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문제 정의
- SOD 활성은 첨가된 tocotrienol의 양에 의존적으로 증가하지만 높은 농도의 tocotrien이의 첨가는 배양되는 세포에 이차적인 변화를 유발시키므로 본 실험에서는 형태적 변화가 가장 미미한 농도에서의 영향을 조사하였다. Tocotrienol을 처리하였을 때 SOD의 활성은 fibroblaste hepatocyte 모두에서 10 ~25% 가량 증가하는 것으로 나타났으나(Fig.
- 본 연구에서는 미강에 함유된 tocotrienol의 생리활성을 알아보기 위하여 몇 가지 항산화 관련 실험을 수행하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 특히 fibroblast는 배양도중 생길 수 있는 세포의 변화를 막기 위하여 5 X 105의 농도를 넘지 않는 조건에서 실험을 수행하였다. Subculture를 위하여 충분히 자란 세포의 배양액을 제거하고 0.25% trypsin, 0.02% EDTA 용액을 37℃에서 3~5분 정도처리하여 세포를 부유시킨 뒤 배양액을 넣어 원심분리를 통하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포는 다시 배양액을 적당량 넣고 culture dish에 분주하였다.
- Tocotrienol 처리에 의한 세포내의 단백질 발현 양상을 조사하기 위하여 2-D 전기영동을 실시하였다. 지름 10 mm의 culture dish에 인간 fibroblast cell을 배양하면서 여러 농도의 tocotrienol# 처리하여 일정 시간 배양하고, trypsin 처리를 통하여 세포를 수획하였다.
- Tocotrienol의 항산화 효과는 DPP너(IJ-diphenyl-Apicryl-hydrazyl)를 기질로 이용한 radical scavenging 활성을 측정함 으로써 판단하였다. Methanol로 정용된 tocotrienol을 여러 농 도로 희석하고 1.
- 2 M sucrose)속에서 sonication으로 파괴하였다. 그 이후 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출물을 얻고 항산화 관련 효소활성을 측정하였다.
- Tocotrienole 세포 내 여러 유전자 발현의 변화를 유발한다. 는 보고가 있으므로 본 연구에서는 배양된 fibroblast에 tocotrienol을 처리하여 반응시킨 후, 세포 추출물을 획득하여 2-D 전기영동을 실시함으로써 발현된 단백질의 양상을 비교하였다(Fig. 3).
- 1과 같다. 미강에서 고농도로 정제된 tocotrienol을 methanol로 정용하여 methanol로 희석하여 DPPH와 강력하게 혼합하고, DPPH의 산화현상을 Shimazu spectrophotometer 520 nm 흡광도로 측정하였다. 이때 DPPH의 산화현상은 첨가된 DPPH의 농도에 따라 의존적으로 감소하였으며, 낮은 농도에서도 매우 높은 항산화력을 가지는 것으로 나타났다.
- 1 mL의 세포 추출물을 넣고 3TC에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 1 mM H2O2를 첨가하여 340nm에서 홉광도를 읽고 NADPH oxidation을 측정하였다.
- 001% bromophenol blue)에 녹여서 sonication으로 세포를 파괴하고 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이것을 11 cm의 IPG strip을 이용하여 8, 000V의 전압으로 5시간동안 PROTEAN IEF Cell(Bio-Rad)에서 isoelectric fbcusing을 실시한 후, second dimension(SDS・PAGE)를 위하여 isoelectric R)cusing한 strip 을 equilibration buffer(6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris, pH 8.8, 20% glycerol, 130 mM iodoacetamide)로 15분간 반응시키고 12.5% SDS-polyaciylamide gel 전기영동을 실시하였다. 전기영동한 gele 보다 미량의 단백질 발현양상을 분석하기 위하여 silver staining.
- 침전된 세포는 다시 배양액을 적당량 넣고 culture dish에 분주하였다. 이후 약 5 x 105 세포수의 culture plate에 tocotrienol의 농도를 변화시키며 처리하여 일정 시간 배양하고 여러가지 방법을 통하여 tocotrienol의 활성과 기능을 분석하였다.
- Tocotrienol 처리에 의한 세포내의 단백질 발현 양상을 조사하기 위하여 2-D 전기영동을 실시하였다. 지름 10 mm의 culture dish에 인간 fibroblast cell을 배양하면서 여러 농도의 tocotrienol# 처리하여 일정 시간 배양하고, trypsin 처리를 통하여 세포를 수획하였다. 원심분리로 침전된 세포를 PBS로 씻어주고 250μL의 Rehydration buffer(8 M urea, 0.
- 배양하는 동안 conHuency를 막기 위하여 지름 10cm culture plate 당 5 x 10, ~1 x 106 세포수를 유지하며 매 46시간 배양액을 교환하였다. 특히 fibroblast는 배양도중 생길 수 있는 세포의 변화를 막기 위하여 5 X 105의 농도를 넘지 않는 조건에서 실험을 수행하였다. Subculture를 위하여 충분히 자란 세포의 배양액을 제거하고 0.
대상 데이터
- 본 연구 수행을 위한 시료는 (주)세림현미로부터 hexane으 로 추출된 crude oil을 제공받아 pilot 규모에서 농축시킨 후 사용하였다. 먼저 hexane 추출 crude oil 1.
