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문제 정의
- 이들 전통재를 대상으로 항산화 활성을 가진 천연물들이 노화 피부에 좋은 영향을 주는 향장 원료로 쓰이고 있다는 점에 착안하여 DPPH free radical 소거법[4]과 SOD 활성 측정 법⑸에 의한 항산화 활성과 주름 생성의 주기전에 관련된 elastase 효소 억제 활성[6]을 관찰하였다. 또한 이들 추출물을 정상 세포에서의 세포독성 및 인체 피부 일차 자극 실험을 통해 피부 자극 유무를 측정하였으며 인체도 포를 통한 효능 실험을 통해 새로운 향장 소재로써의 가능성을 모색하고자 하였다.
- 생약 추출물의 항산화 활성에 대한 연구는 기존에 많은 연구가 수행되었으며 이들의 강한 활성이 보고되어 왔다[8], 본 연구는 노화의 주원인인 활성산소의 소거와 주름 생성에 관여하는 효소인 elastase 효소 억제에 효과를 나타내는 생약재검색을 위하여 동의보감에 의거하여 폐와 피부질환에 관련된 생약재 121종을 대상으로 그들의 MeOH 엑스에 대하여 항산화 활성과 elastase 억제 활성을 검토하였다. 항산화 활성 실험의 양성 대조물로는 ascorbic acid를, elastase 억제 활성 실험의 양성 대조물로는 methoxy succinyl-AlaeAla-Pro-Val-chloromethyl ketoneB와 ursolic acid를 사용하였다.
- 이러한 시대 흐름에 부합하여 본 연구에서는 보다 안전하고 우수한 활성을 나타내는 천연 소재를 개발하고자 하였다. 전통.
제안 방법
- 96-well plate에 대수증식 기 정상 섬유아세포 4X104 cells/well씩 접종하여 24 h 배양한 후, 생약추출물의 최종 농도가 각각 0.01, 0.1, 1 ug/ml이 되도록 가하여 5% 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 72 h 배양하였다. MTT 용액 50 u“L (5 mg/mL)씩 첨가하고 4 h 후원심분리하여 상등액을 제거하고 DMSO 100 μL씩 첨가한 후 570 nm 에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
- 양성대조물로는 methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketoneB와 urso- lic acid를 조제하여 측정하였다. 각 시료의 억제 작용은 ICso (N-succinyl-ALA-ALA-ALA p-nitroanilide를 N- succinyl-ALA-ALA-ALA와 p-nitroanilide로 분해되는 것을 50%로 억제하는데 필요한 ug/mL농도)로 나타내었다.
- 더 나아가 보다 안전하고 우수한 활성을 나타내는 천연 소재 개발을 위해 세포독성 유무를 관찰하였다(Figure 1). Primary cell culture 방법을 통해 분리된 정상섬유아 세포를 대상으로 5%의 serum을 함유한 배지에서 72 h 배양하여 세포 생존율을 비교한 결과 항노화와 elastase억제 활성을 지니는 농도인 0.
- Hatano .등의 방법을 변용[기하여 시료를 각 농도별로 조제한 용액 20 uL (99.5% methanol)에 0.2 mM DPPH 용 액(99.5% methanol) 180 uL을 가하였다. Voltex mixer로 10 sec간 진탕 후 37℃에서 30 min 동안 반응시킨 후spectrophotomer를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 생약재 10 g을 마쇄하여 100 mL의 80% MeOH로 7일간 암소에 정치하여 추출하였고 이를 3번 반복하였다. 여과지로 거른 후 이용액을 농축하여 생약재 MeOH 엑스를 얻어 시료로 사용하였다.
- 75 mM XTT를 40넣어 30 min간 실온에서 반응시킨 후spectrophotomer를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조물로는 ascorbic acid를 조제하여 즉정하였다. 각 시료의 항산화 작용은 ICso 치(xantine과 xantine oxidase에 의해 형성되는 superoxide 형성을 50%로 억제하는 데 필요한 ug/mL 농도)로 나타내었다.
- Voltex mixer로 10 sec간 진탕 후 37℃에서 30 min 동안 반응시킨 후spectrophotomer를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조물로는 ascorbic acid를 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작 용은 IGo 치(DPPH 래디칼 형성을 50%로 억제하는 데 필요한 uL농도)로 나타내었다.
