본 연구에서는 한방 발효주 주박의 피부 생리 기능 활성을 알아보기 위해 주박 추출물 및 분획물을 준비하고 항산화, 미백 및 주름 개선 효과를 조사하였다. 그 중 한방 발효주 주박의 에틸아세테이트 분획물(KSD E4-3)이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었으며 이는 다양한 약재의 발효에 의한 효과로 사료된다. KSD E4-3은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 KSD E4-3은 피부의 keratinocyte가 생성, 분비하는 MMP-1, -2, -9의 발현을 억제하여 UV 조사에 의한 피부 광노화에 따른 피부 주름 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 한방 발효주 주박에서 추출한 KSD E4-3은 피부 미백 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 한방 발효주 주박의 피부 생리 기능 활성을 알아보기 위해 주박 추출물 및 분획물을 준비하고 항산화, 미백 및 주름 개선 효과를 조사하였다. 그 중 한방 발효주 주박의 에틸아세테이트 분획물(KSD E4-3)이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었으며 이는 다양한 약재의 발효에 의한 효과로 사료된다. KSD E4-3은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 KSD E4-3은 피부의 keratinocyte가 생성, 분비하는 MMP-1, -2, -9의 발현을 억제하여 UV 조사에 의한 피부 광노화에 따른 피부 주름 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 한방 발효주 주박에서 추출한 KSD E4-3은 피부 미백 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
Oriental herbal liquor (Yakju) is a type of Korean traditional alcoholic beverage that uses Nuruk and oriental herbs for fermentation. The purpose of this study was to develop cosmetic ingredients using Jubak, which is a by-product of alcoholic fermentation of oriental herbal liquor. To investigate ...
Oriental herbal liquor (Yakju) is a type of Korean traditional alcoholic beverage that uses Nuruk and oriental herbs for fermentation. The purpose of this study was to develop cosmetic ingredients using Jubak, which is a by-product of alcoholic fermentation of oriental herbal liquor. To investigate antioxidant, whitening, and anti-aging effects of Jubak, we prepared extract of Jubak and its solvent fractions. Ethyl acetate fraction (KSD E4-3) showed the most prominent free radical [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)] scavenging activity ($SC_{50}$: 0.75 mg/mL). KSD E4-3 significantly inhibited in vitro mushroom tyrosinase activity ($IC_{50}$: 0.82 mg/mL) and reduced the melanin contents in mouse melanoma melanocyte, B16F10 cells. KSD E4-3 down-regulated protein expression of tyrosinase related proteins (TRP)-1, -2, which play key roles in melanogenesis. For anti-aging effects, inhibition of matrix metalloproteinase (MMPs) expression was evaluated using human keratinocyte, HaCaT cells. Treatment of HaCaT cells with KSD E4-3 reduced expression of MMP-1, -2, -9 and inhibited proteolytic activities of MMP-2, -9. These results suggest that KSD E4-3 induces down-regulation of cellular melanogenesis and protects against photoaging induced by UVB-induced damage. Thus KSD E4-3 could potentially be a valuable cosmetic ingredient.
Oriental herbal liquor (Yakju) is a type of Korean traditional alcoholic beverage that uses Nuruk and oriental herbs for fermentation. The purpose of this study was to develop cosmetic ingredients using Jubak, which is a by-product of alcoholic fermentation of oriental herbal liquor. To investigate antioxidant, whitening, and anti-aging effects of Jubak, we prepared extract of Jubak and its solvent fractions. Ethyl acetate fraction (KSD E4-3) showed the most prominent free radical [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)] scavenging activity ($SC_{50}$: 0.75 mg/mL). KSD E4-3 significantly inhibited in vitro mushroom tyrosinase activity ($IC_{50}$: 0.82 mg/mL) and reduced the melanin contents in mouse melanoma melanocyte, B16F10 cells. KSD E4-3 down-regulated protein expression of tyrosinase related proteins (TRP)-1, -2, which play key roles in melanogenesis. For anti-aging effects, inhibition of matrix metalloproteinase (MMPs) expression was evaluated using human keratinocyte, HaCaT cells. Treatment of HaCaT cells with KSD E4-3 reduced expression of MMP-1, -2, -9 and inhibited proteolytic activities of MMP-2, -9. These results suggest that KSD E4-3 induces down-regulation of cellular melanogenesis and protects against photoaging induced by UVB-induced damage. Thus KSD E4-3 could potentially be a valuable cosmetic ingredient.
