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문제 정의
- 치료적 목적으로 사용되는 생균제는 인체에서 유래되어야 안전하며, 유전적으로도 안정하다. 또한 위액, pancreatic 효소와 담즙에 분해 되지 않아야 하며, 장내에 다량으로 정착하여야만 생균제로서의 작용을 하게 된다(10, ID- 따라서 본 연구에서는 생균인 Bacillus licheniformis의 산성 pH에 대한 내성, 인공 담즙산에 대한 내성 및 염, 에탄 올에 대한 안정성 등을 검토하여 산업적인 유용성을 밝히 고자 하였다.
- Bacillus Hcheniformis는 장내 균총을 개선하는데 유용한 물질이다. 본 연구의 목포는 B. licheniformis의 낮은 pH (pH 2, 3, 4, 6, 7), 인공 담즙산, 높은 농도의 염 (0. 5, 10, 20, 30%) 그리고 에탄올 (0, 4, 8, 16, 32%)에 대한 안정성을 확인하려고 한다. B.
제안 방법
- 2% potassium phosphate solution을 1 N HC1 로 pH 2, 3, 4, 6, 7로 조절한 인공위액을 사용하였다. 산성 pH에 대한 내성을 실험하기 위해 B. lichenift)rniis를 0.1 g 취하여 위에서 조제한 다양한 pH 용액에 각각 접종하였다. 시료 채취는 각각 0, 1, 2, 3, 4시간 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.
- 5)에서 2시간 배양한 배양액을 멸균된 인공 담즙산 배지에 접종하였다. 시료 채취는 24시간 동안 각각 0, 1, 4, 8, 12, 24시간 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말하고, 최적 온도에서 배양하여 콜로니 형성단위를 측정한 후 총균수를, 계산하였다.
- 2% potassium phosphate solution에 접종하였다. 시료채 취는 37℃에서 4시간 동안 배양한 것을 이용하여 1 ml. 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말하고, 최적 온도에서 배양하여 콜로니 형성단 위를 측정한 후 총균수를 계산하였다.
- 1 g 취하여 위에서 조제한 다양한 pH 용액에 각각 접종하였다. 시료 채취는 각각 0, 1, 2, 3, 4시간 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말하고, 최적 온도에서 배양하여 콜로니 형성단위를 측정한 후 총균수를 계산하였다.
- 에탄올에 대한 내성을 측정하기 위해 Bacillus liche顾)rmis를 0.1 g 취하여 에탄올 (0, 4, 8, 16, 32%)이 첨가된 0.2% potassium phosphate solution에 접종하였다. 시료 채취는 37℃에서 4시간 동안 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.
- 염 농도에 따른 안정성을 측정하기 위해 Bacillus Hchemformis를 0.1 g 취하여 염 (0, 5, 10, 20, 30%)이 첨가된 0.2% potassium phosphate solution에 접종하였다. 시료채 취는 37℃에서 4시간 동안 배양한 것을 이용하여 1 ml.
- 2% sodium thioglycolate (Sigma), ImM sodium taurocholate (Sigma), ImM sodium glycholate (Sigma)를 첨가하여 제조하였다. 인공 담즙산에 대한 내성을 실험하기 위해 B. licheniformise: 0.1 g 취하여 인공 위액 (artificial gastric juice, pH 2.5)에서 2시간 배양한 배양액을 멸균된 인공 담즙산 배지에 접종하였다. 시료 채취는 24시간 동안 각각 0, 1, 4, 8, 12, 24시간 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.
- 총균수는 배양액을 0.2% potassium phosphate로 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말하고, 최적 온도인 37℃에서 배양하여 콜로니 형성단위 (colony forming unit)를 측정한 후 총균수를 계산하였다.
- 1 g 취하여 위에서 조제한 다양한 pH 용액에 각각 접종하였다. 시료 채취는 각각 0, 1, 2, 3, 4시간 배양한 것을 이용하여 1 ml 회수한 후 10배씩 연속적으로 희석시켜 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말하고, 최적 온도에서 배양하여 콜로니 형성단위를 측정한 후 총균수를 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 Bacillus licheniformis 균은 (주)바이넥스에서 분양받아 3~4회 걸친 계대배양으로 활성화하였으며, glycerol stock 법으로 -80℃에서 보존하였고, 한 달에 1회씩 계대 배양하여 사용하였다. 배양 배지는 agar와 TSB (Difco) 배지가 들어 있는 고체 배지를 사용하였다. 그리고 배양온도는 37℃에서 24시간 배양한 것을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 Bacillus licheniformis 균은 (주)바이넥스에서 분양받아 3~4회 걸친 계대배양으로 활성화하였으며, glycerol stock 법으로 -80℃에서 보존하였고, 한 달에 1회씩 계대 배양하여 사용하였다. 배양 배지는 agar와 TSB (Difco) 배지가 들어 있는 고체 배지를 사용하였다.