- 인간 skin Hbroblast(Dempsy)와 hepatocarcinoma(SNU-182)를 각각 10%의 bovine fetal serum, 1 mM glutamine, 100 unit/mL penicillin, 100 gg/mL streptomycin이 함유된 RMPI1640 배양액에서 5% CO2를 유지하며 37℃에서 단일층(monolayer)으로 배양하였다. 배양하는 동안 conHuency를 막기 위하여 지름 10cm culture plate 당 5 x 10, ~1 x 106 세포수를 유지하며 매 46시간 배양액을 교환하였다.
이론/모형
- SOD 활성은 nitroblue tetrazolium(NBT) 방법을 이용하였다. NBT는 산소 존재 시 푸른색으로 환원되어 560 nm에서 흡광을 띄는데 SOD는 이 반응을 억제한다.
성능/효과
- SOD 활성 측정과 유사한 방법으로 tocotrienol에 의한 GPX의 활성변화를 측정한 결과(Fig. 2B) fibroblast와 hepatocyte 모두 GPX의 활성이 tocotrienol에 의하여 증가하였으며, 특히 hepatocyte의 경우 최대 2배까지 활성이 증가하였다. Tocotrienol을 처리하지 않은 fibroblast의 GPX 활성은 12 ±1.
- SOD 활성은 첨가된 tocotrienol의 양에 의존적으로 증가하지만 높은 농도의 tocotrien이의 첨가는 배양되는 세포에 이차적인 변화를 유발시키므로 본 실험에서는 형태적 변화가 가장 미미한 농도에서의 영향을 조사하였다. Tocotrienol을 처리하였을 때 SOD의 활성은 fibroblaste hepatocyte 모두에서 10 ~25% 가량 증가하는 것으로 나타났으나(Fig. 2A) 그 효과는 크지 않은 것으로 사료되었다.
- 이때 DPPH의 산화현상은 첨가된 DPPH의 농도에 따라 의존적으로 감소하였으며, 낮은 농도에서도 매우 높은 항산화력을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 tocotrienole 항산화력이 높음을 알 수 있었다.
- 8 U/mg으로 증가하였다. 따라서 본 결과에 의하면 tocotrienole 정상세포 및 암세포의 항산화 활성을 증가시키며 이러한 활성은 SOD 보다는 GPX의 활성에 영향을 더 크게 받는 것으로 판단되었다.
- 미강으로부터 정제된 tocotrienole DPPH를 기질로 확인한 결과 매우 뛰어난 항산화력을 가지는 것으로 판명되었다. 또한 정상세포와 암세포를 배양하면서 tocotrienol을 처리하고 세 포내의 항산화에 가장 큰 역할을 하는 superoxide dismutase 와 glutathione peroxidase 활성을 측정한 결과 두 효소 모두 tocotrienol에 의하여 활성이 증가되는 것을 볼 수 있었으며, 전체적으로 암세포에서 GPX가 SOD보다 더 민감하게 증가함을 알 수 있었다.
- 미강으로부터 정제된 tocotrienole DPPH를 기질로 확인한 결과 매우 뛰어난 항산화력을 가지는 것으로 판명되었다. 또한 정상세포와 암세포를 배양하면서 tocotrienol을 처리하고 세 포내의 항산화에 가장 큰 역할을 하는 superoxide dismutase 와 glutathione peroxidase 활성을 측정한 결과 두 효소 모두 tocotrienol에 의하여 활성이 증가되는 것을 볼 수 있었으며, 전체적으로 암세포에서 GPX가 SOD보다 더 민감하게 증가함을 알 수 있었다.
- 세포 주줄물을 pH 3~10으로 isoelectric focusing을 하고 12.5%의 SDS-PAGE(polyacrylamide electrophoresis)를 수행한 결과, tocotrienol의 처리 농도가 증가할수록 몇몇 단백질들의 발현이 증가되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 보다 정밀한 분석을 위하여 추후 발현의 변화를 보이는 단백질들을 선별하여 추출하고, N-termianl sequencing이나 MALDI-TOF 등을 통하여 이들을 규명하여야 할 것으로 판단된다.
- 미강에서 고농도로 정제된 tocotrienol을 methanol로 정용하여 methanol로 희석하여 DPPH와 강력하게 혼합하고, DPPH의 산화현상을 Shimazu spectrophotometer 520 nm 흡광도로 측정하였다. 이때 DPPH의 산화현상은 첨가된 DPPH의 농도에 따라 의존적으로 감소하였으며, 낮은 농도에서도 매우 높은 항산화력을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 tocotrienole 항산화력이 높음을 알 수 있었다.
후속연구
- 5%의 SDS-PAGE(polyacrylamide electrophoresis)를 수행한 결과, tocotrienol의 처리 농도가 증가할수록 몇몇 단백질들의 발현이 증가되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 보다 정밀한 분석을 위하여 추후 발현의 변화를 보이는 단백질들을 선별하여 추출하고, N-termianl sequencing이나 MALDI-TOF 등을 통하여 이들을 규명하여야 할 것으로 판단된다.
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