 솔잎투여군의 HP군 12%, LP군 11%의 활성을 감소시키는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. AST 및 ALT는 간세포 손상시세포외로 유출되어 혈중에 농도가 증가하므로 간 손상의 지표로 이용되 는데 (29) NC군을 제외한 당뇨 유발군에서는 STZ투여로 ALT 활성도의 증가가 나타났으며 , 유의성은 없었으나 솔잎투여에 의해 ALT 활성도가 저하하는 경향을 보였다.
- 이는 STZ가 P-cell을 파괴하여 인슐린의 생성이상으로 당대사의 불균형을 초래한 것으로 보이며, alloxane으로 유도된 당뇨와는 달리 체중이 쉽게 회복되 지 않는다는 결과(24)와 일치한다. 당뇨 시 에는 세포의 포도당 이용이 저하되어 기아 상태의 대사특징을 나타내므로 본 실험 결과에서도 모든 실험군이 NC군에 비해 체중감소를 보였다.
- 한편 췌장조직의 췌도세포에대한 소견에서는 NC군의 경우 유의한 소견은 발견되 지 않은 반면 DM군의 경우 췌장실질의 괴사 및 출혈성 병변이 관찰되며, 지방세포의 괴사 또한 관찰되는 것으로 보아 STZ 에 의한 당뇨의 유도는 적절한 것으로 평가된다고 하겠다. 또한, 솔잎투여군인 LP군과 HP군에서 DM군에서 관찰되 었던 유의 한 소견들이 부분적으로 관찰되나 당뇨 대조군과 비교 시에는 억제되는 현상을 관찰할 수 있었다.
- 당뇨병의 주된 합병증으로 죽상경화증과 고지혈증이 관련되는데 고지 혈증의 경우 정상보다 혈장내 지방산이 중성지방으로 전환되는 속도가 증가하여 혈장내 중성지방 농도가 높아진다는 사실은 잘 알려져 있다 (35). 본 실험에서도 당뇨 시 혈장 중성 지방농도가 증가됨은 일치하였으나 솔잎투여에 의해 혈청 중성지방이 감소되지는 않았다. 혈청 중의 HDL-cholesterol과 LDL-choiesterole 모든 실험군간의 유의적 인 차이가 없었다.
- 솔잎투여군에서는 DM군에 비하여 ALP가 감소하였고 HP군에서보다 LP군에서 유의적으로 감소하였다. 본 실험의 결과로 보아 STZ 투여로 상승한 AST, ALT의 활성은 솔잎투여군에서 유의적이지는 않았지만 HP 군의 AST를 제외하고 감소하는 경향을 보였으며 ALP는 STZ투여 에 의해 상승된 활성이 솔잎투여로 감소된 것은 솔잎투여로 이들 transaminase활성이 억제되었거나, 세포 투과성 변화를 안정화시킨 것으로 사료된다.
- 88 mg/dL로 HP군에서 유의적인 혈당 감소를 나타내었다. 솔잎투여 15일째의 혈당은 LP군에서 225.67±96.72 mg/dL로 솔잎투여 12일째의 199.22±115.60 mg/dL보다 상승되는 경향을 보였으며 DM군과 유의적인 차이가 없었고, HP군에서 NC군 수준으로 개선되는 경향을 보였다.
- 체중 증가량에 있어서 모든 당뇨유발군은 NC군보다 낮게 나타났다. 실험동물의 체중 변화는 초기 체중에 비해 당뇨가 유발되지 않은 NC군은 69.46+3.06 g의 체증 증가를 보인 반면, 당뇨 대조군은 4.52± 29.1 g의 체중 감소를 나타내었다. 이는 STZ가 P-cell을 파괴하여 인슐린의 생성이상으로 당대사의 불균형을 초래한 것으로 보이며, alloxane으로 유도된 당뇨와는 달리 체중이 쉽게 회복되 지 않는다는 결과(24)와 일치한다.
- 이러한 산화 스트레스의 증가로 고혈당에 의한 free radical 생성이 증가되 고 항산화 역할이 감소되어 각종 free radical에 의 한 산화 손상에 매우 취약하게 된다. 이러한 결과로 보아 다양한 생리활성을 가진 솔잎의 성분이 STZ에 의한 peroxi- nitrite의 형성을 억제하고 6-cell의 손상을 완화시켜 혈당 상승을 저해할 수 있는 가능성을 보였다.
- 솔잎투여 후 초기에는 군에 따른 혈당치의 기복을 보이다가 솔잎투여 후 12일째에 HP군에서 혈당저하 효과를 나타내었다. 즉, 당뇨유발 후 솔잎투여 3일째의 공복혈당은 NC군의 79.00+ 10.00 mg/dL에 비해 당뇨 유발군 모두에서 혈당이 증가하였으나 유의적이지는 않았다. 당뇨 유발군 중 솔잎투여 군에서 솔잎투여 12일째 에 DM군의 278.
- 혈청중 총단백질과 albumin 농도, AST, ALT, ALP 활성을 Table 1에 나타내었다. 총단백질 함량은 유의성은 없었으나, NC군과 솔잎투여군에서 DM군보다 높게 나타났다. Albumin 농도에서도 총단백질의 결과와 비슷한 경향을 보였고 실험군들 간에 유의적 인 차이를 보이지 않았다.
- 43 mg/ dL이었으며 이에 비하여 당뇨유발 군 세군에서는 유의적으로 높은 혈당 수준을 보였다. 포도당 투여 60분 후에 NC군을 제외한 나머지 당뇨 유발군들에서 혈당 수준이 최고치를 보였고'HP군의 혈당수준은 347.80 mg/dL로 LP군의 422.56 mg/dL에 비해 낮았으나 유의적인 차이는 없었다. 120분 후에는 모든 실험 군의 혈당수준이 감소하기 시작하였고 60분에서와 비슷한 경향을 보였다.
후속연구
- AST 및 ALT는 간세포 손상시세포외로 유출되어 혈중에 농도가 증가하므로 간 손상의 지표로 이용되 는데 (29) NC군을 제외한 당뇨 유발군에서는 STZ투여로 ALT 활성도의 증가가 나타났으며 , 유의성은 없었으나 솔잎투여에 의해 ALT 활성도가 저하하는 경향을 보였다. AST 활성도는 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않아 당뇨에 의한 간 손상 여부는 더 검토가 필요한 것으로 보여진다. ALP의 경우 NC군은 136.
- Ca2+ 농도는 NC군과 비교 시 DM군, 솔잎투여군에서 상승되는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 당뇨의 경우 소변으로의 미네랄의 방출이 높아져 Ca2+의 농도가 저하되는 것으로 생각되나 Ca»의 농도가 증가되었음은 앞으로 더 연구되어야 할 것으로 사료된다.
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