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문제 정의
우리나라 대표 발효주인 막걸리는 피부 생리활성 효능이 확인되어 산업적으로 이용되고 있으나(10,11), 한약재를 함께 적용한 한방 발효주에 대한 체계적인 연구는 현재까지는 미비한 실정이다. 미백, 항산화, 항노화 효과가 있는 한약재를 이용하여 발효주를 만들면 기존의 발효주보다 피부의 기능 활성에 도움을 주는 생리활성물질이 풍부할 것으로 예상되며, 본 연구에서는 12가지 한약재가 첨가된 전통 한방 발효주 제조과정에서 생기는 부산물인 주박을 이용하여 추출물 및 분획물을 제조하고, 이를 화장품 소재로 활용하기 위하여 피부 미백 및 주름에 미치는 영향을 평가하였다.
본 연구에서는 한방 발효주 주박의 피부 생리 기능 활성을 알아보기 위해 주박 추출물 및 분획물을 준비하고 항산화, 미백 및 주름 개선 효과를 조사하였다. 그 중 한방 발효주 주박의 에틸아세테이트 분획물(KSD E4-3)이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었으며 이는 다양한 약재의 발효에 의한 효과로 사료된다.
제안 방법
활성 산소종은 피부노화의 원인으로 인체 내 지질, 단백질 등과 반응하여 생체의 노화를 촉진시킨다. DPPH radical 소거법은 항산화 물질의 전자 공여능을 이용한 항산화 측정법으로 이 방법을 이용하여 전통 한방 발효주 주박 분획물의 항산화 효과를 살펴보았다. 3개의 한방 발효주 주박 분획물은 항산화력을 나타냈으며 그중 에틸아세테이트 분획물인 KSD E4-3은 5 mg/mL에서 95.
HaCaT를 1×106 cells/mL가 되도록 60 mm cell culture dish에 분주하여 24시간 배양 후 UVB 20 mJ/cm2를 조사하고 KSD E4-3을 처리하여 24시간을 배양하였다.
Tyrosinase 저해 활성 측정은 No 등(13)의 방법을 변형하여 측정하였다. 반응구는 0.
UVB 20 mJ/cm2를 조사하고 KSD E4-3을 처리하여 24시간을 배양하였다. 세포를 회수한 후 lysis buffer를 첨가하여 얻은 단백질을 Bradford법(14)을 이용하여 정량하였다.
효모, 곰팡이, 유산균 등 유익한 미생물에 의한 발효공정은 천연물의 독성을 낮추거나 새로운 물질을 생성 또는 유효물질을 전환하여 생리활성을 증가시켜 이를 통한 기능성 향상 연구가 시도되고 있다(16). 따라서 Ahn 등(17)의 연구 결과와 같이 발효 및 추출에 의해 기존 천연물이 가지고 있는 유효성분 및 생리활성물질의 수율이 극대화 또는 새로 생성되어 이러한 효과가 나타나는 것이라 생각되며, 이후 실험에서는 항산화 효과가 높은 KSD E4-3을 이용하여 실험하였다.
4A). 또 UV 조사 하에서 KSD E4-3이 keratinocytes인 HaCaT 세포주가 분비하는 MMP-2와 MMP-9에 미치는 영향을 zymography로 평가하였다. KSD E4-3은 MMP-2와 MMP-9의 효소적 활성을 저해하였으며(Fig.
단백질 20 μg을 10% SDS-PAGE에 전기영동을 수행하고 gel의 단백질을 PVDF membrane으로 이동시킨 후 5% non-fat milk로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고 primary antibody(MMP-1, -2, -9, TRP-1, -2)를 가하여 4℃에서 overnight 시켰다. 마지막으로 PVDF membrane을 0.1% TBST로 세척하고 secondary antibody conjugated-HRP를 희석하여 상온에서 1시간 동안 교반하고 enhanced chemiluminescence detection kit를 사용하여 단백질을 확인하였다.
2). 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트를 이용하여 KSD E4-3이 세포에서 멜라닌 형성을 저해하는지 살펴보았다. B16F10 cells에 ɑ-MSH와 KSD E4-3을 처리한 후 세포 내 멜라닌 양을 측정한 결과, KSD E4-3은 농도 의존적으로 melanin 합성을 저해하였으며 200 mg/mL에서 30.
를 조사하고 KSD E4-3을 처리하여 24시간을 배양하였다. 배지를 수거하여 3,000 rpm에서 30분 원심분리를 수행하고 Bradford법을 이용하여 단백질의 양을 정량하여 10% SDSPAGE(1 mg/mL gelatin 함유)에서 전기영동 수행 후, 0.1% triton-X로 30분씩 2번 세척한 다음 developing buffer를 넣어 30℃에서 18시간 동안 반응시키고 Coomassie Blue로 염색을 하여 관찰하였다.
