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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기존의 토양으로부터 DNA를 분리 하는 방법들을 개선하여 각 방법에 의해 분리된 DNA의 농도와 정제도 및 humic acid의 제거 정도를 비교하여 토양 DNA의 손상을 최소화하면서 효율적인 방법으로 분리할 수 있는 기술을 확립하고자 하였다.
- 각 분리방법에서 분리한 genomic DNA를 여러 가지 제한 효소로 처리하여 분자생물학적 기술의 적용 가능성을 검토하였다. 각각의 DNA를 BamHl EcoRI, Hindlll 등의 제한효소를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응하여 절단되는지 여부를 0-8% agarose g인에서 전기영동을 실시하여 확인하였다.
- 본 연구에서는 토양으로부터 클로닝이 가능한 genomic DNA를 분리하기 위하여 제한효소 단편 DNA 제작에 저해 작용을 하는 humic acid 등의 저해 물질 제거와 함께 토양 무게당 획득률을 최적화하기 위한 여러 가지 분리 방법들이 시도되었다. 우선 토양에서 genomic DNA를 분리하는 방법 으로서 기존에 널리 이용되고 있는 방법 I은 1%의 CTAB와 2% SDS가 포함된 DNA extraction buffer를 사용하여 미생물의 세포벽과 세포막을 용해하여 DNA를 추출하는 것으로서 DNA 회수율이 높은 것으로, 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 실시함으로써 DNA의 정제도가 높은 것으로 각각 알려져 있다.
제안 방법
- 원심분리(4, 000 rpm, 10 min, 4°C) 후, 상등액에 동량의 chloroform/isoamylalcohol (24/1)을 넣고 vortex한 후, 수용액층에 2배량의 70% ethanol을 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후 침전물을 상온에서 10분간 건조시킨 다음, 증류수 500 μ1에 녹여 DNA의 농도를 측정하였다.
- 6 volume의 isopropanol을 넣고 상온에 서 2시간동안 침전시킨다. 원심분리 후, 증류수 500 μ1에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.
- 6 volume의 isopropanol을 넣고 상온에서 2시간동 안 침전시킨다. 원심분리 후, 침전물을 증류수 500 μ1에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.
- 각 방법을 통해 분리된 토양 DNA의 농도를 확인하기 위해 각 시료에 대해 증류수로 20배 희석한 다음, UV-VIS spe ctrophotometer (Shimadzu UV-1201)를 사용하여 230 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정 하였으며, 특히 방법 I에 의해 분리된 토양 DNA는 농도를 고려하여 IO?배 혹 은 IO, 배까지 희석하여 측정하였다.
- 또한 토양에서 분리한 DNA 시료의 농도와 humic acid 제거 및 물리적 손상도를 측정하기 위하여 0.8% agarose gel 에서 전기영동을 실시하였다(Fig. 1). 대조구로서 pWHM3 vector 500 ng을 1/3씩 희석하여 사용하였고 방법 I, II, III으 로 각각 분리한 토양 DNA를 역시 증류수로 1/3씩 희석하여 확인하였다.
- 1). 대조구로서 pWHM3 vector 500 ng을 1/3씩 희석하여 사용하였고 방법 I, II, III으 로 각각 분리한 토양 DNA를 역시 증류수로 1/3씩 희석하여 확인하였다.
- 각 분리방법에서 분리한 genomic DNA를 여러 가지 제한 효소로 처리하여 분자생물학적 기술의 적용 가능성을 검토하였다. 각각의 DNA를 BamHl EcoRI, Hindlll 등의 제한효소를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응하여 절단되는지 여부를 0-8% agarose g인에서 전기영동을 실시하여 확인하였다.
- 각 분리방법에서 분리한 토양 DNA의 PCR 적용 여부를 확인하기 위하여 토양에 존재하는 다양한 미생물의 Glyce- raldehyde-3-phophate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 기초로 하여 primer를 디자인 하였다 (Table 1). PCR은 각각의 토양 DNA를 10-2~10-5의 농도로 1/10씩 희석하여 94°C 에서 1분, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 30 cycle 을 수행하였으며, 각 product를 2% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 product를 확인하였다.
