The methanol extract of Houttuynia cordata repressed the expression of tyrosinase gene of Bl6 mouse melanoma cell containing tyrosinase promoter. The extract repressed expression of tyrosinase gene by about 13$\%$ and 45$\%$ at 10$\mu$g/mL and 100 $\mu$g/m...
The methanol extract of Houttuynia cordata repressed the expression of tyrosinase gene of Bl6 mouse melanoma cell containing tyrosinase promoter. The extract repressed expression of tyrosinase gene by about 13$\%$ and 45$\%$ at 10$\mu$g/mL and 100 $\mu$g/mL, respectively. In the MTT assay, the same extract exhibited very low cytotoxicity at 1$\mu$g/mL, 10$\mu$g/mL, and 100 $\mu$g/mL, respectively. The fractions of ethyl acetate, butyl alcohol, and water did not showed the repressive effect on the expression of tyrosinase gone, but methylene chloride fraction layer repressed highly at 10$\mu$g/mL and 100$\mu$g/mL.
The methanol extract of Houttuynia cordata repressed the expression of tyrosinase gene of Bl6 mouse melanoma cell containing tyrosinase promoter. The extract repressed expression of tyrosinase gene by about 13$\%$ and 45$\%$ at 10$\mu$g/mL and 100 $\mu$g/mL, respectively. In the MTT assay, the same extract exhibited very low cytotoxicity at 1$\mu$g/mL, 10$\mu$g/mL, and 100 $\mu$g/mL, respectively. The fractions of ethyl acetate, butyl alcohol, and water did not showed the repressive effect on the expression of tyrosinase gone, but methylene chloride fraction layer repressed highly at 10$\mu$g/mL and 100$\mu$g/mL.
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문제 정의
본 연구에서는 유전자 발현 조절 수준에서 멜라닌 색소 생합성 억제물질을 탐색하고자 다양한 효능. 효과를 지닌 어성 초로부터 유용성 물질을 추출.
제안 방법
B16 mouse melanoma cell 내에 tyrosinase 프로모터가 삽입된 유전자를 도입하기 위해 LipofectAMINE(Life Tech nologies Inc.)을 이용한 다음과 같은 방법으로 stable trans-fection을 실시하였다.
질 전환을 실시하였다. Plasmid DNA는 luciferase gene 을지 닌pGL2-vector(Promega)-^ Sami site에 L5 Kb의 neo mycin 저항성 유전자를 삽입한 다음 1 Kb의 사람 tyrosinase 프로모터를 EcoRI/Kpnl site에 클로닝을 하였다.
되게 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각각의 well에 어성초 메탄올 추출물과 용매분획물을 1 Ug/ mL, 10 Ug/mL, 100 Ug/mL, 500 ㎍/mL의 농도로 6시간 동안 처리한 다음 luciferase 활성도를 측정하여 tyrosinase 유전자 발현에 미치는 효과를 조사하였다.
분말로 된 추출물 및 분획물 100mg에 에탄올과 디메 칠설퍼옥사이드(dimethyl sulfoxide)가 1:1로 혼합된 용매 1 mL 씩을 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 tyrosinase 유전자 발현율과 세포독성 측정에 이용하였다.
효과를 지닌 어성 초로부터 유용성 물질을 추출. 분획하여 형질전환된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 tyrosinase 유전자의 발현 및 세포독성에 미치는 효과를 조사하였다.
세포 내 유전자 도입 : B16 mouse melanoma c이1을 RPMI Medium 1640평 판 배지 에 세포수가 3〜4x10, 이되도록 접종한 후 24시간 배양한 다음, 배양액 1 mL에 6 HL lipofect- amine과 2 卩g의 total plasmid DNA를 5시간 처리 함으로써 형 질 전환을 실시하였다. Plasmid DNA는 luciferase gene 을지 닌pGL2-vector(Promega)-^ Sami site에 L5 Kb의 neo mycin 저항성 유전자를 삽입한 다음 1 Kb의 사람 tyrosinase 프로모터를 EcoRI/Kpnl site에 클로닝을 하였다.
세포 내 유전자 도입을 통해 얻은 B16 mouse melanoma cell의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 luciferase 활성도를 측정 하였다. 형 질전환을 통하여 얻은 콜로니들을 trypsin-EDTA를 처리하여 떼어낸 후 24 well plate에 세포수가 well 당 6X102되게 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
시료의 추출은 건조된 생약을 세절하여 0.1 kg씩을 취한 다음 메탄올을 가하여 실온에서 1주일 동안 정치시킨 후 3회 추출 . 여과하였다.