대상 데이터
Fetal bovine serum(FBS), Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), penicillin, streptomycin, trypsin-EDTA 는 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
본 연구에는 자사(국순당)에서 생산하여 시중에 유통 중인 전통 한방 발효주 생산 과정에서 발생하는 주박을 이용하여 실험하였다. 이 전통 한방 발효주는 분쇄한 쌀에 누룩과 효모, 12가지(구기자, 감초, 오미자, 하수오, 홍삼, 산수유, 맥문동, 산사육, 진피, 고수, 건강, 수국) 한약재를 첨가하여 발효 과정을 거친 한방 발효주이다.
2, Whatman, Piscataway, NJ, USA)로 거른 후 55℃에서 감압 건조하여 전통 한방 발효주 주박의 유기용매 분획물을 준비하였다. 시료는 DMSO에 적당한 농도로 녹여 활성 평가에 사용하였다.
이 전통 한방 발효주는 분쇄한 쌀에 누룩과 효모, 12가지(구기자, 감초, 오미자, 하수오, 홍삼, 산수유, 맥문동, 산사육, 진피, 고수, 건강, 수국) 한약재를 첨가하여 발효 과정을 거친 한방 발효주이다. 전통 한방 발효주 주박에 95% 에탄올을 가하여 3일간 교반 후 1차 추출하여 KSD E4-1 샘플을 준비하고, 이를 n-헥산으로 분획하여 KSD E4-2 샘플을 준비하며, 다시 에틸아세테이트로 분획하여 KSD E4-3 샘플을 준비하였다. 각 샘플을 여과지(Filter paper No.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복실험을 실시하였으며 각 시료들의 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험 결과의 통계적 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student's t-test에 의하여 판정하였으며 P 값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
광노화된 피부에서는 교원질을 분해하는 MMP-1, -2, -9와 같은 MMPs의 발현 증가로 교원질의 양이 감소되어 주름이 형성된다(27). KSD E4-3이 UV에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 수행하였다. 그 결과 KSD E4-3은 농도 의존적으로 MMP-1의 발현 저해 효과를 나타내었다(Fig.
를 조사하고 KSD E4-3을 처리하여 24시간을 배양하였다. 세포를 회수한 후 lysis buffer를 첨가하여 얻은 단백질을 Bradford법(14)을 이용하여 정량하였다. 단백질 20 μg을 10% SDS-PAGE에 전기영동을 수행하고 gel의 단백질을 PVDF membrane으로 이동시킨 후 5% non-fat milk로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고 primary antibody(MMP-1, -2, -9, TRP-1, -2)를 가하여 4℃에서 overnight 시켰다.
3A). 이러한 결과가 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 TRP-1, TRP-2의 항체를 이용한 western blot을 실시하였다. KSD E4-3은 TRP-1과 TRP-2의 단백질 발현을 저해하였다(Fig.
항산화 활성은 DPPH를 이용하여 시료의 라디칼 소거 효과를 측정하는 Blois법(12)을 활용하였다. 추출물 0.
성능/효과
DPPH radical 소거법은 항산화 물질의 전자 공여능을 이용한 항산화 측정법으로 이 방법을 이용하여 전통 한방 발효주 주박 분획물의 항산화 효과를 살펴보았다. 3개의 한방 발효주 주박 분획물은 항산화력을 나타냈으며 그중 에틸아세테이트 분획물인 KSD E4-3은 5 mg/mL에서 95.5%, 1 mg/mL에서 67.3%(SC50: 0.75 mg/mL)의 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 이때 positive control로 사용한 ascorbic acid는 0.
멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트를 이용하여 KSD E4-3이 세포에서 멜라닌 형성을 저해하는지 살펴보았다. B16F10 cells에 ɑ-MSH와 KSD E4-3을 처리한 후 세포 내 멜라닌 양을 측정한 결과, KSD E4-3은 농도 의존적으로 melanin 합성을 저해하였으며 200 mg/mL에서 30.3%, 100 mg/mL에서 25.8%의 melanin 합성 저해력을 나타내었다(Fig. 3A). 이러한 결과가 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 TRP-1, TRP-2의 항체를 이용한 western blot을 실시하였다.
