[논문]한국인 주의력결핍 과잉행동장애와 Dopamine Beta Hydroxylase 유전자의 관련성 : 가족기반 연구 및 환자-대조군 연구

박태원; 김붕년; 임명호; 유희정; 강대희; 조수철

문제 정의

주요 내과적/신경 과적/정신과적 과거 병력을 평가하기 위해 부모를 대상으로 자체 제작한 설문 조사를 실시했다. 담 임 교사와의 전화 상담이 가능했던 경우에는 아동이 지속적이고 심각한 행동 문제 보였는지를 조사했다.
이번 연구는 최근 주의력결핍 과잉행동장애와 관련성이 제기되고 있는 DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 환자-대조군 연구 및 가족기반 연구이다. 본 연구의 목적은, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 대조군에서 어떤 분포를 보이는지를 살펴보며, 성과 연령의 영향을 보정한 환자-대조군 연구에서 DBH 유전자 다형성이 주의력 결핍과 잉 행동 장애 발병에 관련되는지와 그 관련성 정도를 추정하고, 아울러 각각의 대립유전자가 환자의 가족 내에서 어떻게 전달되는지를 알아보기 위함이다.
이번 연구는 최근 주의력결핍 과잉행동장애와 관련성이 제기되고 있는 DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 환자-대조군 연구 및 가족기반 연구이다. 본 연구의 목적은, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 대조군에서 어떤 분포를 보이는지를 살펴보며, 성과 연령의 영향을 보정한 환자-대조군 연구에서 DBH 유전자 다형성이 주의력 결핍과 잉 행동 장애 발병에 관련되는지와 그 관련성 정도를 추정하고, 아울러 각각의 대립유전자가 환자의 가족 내에서 어떻게 전달되는지를 알아보기 위함이다.

가설 설정

29). 두 번째 고려 사항은 대상자 수가 너무 적었다는 점이다. 대상자 수의 부족은 가족기반 연구에서 더욱더 두드러졌는데, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성처럼 대립유전자 종류가 2가지인 경우에는 환자군과 부모 군이 유전자형이 모두 일치하게 되는 경우가 많으며 이럴 때에는 전달방식에 대한 아무런 정보를 주지 못하기 때문에 분석에서 제외할 수밖에 없고 결과적으로 대상군이 현저하게 줄어드는 결과를 낳게 되는 것이다.
3). 마지막으로 유전적인 요인 외에 많은 환경적인 요인이 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 준다는 가정을 해 볼 수 있겠다. 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 미치는 유전자의 영향만을 평가하는 경우에는 일반적으로 가족기반 연구가 방법론에서 많은 장점을 지닌다고 알려져 있으나, 유전적 요인 외에 발병에 영향을 미치는 다른 환경적 요인을 평가하기 위해서 환자-대조군 연구가 필요하다 32).