- 인공 담즙산(artificial bile acid)은 TSB 배지에 0.2% sodium thioglycolate (Sigma), ImM sodium taurocholate (Sigma), ImM sodium glycholate (Sigma)를 첨가하여 제조하였다. 인공 담즙산에 대한 내성을 실험하기 위해 B.
성능/효과
- lichenijbrmis는 pH 3, 4, 6, 7에서 안정적인 생존율을 보였다. B. licheniformis 담즙 내에서의 최종 생존율은 25% 이하로 확인되었다. 높은 농도의 염에서는 B.
- licheniformis 는 10%의 염에서 최적 생존율을 보였다. B. licheniformis의 에탄올이 포함되지 않은 것에 비해 에탄올이 4, 8, 16, 32% 포함된 것에서 95% 이상의 생존율을 보였다. 그러므로 B.
- 5, 10, 20, 30%) 그리고 에탄올 (0, 4, 8, 16, 32%)에 대한 안정성을 확인하려고 한다. B. lichenijbrmis는 pH 3, 4, 6, 7에서 안정적인 생존율을 보였다. B.
- pH 2, 3, 4, 6, 7로 조정된 산성 pH에서의 실험 결과, B. licheniformis는 pH 3, 4, 6, 7에서 80% 이상의 균이 생존하는 매우 높은 생존율을 보였다(Fig. 1).
- 그러므로 B. licheniformis?} pH 3, 4, 6, 7, 높은 농도의 염, 에탄올에서 안정하나 pH 2와 담즙산에서 불안정하다는 것을 확인할 수 있었다.
- licheniformis 담즙 내에서의 최종 생존율은 25% 이하로 확인되었다. 높은 농도의 염에서는 B. licheniformis 는 10%의 염에서 최적 생존율을 보였다. B.
- licheniformis는 4%에서 35%, 8% 이상에서는 8%의 생존율을 보였다. 본 연구에서는 생균제의 제품 형태가 아포인 점을 고려해 볼 때 에탄올에 대한 내성은 높은 것으로 확인할 수 있다. 성인병은 현대의 복잡한 사회구조에 따르는 스트레스 및 식생활의 변화로 발병율이 증가되고 있다.
- 에탄올에 대한 내성 실험은 Fig. 4(A)에서 보는 바와 같이 아포를 형성한 상태의 B. licheniformis는 모든 농도에서 90% 이상의 균이 생존하는 높은 생존율을 보였다. 하지만 Fig.
- 염 농도에 따른 안정성 실험은 Fig. 3에서 보는 바와 같이 염이 10% 첨가된 배양액에서 가장 높은 생존율이 확인되었다. 이는 생균인 B.
- 3에서 보는 바와 같이 염이 10% 첨가된 배양액에서 가장 높은 생존율이 확인되었다. 이는 생균인 B. licheniformis의 생장 과정에서 비교적 높은 염 농도에서 최적의 성장함을 알 수 있었다. 이는 B.
- 인공 담즙산에 대한 내성을 실험한 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 pH 2.5으로 조절된 0.2% potassium phosphate에 2시간 반응한 B. licheRiformis를 인공 담즙이 포함된 배지와 인공 담즙이 포함되지 않은 배지에 접종 후 배양한 것을 비교하였을 때 인공 담즙이 포함되지 않은 배지에 비해 매우 낮은 생존율을 보였다. 따라서 보다 원활한 생균제로서의 기능을 수행하려면 B.
후속연구
- licheRiformis를 인공 담즙이 포함된 배지와 인공 담즙이 포함되지 않은 배지에 접종 후 배양한 것을 비교하였을 때 인공 담즙이 포함되지 않은 배지에 비해 매우 낮은 생존율을 보였다. 따라서 보다 원활한 생균제로서의 기능을 수행하려면 B. licheniformis의 담즙에 대한 내성을 강화할 수 있는 방법의 개발이 필요하겠다.
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