- 각 분리방법에서 분리한 토양 DNA의 PCR 적용 여부를 확인하기 위하여 토양에 존재하는 다양한 미생물의 Glyce- raldehyde-3-phophate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 기초로 하여 primer를 디자인 하였다 (Table 1). PCR은 각각의 토양 DNA를 10-2~10-5의 농도로 1/10씩 희석하여 94°C 에서 1분, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 30 cycle 을 수행하였으며, 각 product를 2% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 product를 확인하였다.
- 채취한 토양시료의 pH를 확인하기 위해 토양 5 g을 증류수 10 ml에 현탁하여 원심분리하고 그 상등액의 pH를 측정 하였다. 토양의 표층으로부터 30-50 cm 깊이의 토양을 채취했음에도 불구하고 채취한 토양의 pH가 3.
- 클로닝이 가능한 genomic DNA를 토양으로부터 분리하기 위하여 상기의 결과에서 선정된 방법 HI을 이용하여 2004 년도에 채집한 토양 시료 3〜6을 대상으로 genomic DNA 분리를 실시하였다. 분리된 DNA의 회수율은 토양 5 g당 463 〜785 1咯이었고, 정제도는 1.
- 우선 토양에서 genomic DNA를 분리하는 방법 으로서 기존에 널리 이용되고 있는 방법 I은 1%의 CTAB와 2% SDS가 포함된 DNA extraction buffer를 사용하여 미생물의 세포벽과 세포막을 용해하여 DNA를 추출하는 것으로서 DNA 회수율이 높은 것으로, 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 실시함으로써 DNA의 정제도가 높은 것으로 각각 알려져 있다. 본 연구진에서는 이를 토대로 토양 DNA를 분리하는데 있어 좀더 효율적으로 DNA 회수율과 정제도를 높이고, humic acid와 같은 저해물질을 제거하는 방법 Ⅲ을 시도하였다. 이를 타 방법들과 비교하기 위하여 금정산에서 채취한 토양 1과 토양 2에 대해 각 분리 방법을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, spectropho tometer agarose gel 전기영동을 이용하여 분리된 DNA의 회수율, 정제도 및 저해 물질의 제거 정도를 비교하였다.
- 본 연구진에서는 이를 토대로 토양 DNA를 분리하는데 있어 좀더 효율적으로 DNA 회수율과 정제도를 높이고, humic acid와 같은 저해물질을 제거하는 방법 Ⅲ을 시도하였다. 이를 타 방법들과 비교하기 위하여 금정산에서 채취한 토양 1과 토양 2에 대해 각 분리 방법을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, spectropho tometer agarose gel 전기영동을 이용하여 분리된 DNA의 회수율, 정제도 및 저해 물질의 제거 정도를 비교하였다. 방 법 I은 CTAB를 사용하여 humic acid와 같은 화합물을 제거 한 방법으로 DNA 회수율은 높았으나 정제도가 낮은 것으로 보아 실질적으로 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도를 증대시켜 DNA 양이 높은 것처럼 보이는 것으로 판단되었고, 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 사용하여 분리한 결과로서, DNA 회수율과 정제도가 다른 분리방법에 비해 낮게 나타났다.
대상 데이터
- 토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위하여 2003년 12월에 금정산에서 각각 다른 장소의 인적이 드문 큰 바위 밑, 오래된 나무뿌리 근처 등 지표에서 30〜50 cm 아래로부터 2개의 토양시료를 채취하여 건조시키지 않고 거즈에 걸러서 사용하였고, 2004년 3월에는 금정산의 4곳의 다른 장소에서 동일한 방법으로 토양시료를 채취하여 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하여 사용하였다.
성능/효과
- 218로 대체로 낮은편 이었다. 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 실시하여 정제도의 향상을 기대했으나, 예상과 달리 방법 I 에 비해 DNA 회수율도 278 pg과 532 ug으로 낮으면서 정제도도 1.173과 1.197로서 더 낮았다. 그리고 방법 M의 경우, DNA 회수율은 521 ug과 1028 ug으로서 방법 I에 비해 10~ 20% 정도로 낮은 편이었으나 정제도는 1.