제안 방법

PCR로 증폭된 생성물(464 염기쌍)은 Taq I 효소를 이용해 절단했으며 2% agarose gel에서 전기영동 했으며 Ethi dium bromide 용액에 염색한 후 자외선투광기(UV transi lluminator)로 band를 확인했다(Fig. 1). Taq I 효소에의 해 분해되지 않는 밴드(464 염기쌍에 해당)가 나타난 경우에는 대립유전자 A1 로 해석했고, 분해된 두 개의 밴드(300 염기쌍과 164 염기쌍에 해당)가/나타난 경우를 대립유전자 A2로 해석했다(Fig.
1). Taq I 효소에의 해 분해되지 않는 밴드(464 염기쌍에 해당)가 나타난 경우에는 대립유전자 A1 로 해석했고, 분해된 두 개의 밴드(300 염기쌍과 164 염기쌍에 해당)가/나타난 경우를 대립유전자 A2로 해석했다(Fig. 1). 대상군에 대한 정보를 전혀 알지 못 하는 두 명의 판독 자가 RFLP 결과 사진을 별도로 확인하여 유전자형을 판독한 다음 결과를 서로 비교했는데, 두 평가자 간 일치율은 모두 95% 이상이었다.
DBH 유전자의 TaqI 효소 절단 부위 다형성 위치를 증폭 시 키기 위하여 사용된 시발체 (primer)의 순서는 다음과 같다⑸. forward : 5'-CTG TAT TTG GAA CTT GGC ATC 3' reverse : 5'-ATT CAT TTT ACT ACC CAG AGG 3' 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction : PCR)을 이용하여 유전자 검체를 증폭했다. 유전자 검체 20~30ng, 시발체 0.
주의력 결핍과잉 행동 장애가 7세 이전에 발병하며 남자가 여자보다 3~5배 정도 높은 유병률을 보인다는 점을 감안할 때 성과 연령에 의한 빈도 짝짓기를 통해 어느 정도 이를 보완할 수 있으나 짝짓기 이외의 다른 변인들(사회경제적 수준, 부모의 교육 수준 등)을 통제하지 못했다는 제한점을 안고 있다. 대조군을 어떻게 선정할 것인지가 문제인데, 이번 환자-대조군 연구에서 고려할 수 있었던 대조군 형태는 병원 대조군과 지역 대조군이었다. 일반적으로 병원 대조군은 쉽게 충분한 대상군 선택이 가능하고 회상에 의한 비뚤림을 줄일 수 있으며 환자군과 비슷한 선택 비뚤림이 작용한다는 둥의 장점이 있지만, 건강한 사람을 대상으로 하는 것이 아니고 병원 방문과 관련된 사람을 선택하므로 대조군이 유추하는 모집단과 위험 요인 노출에 차이가 있을 수 있다는 등의 단점이 있는 것으로 알려져 있다 33).
일반적으로 병원 대조군은 쉽게 충분한 대상군 선택이 가능하고 회상에 의한 비뚤림을 줄일 수 있으며 환자군과 비슷한 선택 비뚤림이 작용한다는 둥의 장점이 있지만, 건강한 사람을 대상으로 하는 것이 아니고 병원 방문과 관련된 사람을 선택하므로 대조군이 유추하는 모집단과 위험 요인 노출에 차이가 있을 수 있다는 등의 단점이 있는 것으로 알려져 있다 33). 본 연구에서는 환자의 건강 상태가 주의 집중력에 영향을 줄 수 있다는 점을 감안하여3) 중대한 신체 질환이 있는 경우에는 미리 환자군에서 제외했으며, 동시에 지역사회의 비교적 건강한 아동들을 대조군으로 하여 연구를 진행했다. 지역사회의 환자군이 서울과 지방으로 크게 둘로 나뉘어 분포하고 있다는 점을 감안해 대조군을 서울지 역과 전주지역의 초등학교 한 군데씩을 선택했다.
forward : 5'-CTG TAT TTG GAA CTT GGC ATC 3' reverse : 5'-ATT CAT TTT ACT ACC CAG AGG 3' 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction : PCR)을 이용하여 유전자 검체를 증폭했다. 유전자 검체 20~30ng, 시발체 0.25pmol, IX PCR buffer(Takara, Otsu, Japan), dNTP 200M, rTaq 1.25U 등을 MJ research PTC-200 thermal cycler (MJ research, Waltham, USA)에 넣고 반응시켰다. 94 °C 에서 3분간 denaturation 시킨 후 94 °C 에서 偃, 62°C에서 遷, 72°C에서 1분 72°C에서 5분간 exten sion 시키는 과정을 32주기 동안 반복했다.
주요 내과적/신경 과적/정신과적 과거 병력을 평가하기 위해 부모를 대상으로 자체 제작한 설문 조사를 실시했다. 담 임 교사와의 전화 상담이 가능했던 경우에는 아동이 지속적이고 심각한 행동 문제 보였는지를 조사했다.
환자와 부모 군이 모두 동일한 유전자형인 경우는 분석에서 제외했다. 최종적으로 분석이 가능했던 환자-부모군 68 trio와 1 pair를 대상으로 TDT 분석과 HHRR 분석을 시행했다. 그 결과 TDT 분석(Table 2)과 HHRR 분석 (Table3) 모두 대립유전자 A2에 비해 대립유전자 A1의 선택 전달 이 관찰되었다(TDT : 疽=5.
코너스 부모용 평가 척도를 선별검사 목적으로 사용하기 위해 충동성-과잉운동 요인으로 구성된 10개 문항으로 축 약한 것으로 충동성-과잉운동 요인에 대해 3점 척도로 평정할 수 있도록 구성되었다. 미국의 주의력 결핍 과잉행동장 애 연구에서는 총 점수 15점을 주의력결핍 과잉행동장애의 선정기준으로 삼고 있다.
소아정신과 전문의에 의해 DSM-IV 진단체계에 따라 주 의력결핍 과잉행동 장애로 진단받은 7~14세 아동을 일차적인 대상으로 선정했다. 코너스 부모용 평가척도, 한국판 아동 행동평가조사표 등의 부모용 자가보고 설문 검사를 이용하여 임상 특징을 확인했으며, K-SADS-PL-K를 통해 주 의력결핍 과잉행동 장애를 진단했다.