- 6 units/mL elastase 효소용액 100 uL를 30 min간 37℃에서 반응시키고 4 mM sucAla3- PNA 용액(SucAla3-PNA) 40 uL를 첨가한 후 30 min간 37℃ 에서 반응시킨 후spectrophotomer를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조물로는 methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketoneB와 urso- lic acid를 조제하여 측정하였다. 각 시료의 억제 작용은 ICso (N-succinyl-ALA-ALA-ALA p-nitroanilide를 N- succinyl-ALA-ALA-ALA와 p-nitroanilide로 분해되는 것을 50%로 억제하는데 필요한 ug/mL농도)로 나타내었다.
- 또한 폐는 피부와 털을 주관한다'라는 동의보감 자료에 의거하여 폐와 피부질환에 관련된 생약재가 본 초학과 식품공전에 수재되어 있으며, 현재 한방에서 널리 이용되고 있는 121종을 선별하였다. 이들 전통재를 대상으로 항산화 활성을 가진 천연물들이 노화 피부에 좋은 영향을 주는 향장 원료로 쓰이고 있다는 점에 착안하여 DPPH free radical 소거법[4]과 SOD 활성 측정 법⑸에 의한 항산화 활성과 주름 생성의 주기전에 관련된 elastase 효소 억제 활성[6]을 관찰하였다. 또한 이들 추출물을 정상 세포에서의 세포독성 및 인체 피부 일차 자극 실험을 통해 피부 자극 유무를 측정하였으며 인체도 포를 통한 효능 실험을 통해 새로운 향장 소재로써의 가능성을 모색하고자 하였다.
- (주)바이오제노믹스에서 구입한 SD계 rat (4주령)을 마취 후 등을 제모한 후 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 표피와 진피를 분리한 후, 진피에서 섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다. 확인된 섬유아세포를 DMEM 배지에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% penicillinstreptomycin 가 하여 25 cm2 조직배양 flask 내에서 배양기 내부 공기 5% CO2 농도로 37℃에서 3~5일간 안 정화하였다.
- 3세였다. 핀챔버 (Finn Chamber)에 준비된 화장품 조성물 1 g을 각각 적하 시 킨 후 시험 부위인 우측상완 내측에 첩포검사를 실시하였다. 첩포는 24 h 폐첩포하여 첩포를 제거한 후 펜으로 시험 부위를 마킹하여 1 h, 24 h 후에 각 시험 부위의 피 부반응을 관찰하여 국제 접촉피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG) 의 규정에 따라 판정하였으며 평가는 다음식으로 계산되었다.
대상 데이터
- (주)바이오제노믹스에서 구입한 SD계 rat (4주령)을 마취 후 등을 제모한 후 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 표피와 진피를 분리한 후, 진피에서 섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다.
- Table 2는 elastase 억제 활성이 있는 생약재를 기준으로 항산화 활성을 비교하여 작성하였다. 그 결과 항노화와 주름개선 효능을 지닐 것으로 사료되는 생약재로 총 9개를 선별하였다. 총 9개의 생약재가 양성대 조군인 methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketoneB (IC50 187.
- '폐와 배합되는 것은 피부이고 폐의 상태가 겉에 나타나는 곳은 털이다. 또한 폐는 피부와 털을 주관한다'라는 동의보감 자료에 의거하여 폐와 피부질환에 관련된 생약재가 본 초학과 식품공전에 수재되어 있으며, 현재 한방에서 널리 이용되고 있는 121종을 선별하였다. 이들 전통재를 대상으로 항산화 활성을 가진 천연물들이 노화 피부에 좋은 영향을 주는 향장 원료로 쓰이고 있다는 점에 착안하여 DPPH free radical 소거법[4]과 SOD 활성 측정 법⑸에 의한 항산화 활성과 주름 생성의 주기전에 관련된 elastase 효소 억제 활성[6]을 관찰하였다.