- 197로서 더 낮았다. 그리고 방법 M의 경우, DNA 회수율은 521 ug과 1028 ug으로서 방법 I에 비해 10~ 20% 정도로 낮은 편이었으나 정제도는 1.359와 1.375로 3가지 방법 중 가장 높게 나타났다. 한편 agarose gel 전기영동을 통해 각 시료를 비교한 결과, 분리방법 에 따른 DNA 간의 농도 차이는 보이지 않았는데, 이는 가장 높은 회수율을 보인 방법 I로 분리한 DNA의 경우, 저분자 부분에 다량 존재하는 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도에 영향을 주었기 때문이다.
- 한편 agarose gel 전기영동을 통해 각 시료를 비교한 결과, 분리방법 에 따른 DNA 간의 농도 차이는 보이지 않았는데, 이는 가장 높은 회수율을 보인 방법 I로 분리한 DNA의 경우, 저분자 부분에 다량 존재하는 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도에 영향을 주었기 때문이다. 이상의 결과를 토대로 본 연구진에서 확립한 방법m이 기존의 방법들에 비해 더 효율적인 것으로 판단하였다.
- 클로닝이 가능한 genomic DNA를 토양으로부터 분리하기 위하여 상기의 결과에서 선정된 방법 HI을 이용하여 2004 년도에 채집한 토양 시료 3〜6을 대상으로 genomic DNA 분리를 실시하였다. 분리된 DNA의 회수율은 토양 5 g당 463 〜785 1咯이었고, 정제도는 1.528-1.655 정도로 각각 확인되 었는데(Table 5), 이는 전 단계 실험에 비해서 회수율은 유사 하였지만, 정제도가 월등히 높게 나타난 것으로서 2003년도 시료는 거즈로 단순히 거르기만 한 것에 비해 2004년도 시료는 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등 전처리를 충분히 해준 것도 일부 요인으로 작용했을 것으로 판단되었다.
- 우선 각 시료에 대한 PCR 적용 여부를 확인한 결과, Fig. 2에서와 같이 방법 Ⅲ으로 분리한 genomic DNA를 10'3~ 10,6 농도로 희석했을 때에만 약 350 bp 크기의 product* 확인할 수 있었는데 이는 DNA 시료의 희석과정을 통해 hu mic acid와 같은 저해물질들 역시 충분히 희석되어 PCR 반응을 저해시키지 못한 것으로 판단되었다. 그러나 토양 DNA 를 클로닝 하는데 필요한 6 bp를 인식하는 BamHI, EcoRI, Hindm, Kpnl, Sad, Sall, Xhol 등의 제한효소와 4 bp를 인식 하는 Sau3AI 등의 제한효소를 처리한 결과, 각 분리방법에 의해 분리된 토양 DNA는 본 연구에서 사용된 모든 제한효 소에 의해 절단되지 않았다 (Table 6).
- 2에서와 같이 방법 Ⅲ으로 분리한 genomic DNA를 10'3~ 10,6 농도로 희석했을 때에만 약 350 bp 크기의 product* 확인할 수 있었는데 이는 DNA 시료의 희석과정을 통해 hu mic acid와 같은 저해물질들 역시 충분히 희석되어 PCR 반응을 저해시키지 못한 것으로 판단되었다. 그러나 토양 DNA 를 클로닝 하는데 필요한 6 bp를 인식하는 BamHI, EcoRI, Hindm, Kpnl, Sad, Sall, Xhol 등의 제한효소와 4 bp를 인식 하는 Sau3AI 등의 제한효소를 처리한 결과, 각 분리방법에 의해 분리된 토양 DNA는 본 연구에서 사용된 모든 제한효 소에 의해 절단되지 않았다 (Table 6).