대상 데이터

상기 과정을 거쳐 최종적으로 106명의 환자군이 선정되었다. 450명의 초등학생 중에서 환자군과 성별, 연령대별 1 : 2 빈도 짝짓기를 통해 212명의 대조군을 선정했다. 환자군의 생물학적 부모 184명이 부모 군으로 선정되었다.
대조군은 서울 시내 초등학교 한 곳과 전주 시내 초등학교 한 곳의 학생 480명을 대상으로 하여 다음과 같은 선별검사와 기준을 통해 서울 지역 300명, 전주지역 150명 등 450명을 일차적으로 선정했다.
상기 과정을 거쳐 최종적으로 106명의 환자군이 선정되었다. 450명의 초등학생 중에서 환자군과 성별, 연령대별 1 : 2 빈도 짝짓기를 통해 212명의 대조군을 선정했다.
서울과 지방 소재의 대학병원(서울대학병원, 경상대학병원, 단국대학 병원, 전북대학병원) 소아 정신과 외래를 방문 한 주의력결핍 과잉행동장애 소아청소년을 대상으로 하여 다음과 같은 선정과정을 시행했다.
소아정신과 전문의에 의해 DSM-IV 진단체계에 따라 주 의력결핍 과잉행동 장애로 진단받은 7~14세 아동을 일차적인 대상으로 선정했다. 코너스 부모용 평가척도, 한국판 아동 행동평가조사표 등의 부모용 자가보고 설문 검사를 이용하여 임상 특징을 확인했으며, K-SADS-PL-K를 통해 주 의력결핍 과잉행동 장애를 진단했다.
주의력결핍 과잉행동장애 아동의 생물학적 부모를 대상으로 선정했다.
본 연구에서는 환자의 건강 상태가 주의 집중력에 영향을 줄 수 있다는 점을 감안하여3) 중대한 신체 질환이 있는 경우에는 미리 환자군에서 제외했으며, 동시에 지역사회의 비교적 건강한 아동들을 대조군으로 하여 연구를 진행했다. 지역사회의 환자군이 서울과 지방으로 크게 둘로 나뉘어 분포하고 있다는 점을 감안해 대조군을 서울지 역과 전주지역의 초등학교 한 군데씩을 선택했다. 병원 대조군 대신에 지역대조군 방식을 적용했을 경우에는 환자군과 대조군의 선택 비뚤림이 서로 다르게 작용한다는 단점이 있다.
8이었다. 환자-부모 대상군은 78trio와 28pah. 로 구성되었는데, pair인 경우는 세 쌍을 제외하고는 모두 환자-어머니 쌍으로 구 성되 었다.
환자군은 서울 소재 대학병원 51명과 지방 소재 대학병원 55명으로 구성되었다.
450명의 초등학생 중에서 환자군과 성별, 연령대별 1 : 2 빈도 짝짓기를 통해 212명의 대조군을 선정했다. 환자군의 생물학적 부모 184명이 부모 군으로 선정되었다. 본 연구의 목적과 방법에 대해 전반적인 설명을 시행했고 이에 대해 서면 동의를 했던 경우에만 연구 대상에 포함시켰다.

데이터처리

환자군과 대조군의 대립 유전자 빈도 비교는 Chi-square test와 unconditional logistic regression analysis# 사용했다. logistic regression analysis는 성별, 연령별 보정을 통해 결과를 산출했다.