- 생약재는 경동시장에서 구입하였으며 DPPH (1, 1-di- phenyl-2-picryl-hydrazyl), xantine, xantine oxidase, Elastase, STANA (N-succinyl-ALA-ALA-ALA p-nitroan- ilide), MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide], DMSO, N-acetyl-L-cysteine 등은 시그마사의 제품을, 기타 용매는 덕산과학의 제품을 사용하였고, 세포배양시 사용된 DMEM, FBS, antibiotics는 Gibco사의 제품을 사용하였다. 쥐의 정상 섬유아세포는 본 실험실에서 SD계 rat의 등을 제모, 조직을 적출하여 세포를 분리하여 사용하였다.
- 생약재는 경동시장에서 구입하였으며 DPPH (1, 1-di- phenyl-2-picryl-hydrazyl), xantine, xantine oxidase, Elastase, STANA (N-succinyl-ALA-ALA-ALA p-nitroan- ilide), MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide], DMSO, N-acetyl-L-cysteine 등은 시그마사의 제품을, 기타 용매는 덕산과학의 제품을 사용하였고, 세포배양시 사용된 DMEM, FBS, antibiotics는 Gibco사의 제품을 사용하였다. 쥐의 정상 섬유아세포는 본 실험실에서 SD계 rat의 등을 제모, 조직을 적출하여 세포를 분리하여 사용하였다. 기타 세포배양에 필요한 기구는 Falcon사의 제품을 사용하였다.
- 상기시험은 인체 피부 일차 자극시험으로 인체첩포 시험(human patch test)을 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance association, Safety testing guidelines)에 따라 실시하였다. 평소 피부질환 및 알러지가 없는 15명의 피험자(전원 여성)를 대상으로 연령분 포는 26~35세, 평균 연령은 29.3세였다. 핀챔버 (Finn Chamber)에 준비된 화장품 조성물 1 g을 각각 적하 시 킨 후 시험 부위인 우측상완 내측에 첩포검사를 실시하였다.
- 생약 추출물의 항산화 활성에 대한 연구는 기존에 많은 연구가 수행되었으며 이들의 강한 활성이 보고되어 왔다[8], 본 연구는 노화의 주원인인 활성산소의 소거와 주름 생성에 관여하는 효소인 elastase 효소 억제에 효과를 나타내는 생약재검색을 위하여 동의보감에 의거하여 폐와 피부질환에 관련된 생약재 121종을 대상으로 그들의 MeOH 엑스에 대하여 항산화 활성과 elastase 억제 활성을 검토하였다. 항산화 활성 실험의 양성 대조물로는 ascorbic acid를, elastase 억제 활성 실험의 양성 대조물로는 methoxy succinyl-AlaeAla-Pro-Val-chloromethyl ketoneB와 ursolic acid를 사용하였다.
데이터처리
- Data 분석- 실험은 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 mean ± S.E.로 표시하였으며, Students t-test를 시행하여 pV0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 쥐의 정상 섬유아세포는 본 실험실에서 SD계 rat의 등을 제모, 조직을 적출하여 세포를 분리하여 사용하였다. 기타 세포배양에 필요한 기구는 Falcon사의 제품을 사용하였다.
- 상기시험은 인체 피부 일차 자극시험으로 인체첩포 시험(human patch test)을 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance association, Safety testing guidelines)에 따라 실시하였다. 평소 피부질환 및 알러지가 없는 15명의 피험자(전원 여성)를 대상으로 연령분 포는 26~35세, 평균 연령은 29.
- 핀챔버 (Finn Chamber)에 준비된 화장품 조성물 1 g을 각각 적하 시 킨 후 시험 부위인 우측상완 내측에 첩포검사를 실시하였다. 첩포는 24 h 폐첩포하여 첩포를 제거한 후 펜으로 시험 부위를 마킹하여 1 h, 24 h 후에 각 시험 부위의 피 부반응을 관찰하여 국제 접촉피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG) 의 규정에 따라 판정하였으며 평가는 다음식으로 계산되었다.