- 이를 타 방법들과 비교하기 위하여 금정산에서 채취한 토양 1과 토양 2에 대해 각 분리 방법을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, spectropho tometer agarose gel 전기영동을 이용하여 분리된 DNA의 회수율, 정제도 및 저해 물질의 제거 정도를 비교하였다. 방 법 I은 CTAB를 사용하여 humic acid와 같은 화합물을 제거 한 방법으로 DNA 회수율은 높았으나 정제도가 낮은 것으로 보아 실질적으로 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도를 증대시켜 DNA 양이 높은 것처럼 보이는 것으로 판단되었고, 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 사용하여 분리한 결과로서, DNA 회수율과 정제도가 다른 분리방법에 비해 낮게 나타났다. 그에 비해 방법 ID의 경우, DNA 회수율은 타 분리방법과 유사하였으나 정제도는 더 높은 것으로 나타났는데 이는 CTAB, PEG, phenol/ chloroform/isoamyl alcohol 처리를 통해 humic acid와 같은 화합물의 제거가 잘 된 것으로 판단되며, 아울러 토양을 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등의 전처리를 충분히 해 줄 경우 정제도가 더 높은 DNA를 얻을 수 있었다.
- 방 법 I은 CTAB를 사용하여 humic acid와 같은 화합물을 제거 한 방법으로 DNA 회수율은 높았으나 정제도가 낮은 것으로 보아 실질적으로 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도를 증대시켜 DNA 양이 높은 것처럼 보이는 것으로 판단되었고, 방법 II는 PEG와 NaCl 및 potassium acetate 침전을 사용하여 분리한 결과로서, DNA 회수율과 정제도가 다른 분리방법에 비해 낮게 나타났다. 그에 비해 방법 ID의 경우, DNA 회수율은 타 분리방법과 유사하였으나 정제도는 더 높은 것으로 나타났는데 이는 CTAB, PEG, phenol/ chloroform/isoamyl alcohol 처리를 통해 humic acid와 같은 화합물의 제거가 잘 된 것으로 판단되며, 아울러 토양을 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등의 전처리를 충분히 해 줄 경우 정제도가 더 높은 DNA를 얻을 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 통해 본 연구진에서 확립한 분리 방법 Ⅲ이 기존의 분리 방법에 비해 상당히 효율적임을 확인할 수 있었다.
- 그에 비해 방법 ID의 경우, DNA 회수율은 타 분리방법과 유사하였으나 정제도는 더 높은 것으로 나타났는데 이는 CTAB, PEG, phenol/ chloroform/isoamyl alcohol 처리를 통해 humic acid와 같은 화합물의 제거가 잘 된 것으로 판단되며, 아울러 토양을 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등의 전처리를 충분히 해 줄 경우 정제도가 더 높은 DNA를 얻을 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 통해 본 연구진에서 확립한 분리 방법 Ⅲ이 기존의 분리 방법에 비해 상당히 효율적임을 확인할 수 있었다.
- 한편, 각 방법에 의해 분리된 genomic DNA에 대해 분자 생물학적인 적용 가능성을 검토하기 위해 먼저 PCR을 수행한 결과에서는 방법 Ⅲ에 의해 분리된 DNA만 낮은 농도에 서 product를 확인할 수 있었을 뿐, 나머지는 전혀 반응을 확 인할 수 없었고, 제한효소를 처리한 경우, 모든 시료에서 반 응을 전혀 확인할 수 없었는데 이는 토양 내에 미량 존재하는 humic acid와 같은 저해 물질들이 그 원인으로 판단되므로 반드시 이들 저해 물질의 제거가 필수적임을 알 수 있었다.
후속연구
- 상기의 결과들을 통해 토양에 미량 존재하는 humic acid 와 같은 물질들이 상당한 저해 작용을 하는 것으로 확인되었으므로 토양 DNA를 분자생물학적 기술에 적용하기 위해서는 반드시 정제과정을 통해 저해물질의 제거가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서 확립된 분리방법 Ⅲ에 대해 humic acid를 포함한 저해물질을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 도입하여 DNA의 손상을 최소화하면서 정제도가 높은 토양 DNA를 분리한다면 이를 이용하여 metagenomic DNA library를 구축하고 E. coli 와 방선균 등의 다양한 숙주세포를 형질전환시켜서 이후 생산되는 각종 항생제와 2차 대사산물 등을 항암제 및 면역조절 물질 등의 개발에 적극 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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