이론/모형

Sattley*9가 제안했던 평가 방법을 사용했다. KEDI-WISC 지능평가의 하위 검사 중 토막짜기와 어휘문제로 전체 지능을 추정하는 방법으로, 언어성 검사에서는 어휘 문제가, 동작성 검사에서는 토막 짜기 소 검사가 전체 지능 지수와 상관이 가장 높은 것으로 알려져 있다.
가족기반 연구에서 TDT 분석법이나 HHRR 분석법은 인구계 층화를 고려한 통계분석 방법으로서 TDT가 특정 대립유전 자가 부모로부터 환자에게 전달되는 경우의 수와 전달되지 않는 경우의 수를 산출해서 McNemar %2 test를 이용해 분석하는 방법인데 반해 皿, HHRR은 일종의 가족 내 환자-대조군 형태 분석 방법으로 환자와 내부 대조군의 haplotype-g- 각각 고려하여 유전된 경우의 수를 세는 방식이다28)tdt 와 HHRR 방법은 서로 장단점을 지니고 있는데 29 TD, TDT 분석 방법은 HHRR과 달리 인구 계층화를 확실하게 배제할 수 있다는 장점이 있으나, TDT로는 불가능한 비교위험도의 산출이 HHRR방법으로 가능하다는 차이점이 있다. TDT 분석에는 McNemar's tes僵, HHRR 분석에서는 Chi-suq- are test를 사용했다.
가족기반 연구의 유전자형 및 대립유전자 빈도 분석으로는 transmission disequilibrium test(TDT) 과 haplotype-ba sed haplotype relative risk test(HHRR)를 사'용했다. 가족기반 연구에서 TDT 분석법이나 HHRR 분석법은 인구계 층화를 고려한 통계분석 방법으로서 TDT가 특정 대립유전 자가 부모로부터 환자에게 전달되는 경우의 수와 전달되지 않는 경우의 수를 산출해서 McNemar %2 test를 이용해 분석하는 방법인데 반해 皿, HHRR은 일종의 가족 내 환자-대조군 형태 분석 방법으로 환자와 내부 대조군의 haplotype-g- 각각 고려하여 유전된 경우의 수를 세는 방식이다28)tdt 와 HHRR 방법은 서로 장단점을 지니고 있는데 29 TD, TDT 분석 방법은 HHRR과 달리 인구 계층화를 확실하게 배제할 수 있다는 장점이 있으나, TDT로는 불가능한 비교위험도의 산출이 HHRR방법으로 가능하다는 차이점이 있다.