건조시킨후 분말 형태로 제조하였다. 용매분획은 농축된 메탄올 추출물을 증류수로 현탁한 다음, 극성도가 다른 methylene chlo ride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물을 이용하여 4개의 층으로 분획하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 농축하였다. 그리고, 이 농축물은 동결.
4)으로 세척 한 다음 1% triton X-100, 2 mM EDTA, 그리고 2 mM dithio-threitol이 함유되어 있는 pH 78의 25 mM tris-phosphate 완충용액으로 용해 하였다. 용해된 세포들을 취하여 원심분리한 다음 얻어진 상 등액에 대해 luminometer(Lumat LB 9507, Berthold)를 이용하여 luciferase 활성도를 측정 하였으며 luciferase 활성도가 가장 높게 나타난 B16 mouse mel anoma cel1을 선별하여 이용하였다.
형질전환된 세포의 선별 : Stable transfection 처리 5시간 후 B16 mouse melanoma cell로부터 Lipofectamine 시약과 재조합된 DNA가 함유된 배지를 제거한 후 콜로니가 형성될 때까지 Geneticin(600 ㎍/mL)이 들어있는 선택 배지에서 배양한 후 형질 전환 된 B16 mouse melanoma cell을 선별 하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 어성초는 2004년 9월 전남 보성 삼백초 영농조합법인에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며, 표준품은 동강대학 향토산업지원센터에 보관하였다.
이론/모형
Then, the cells were solubilized with lysis buffer and cen trifuged at 13, 000 ×g for 2 ~3 min. The supernatants were used for luciferase assay. Values are the means of results from trip licate experiments.
2 X104 되게 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후 어 성초 메탄올 추출물을 각각의 well 에 1 Ug/mL, 10 Hg/mL, 100 Ug/mL, 그리고 500 iJg/mL의 농도로 6시간 동안 처리한 다음 Mosmann(25)의 방법에 따라 MTT assay를 실시하여 세포독성을 평가하였다.
성능/효과
Butyl alcohol과 물분획 물은 tyrosinase 유전자의 발현을 억 제하는 효과가 없었지 만 methylene chloride 분획 물은 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었으며, 특히 methylene chloride 분획물은 10 Ug/mL와 100 Ug/mL의 농도에서 각각 약 82%와 48%의 발현율을 나타냄으로써 대조군에 비해 tyrosinase 유전자의 발현을 크게 억제하였다.
그러나 500 Ug/mL의 농도에서 는 세포가 분해될 정도로 심한 세포독성을 나타내 tyrosinase 유전자의 발현율 측정이 불가능하였다. Ethyl acetate 용매로 분획하여 얻은 어성초 추출물은 100 lig/mL 이 하의 저 농도에 서 는 tyrosinase 유전자의 발현을 억 제하는 효과가 없었지만 500 Hg/mL의 고농도에서 는 tyrosinase 유전자의 발현을 억 제 하는 효과를 보여주었다. 한편, butyl alcohol과 물 용매로 분획하여 얻은 어성초 추출물은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 것과는 달리 100 Mg/mL의 저농도에서 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하기보다는 오히려 약 10-20% 정도 증진시키는 효과를 나타내었다.
오늘날까지 멜라닌 색소의 생합성을 억제하기 위한 한방법으로 tyrosinase 효소의 활성을 중심으로 이를 저해하는 천연물에 대한 연구들이 매우 활발하게 이루어져 왔다. 그 결과 많은 식물 및 해조류들이 tyrosinase 활성 저해 효과가 있는 것으로 보고되었으며(5- 9), 또한 그 식물들로부터 tyrosinase 활성 저해 효과가 있는 성분들이 분리되었다 (10T4). 그러나 이러한 연구들의 대부분은 tyrosinase 효소의 활성 저해에 대한 연구로서 멜라닌 색 소의 생합성 억제 효과가 낮고 지속성 이 짧다는 단점 이 있다.
한편, butyl alcohol과 물 용매로 분획하여 얻은 어성초 추출물은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 것과는 달리 100 Mg/mL의 저농도에서 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하기보다는 오히려 약 10-20% 정도 증진시키는 효과를 나타내었다. 그러나 이분획 물들은 500 Jig/mL의 농도로 처리하였을 때만 대조군에 비해 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과를 보여주었으며, 이때의 세포 독성은 매우 낮게 나타났다. 이와 같이 용매분획을 통하여 얻은 어성 초추출물들의 tyrosinase 유전자의 발현 억제 효과는 주로 methylene chloride 용매 분획층에서 만 볼 수 있었으며, 그의 효과는 메탄올 추출물과 유사하였다.