성능/효과
- 이는 효능은 탁월하나 제형 적용 및 세포독 성이란 문제점을 지니는 ursolic acid가 가지는 화장품 원료로써의 한계를 새로운 유효성 원료로 교체 극복할 수 있음을 나타낸다. Elastase 억제 활성이 높은 것으로 시 체(-Diospyos kaki\ 비자(Torreya nucifera), 호장(Ry- gonum cuspidatum), 율자피(Castanea crenata), 선학초 (Agrimonia pilosa), 비파엽 (Eriobotrya japonica), 석위 (Pyrrosia Lingua), 마황(Ephedm sinica), ^^(Magnolia officinalis)^ 순으로 총 9종이 선별되었으며, 이 중 2종 즉, 율자피와 석위는 신astase 억제 활성은 있으나 항산화 활성이 다소 낮은 반면 7종은 높은 항산화 활성을 나타내어 항노화와 주름개선에 새로운 향장 소재로써의 가능성을 시사하였다.
- 더 나아가 보다 안전하고 우수한 활성을 나타내는 천연 소재 개발을 위해 세포독성 유무를 관찰하였다(Figure 1). Primary cell culture 방법을 통해 분리된 정상섬유아 세포를 대상으로 5%의 serum을 함유한 배지에서 72 h 배양하여 세포 생존율을 비교한 결과 항노화와 elastase억제 활성을 지니는 농도인 0.1 mg/mL 이하 농도에서는 뚜렷한 독성을 나타내지 않았다.
- 항산화 활성 실험인 SOSA와 DPPH 래디칼 소거작용을 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다. SOSA 결과 오 배자(RHus diinensis), 가자(Terminalia chebula), 자소엽 (Perilla frutescens)과 대황(Rheum palmaturr) 등 종 14종에서 ICso 수치가 100 pg/mL 이하로 양성대 조군(L- ascrobic acid IC50 51.13 ±2.93 ug/mL)과 비교시 비교적 높은 활성을 나타내었으며, DPPH 래디칼 소거능은 마황 (Ephedra sinicd), 비자(Torreya nucifera), 상백피(Morus)와 오배자(RHus chinensis) 4종에서 양성대 조군(L- ascrobic acid IC50 5 ug/mL)보다 높은 활성을 나타내었다.
- 또한, 피부 자극 유무를 관찰하는 방법인 인체 피부 일 차 자극시험법을 수행하였다, 일반적으로 인체 첩포시험은 피부 일차 자극을 평가하는 방법으로 통상 홍반, 부종, 수포 등의 유발 정도를 평가하며 피부 일차 자극 정도를 크게 5 grade로 나누어 평가한 결과 접촉성 피부염을 유발할 확률이 없음을 확인하였다. 따라서 이를 이용하여 성분 규명 등 더 많은 연구가 뒷받침된다면 새로운 향장 소재로써 이용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 그 결과 항노화와 주름개선 효능을 지닐 것으로 사료되는 생약재로 총 9개를 선별하였다. 총 9개의 생약재가 양성대 조군인 methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketoneB (IC50 187.6 + 12.84 ug/mL) 에 비해 높은 활성을 나타내었다. 또한 일부 생약재에선 조 추출물인 MeOH 엑스 상태에서 기존 주름개선에 탁월한 활성을 지닌 단일 물질로 알려진 ursolic acid (IC50 27.
- 적출한 조직을 표피와 진피를 분리한 후, 진피에서 섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다. 확인된 섬유아세포를 DMEM 배지에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% penicillinstreptomycin 가 하여 25 cm2 조직배양 flask 내에서 배양기 내부 공기 5% CO2 농도로 37℃에서 3~5일간 안 정화하였다. 안정화 후 trypsin-EDTA 용액을 처리하여 계대 배양하였으며 초기 계대 세포(passage 3)를 사용하였다.
후속연구
- 또한, 피부 자극 유무를 관찰하는 방법인 인체 피부 일 차 자극시험법을 수행하였다, 일반적으로 인체 첩포시험은 피부 일차 자극을 평가하는 방법으로 통상 홍반, 부종, 수포 등의 유발 정도를 평가하며 피부 일차 자극 정도를 크게 5 grade로 나누어 평가한 결과 접촉성 피부염을 유발할 확률이 없음을 확인하였다. 따라서 이를 이용하여 성분 규명 등 더 많은 연구가 뒷받침된다면 새로운 향장 소재로써 이용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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