성능/효과

106명의 환자군을 대상으로 유전자 분석을 실시하여 97 명(91.5%)의 환자군에서 분석 결과를 얻을 수 있었다. 마찬가지로 212명의 대조군 중 211명(99.
최종적으로 분석이 가능했던 환자-부모군 68 trio와 1 pair를 대상으로 TDT 분석과 HHRR 분석을 시행했다. 그 결과 TDT 분석(Table 2)과 HHRR 분석 (Table3) 모두 대립유전자 A2에 비해 대립유전자 A1의 선택 전달 이 관찰되었다(TDT : 疽=5.44, df=l, P=0.02 ; HHRR : 必=5.51, df=l, P=0.02).
이번 연구를 통해 DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다 형성이 한국인 주의력 결핍 과잉 행동장애의 발병에 영향을 미칠 수 있다는 일련의 증거를 찾을 수 있었다. 그러나 기존 연구들과 이번 연구가 연구방법이나 결과 면에서 많은 차이가 있으며 이번 연구 내에서도 연구 형태에 따라 상이한 결과를 보였다는 점을 감안할 때, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다 형성이 주의력 결핍 과잉 행동장애 발병에 미치는 영향이 아주 복잡하고 다양할 것이라는 점을 시사한다. 따라서 향후 추가적인 대상자 수를 대상으로 보다 정교하고 확대된 연구를 시행하여 이러한 사실을 확인해야 할 것이다.
이번 연구에서는 분석에 포함된 환자-부모군 69쌍 중에서 68쌍이 trio이었으며 pair는 한 쌍에 불과했다. 다섯 번째 고려할 사항은 대조군과 부 모 군이 서로 동질한 집단이 아닐 수 있다는 점인데, 대조군과 부모군 사이에 DBH 대립유전자 분포에 있어 유의한 차이는 발견할 수 없었다(%2=2.4, df=l, P=0.3). 마지막으로 유전적인 요인 외에 많은 환경적인 요인이 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 준다는 가정을 해 볼 수 있겠다.
1). 대상군에 대한 정보를 전혀 알지 못 하는 두 명의 판독 자가 RFLP 결과 사진을 별도로 확인하여 유전자형을 판독한 다음 결과를 서로 비교했는데, 두 평가자 간 일치율은 모두 95% 이상이었다.
브라질 국민을 대상으로 했던 또 다른 연구에서도 이와 비슷한 분포를 보였다⑹. 반면, 이번 연구의 대립유전자 A2 빈도는 환자군과 대조군 모두 80% 이상으로 기존 연구들보다 높게 나타났다.
대상자 수의 부족은 가족기반 연구에서 더욱더 두드러졌는데, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성처럼 대립유전자 종류가 2가지인 경우에는 환자군과 부모 군이 유전자형이 모두 일치하게 되는 경우가 많으며 이럴 때에는 전달방식에 대한 아무런 정보를 주지 못하기 때문에 분석에서 제외할 수밖에 없고 결과적으로 대상군이 현저하게 줄어드는 결과를 낳게 되는 것이다. 세 번째, 전체 대립유전자 분포 중에서 대립유전자 A1의 빈도가 전체 대상의 20% 미만으로 이전 연구에 비해 상대적으로 적었다 는 사실도 고려해야 할 것이다. 네 번째, 가족기반 연구에서 환자 一 부모 pair를 포함시킬지 여부에 따라 선택 비뚤림이 연구 시작부터 개입했을 가능성이다.
그러나 한국인이 비교적 동일한 인종적, 민족적 배경을 가진다고 했을 때, 그 영향은 그리 크지 않았으리라 여겨진다. 아울러 이번 연구에서 환자군과 대조군의 유전자형 분포는 Hardy-Weinberg 등식에 따른 예상과 유의한 차이를 보이지 않았다(환자군 : P=0.90 ; 대조군 : P=0.29). 두 번째 고려 사항은 대상자 수가 너무 적었다는 점이다.
이번 연구를 통해 DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다 형성이 한국인 주의력 결핍 과잉 행동장애의 발병에 영향을 미칠 수 있다는 일련의 증거를 찾을 수 있었다. 그러나 기존 연구들과 이번 연구가 연구방법이나 결과 면에서 많은 차이가 있으며 이번 연구 내에서도 연구 형태에 따라 상이한 결과를 보였다는 점을 감안할 때, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다 형성이 주의력 결핍 과잉 행동장애 발병에 미치는 영향이 아주 복잡하고 다양할 것이라는 점을 시사한다.
이번 연구의 환자-대조군 연구에서는 유전자형이나 대립 유전자 모두 DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다형성과 주의력 결핍핍 과잉행동 장애 사이에 유의한 관련성이 보이지 않았다. 이와 달리 가족기반 연구에서는 TDT 분석과 HHRR 분석 모두에서 대립유전자 A1의 선택 전달(preferential tran smission) °] 관찰되었다.
5%)에서 분석 결과를 얻을 수 있었다. 환자군 97명과 대조군「211명의 유전자형은 A1A1 형(31% : 4.7%), A1A2형(29.9% : 28.4%), A2A2형 (67.0% : 66.8%) 등 모두 세 가지로 양군 사이에 유의한 빈도 차이는 없었으며, 대립유전자의 빈도는 API 각각 18.0%와 19.0%, A2가 82.0%와 81.0%이었는데 마찬가지로 유의한 차이가 없었다(Table 1):

후속연구

그러나 기존 연구들과 이번 연구가 연구방법이나 결과 면에서 많은 차이가 있으며 이번 연구 내에서도 연구 형태에 따라 상이한 결과를 보였다는 점을 감안할 때, DBH 유전자의 Taq I 절단 부위 다 형성이 주의력 결핍 과잉 행동장애 발병에 미치는 영향이 아주 복잡하고 다양할 것이라는 점을 시사한다. 따라서 향후 추가적인 대상자 수를 대상으로 보다 정교하고 확대된 연구를 시행하여 이러한 사실을 확인해야 할 것이다.
그러나 이번 연구에서 환자군을 아형이나 동반 이환 양상에 따라 분류하기에는 대상 수가 너무 적었고 이러한 대상자 수의 부족은 가족기반 연구에서 보다 두드러지게 나타나고 있다. 따라서 향후보다 많은 대상 수를 확보하여 비교적 동질한 표현형에 따라 비교분석하는 연구가 필요할 것이다.

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