극성 도가 낮은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 어성초 추출물은 10 Ug/mL와 100 Ug/mL의 농도에서 각각 약 18% 와 52%의 tyrosinase 유전자의 발현 억제 효과를 보여주었다. 그러나 500 Ug/mL의 농도에서 는 세포가 분해될 정도로 심한 세포독성을 나타내 tyrosinase 유전자의 발현율 측정이 불가능하였다.
멜라닌 색소 생성에 관여하는 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 물질을 탐색하고자 tyrosinase 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 어성초 메탄올 주출물을 처리한 결과 메탄올 추출물은 10 Hg/mL와 100 Ug/mL의 농도에서 대조군에 비해서 약 13%와 45%의 억제 효과를 나타냈으며, 세포 생존율은 1 Hg/mL, 10 Ug/mL, 100 Ug/mL의 농도에서 약 104%, 101%, 74%로서 세포독성이 낮게 나타났다. Butyl alcohol과 물분획 물은 tyrosinase 유전자의 발현을 억 제하는 효과가 없었지 만 methylene chloride 분획 물은 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내었으며, 특히 methylene chloride 분획물은 10 Ug/mL와 100 Ug/mL의 농도에서 각각 약 82%와 48%의 발현율을 나타냄으로써 대조군에 비해 tyrosinase 유전자의 발현을 크게 억제하였다.
1). 어 성 초 메탄올 추출물을 각각 10 IJg/mL와 100Ug/mL의 농도를 달리하여 형질 전환된 세포에 처리하였을 때 유전자 발현 억제 효과는 대조군에 비해 각각 약 13%와 45%로서 추출물의 농도에 비례하는 경향을 나타냈다. 이는 tyrosinase 효소 활성 저해 효과가 있다고 알려진 인진쑥은 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하기 보다는 증진시키는 결과를 나타내었지 만(16), 어 성 초 메탄올 추출물은 Cho 등(17) 에 의 해 보고된 양파 추출물과 같이 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과를 보여주었다.
2). 어 성초 메탄올 추출물을 처리 하였을 때 농도의 증가에 세포의 생존율이 감소하는 결과를 보여주었으나 1 Ug/mL, 10 lig/mL, 그리고 100 lig/mL의 농도로 처리하였을 때 각각 약 104%, 101%, 74%로 매우 낮은 세포독성을 나타내었다. 그러나 500 pg/ mL의 농도로 처리하였을 때 세포의 생존율이 대조군에 비해 각각 약 9% 이하로서 매우 높은 세포독성을 나타내 측정이 어려웠다.
어성초 메탄올 추출물의 tyrosinase 유전자 발현 효과 세포 내 유전자 도입을 통하여 제조된 B16 mouse mel anoma cell에 어성초 메탄올 추출물을 처리하여 tyrosinase 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 어성초 메탄올 추출물은 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타냈다(Fig. 1). 어 성 초 메탄올 추출물을 각각 10 IJg/mL와 100Ug/mL의 농도를 달리하여 형질 전환된 세포에 처리하였을 때 유전자 발현 억제 효과는 대조군에 비해 각각 약 13%와 45%로서 추출물의 농도에 비례하는 경향을 나타냈다.
형질전환된 B16 mouse melanoma cell에 각각의 어성초 용매 분획물을 처리한 바 tyrosinase 유전자의 발현율은 용매 분획물에 따라 다양한 결과를 나타냈다(Table 1). 극성 도가 낮은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 어성초 추출물은 10 Ug/mL와 100 Ug/mL의 농도에서 각각 약 18% 와 52%의 tyrosinase 유전자의 발현 억제 효과를 보여주었다.
후속연구
본 연구에서 어성초 추출물 내에는 멜라닌 색소 생합성에 관여하는 효소 tyrosinase 유전자의 발현을 억제하는 효과가 높은 성분도 함유하고 있다는 것이 확인되었으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 어성초 추출물이 피부를 희고 아름답게 가꾸어주는 미백 화장품 및 의약품의 천연원료로서 보다 널리 이용될 것으로 기대된다.
참고문헌 (25)
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