또 UV 조사 하에서 KSD E4-3이 keratinocytes인 HaCaT 세포주가 분비하는 MMP-2와 MMP-9에 미치는 영향을 zymography로 평가하였다. KSD E4-3은 MMP-2와 MMP-9의 효소적 활성을 저해하였으며(Fig. 4B), western blot analysis를 통해 세포 내 단백질 발현에 미치는 영향을 평가한 결과, KSD E4-3은 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현을 농도 의존적으로 저해하였다(Fig. 4C). KSD E4-3은 노화가 진행되면서 피부 탄력을 유지하는 구성단백질 파괴에 관여하는 MMPs의 효소적 활성과 발현을 저해하는 것을 확인하였다.
KSD E4-3은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다.
4C). KSD E4-3은 노화가 진행되면서 피부 탄력을 유지하는 구성단백질 파괴에 관여하는 MMPs의 효소적 활성과 발현을 저해하는 것을 확인하였다. 이는 KSD E4-3이 피부 탄력을 유지하여 노화에 따른 주름 생성을 억제할 수 있는 가능성이 높을 것으로 사료된다.
KSD E4-3이 UV에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 수행하였다. 그 결과 KSD E4-3은 농도 의존적으로 MMP-1의 발현 저해 효과를 나타내었다(Fig. 4A). 또 UV 조사 하에서 KSD E4-3이 keratinocytes인 HaCaT 세포주가 분비하는 MMP-2와 MMP-9에 미치는 영향을 zymography로 평가하였다.
또한 TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)를 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 산화시키고, TRP-2는 dopachrome을 DHICA로 이성화시켜 멜라닌 형성에 관여한다(19). 기질인 L-tyrosine과 효소인 mushroom tyrosinase에 의해 산화되어 생성되는 멜라닌의 흡광도 측정을 통해 KSD E4-3의 tyrosinase 저해 활성을 알아본 결과, KSD E4-3은 농도 의존적으로 tyrosinase 저해 활성을 나타내었으며 1 mg/mL에서 65.3%의 저해력을 나타내었다(Fig. 2). 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트를 이용하여 KSD E4-3이 세포에서 멜라닌 형성을 저해하는지 살펴보았다.
또한 실험에 사용한 한방 발효주의 약재에는 구기자, 감초 등 미백, 항산화 효과가 우수한 약재들이 포함되어 있다(21-25). 따라서 KSD E4-3의 tyrosinase 활성 저해와 TRP-1과 TRP-2의 발현 저해를 통한 melanin 생합성 저해 효과는 약재에서 유래된 다양한 유효성분이 발효에 의해 증강된 효과라 사료된다.
KSD E4-3은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 KSD E4-3은 피부의 keratinocyte가 생성, 분비하는 MMP-1, -2, -9의 발현을 억제하여 UV 조사에 의한 피부 광노화에 따른 피부 주름 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이상 의 결과를 종합하면 한방 발효주 주박에서 추출한 KSD E4-3은 피부 미백 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
후속연구
또한 KSD E4-3은 피부의 keratinocyte가 생성, 분비하는 MMP-1, -2, -9의 발현을 억제하여 UV 조사에 의한 피부 광노화에 따른 피부 주름 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이상 의 결과를 종합하면 한방 발효주 주박에서 추출한 KSD E4-3은 피부 미백 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
주박이란 무엇인가?
주박은 쌀, 물, 누룩, 효모를 이용한 전통주 발효 과정을 거쳐 약주나 탁주를 거르고 남은 양조부산물로 원료 쌀의약 20% 정도로 발생하며, 전분과 단백질 이외에도 섬유소, 무기질, 비타민, 알코올과 유기산, 효소, 효모 등의 영양성분과 유용 생리활성 성분을 다량 함유하고 있는 것으로 보고되어 있다(6,7). 실제로 쌀을 주원료로 사용하는 탁주 주박의 경우 식량이 부족했던 시절에 대체 식량으로 이용된 바 있으며, 최근에는 화장품 소재로도 각광받고 있다.
멜라닌 생합성에 관여하는 효소로 알려진 것은?
멜라닌 생합성에 관여하는 효소로 tyrosinase, TPR-1, TRP-2가 잘 알려져 있다. Tyrosinase는 피부 기저층에 있는 melanocyte의 melanosome에서 L-tyrosine과 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)을 기질로 하여 피부의 색소 성분인 melanin을 생합성하는 핵심 효소이다(18).
한방 발효주 주박의 에틸아세테이트 분획물이 melanin 생합성을 저해하는 원리는?
그 중 한방 발효주 주박의 에틸아세테이트 분획물(KSD E4-3)이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었으며 이는 다양한 약재의 발효에 의한 효과로 사료된다. KSD E4-3은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 KSD E4-3은 피부의 keratinocyte가 생성, 분비하는 MMP-1, -2, -9의 발현을 억제하여 UV 조사에 의한 피부 광노화에 따른 피부 주름 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
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