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문제 정의
- 본 연구는 중국 상해에서 구입한 홍경천 분획물의 암세포 증식 억제 효과, quinone reductase 유도 및 항산화 효과를 연구, 검토함으로서 홍경천의 기능적인 역할을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- DPPH radical 소거 활성 측정 : DPPH radical 소거 활성 효과는 Blois의 방법을 변형하여 사용하였다(10). 100 ppm 농도의 홍경천 추출, 분획물과 대조군으로 사용한 Vit.
- QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법 (9) 을 일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 80%이 상 증식하게 되 면 24 well plate의 각 well에 1 x 104 cells/mL 되도록 HepG2세포주를 분주하여, incubator에 24시간 동안 배양한 후 홍경천 분획물을 HepG2의 세포 생존율이 50%되 는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 30, 60, 90, 120 및 150 Ug/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
- 본 연구에 사용된 quinone reductase(QR)는 phaseII 무독화 효소 중 암 예방 물질 탐색 지표가 되는 대표적인 효소며, quinone reductase(QR) 자체에 대한 보호 효과가 있고 항암 작용이 있는 많은 화합물에 의해 유도되어진다. QR 유도 활성 측정을 보다 신속하고 정확하게 하기 위해 여러 종류의 동물 세포 중 QR 유도인 자를 가지고 있는 HepG2 세 포주를 이용하여 실험을 실행하였고, 그 결과는 Fig. 6과 같다. 용매 대조군을 1.
- QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법 (9) 을 일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 80%이 상 증식하게 되 면 24 well plate의 각 well에 1 x 104 cells/mL 되도록 HepG2세포주를 분주하여, incubator에 24시간 동안 배양한 후 홍경천 분획물을 HepG2의 세포 생존율이 50%되 는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 30, 60, 90, 120 및 150 Ug/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 pL의 lysis buffer(10 mM Tris~Cl, pH 8.
- 0, 14 mM NaCl, 15 mM MgCh, 0.5% NP-40)를 첨가한 후 37°C, 5% CO2 incubator0!] 10분간 두면서 c이 1을 lysis 한 후 reaction mixture 즉, 10 mM Tris-CKpH 7.4), 0.5 mg/mL BSA, 0.008% tween- 20, 40 uM FAD, 0.8 mM glucose-6-phosphate, 2 U/mL glucose~6-phosphate dehydrogenase, 25 卩M NADP, 40 Ug /mL MTT 및 1 mM menadione을 혼합하여 well에 1 mL씩 첨가하여 5분 동안 반응 시 킨 후, 반응 정지 용액인 0.3 mM dicumarol, 0.5% pyridine, 5 mM potassium phosphate(pH7.4) 혼합액을 250 卩L씩 첨가하여 효소 반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 610 nm에 서 흡광도 를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다(10).
- incubator에 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL의 농도로 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan 이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi detection microplate-1- 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 대조군 세 포수를 100%로 정 하고 상대적인 세포성 장 억제율을 구하였다.
- 본 실험에서 인체암세포 4종(HeLa, MCF-7, HT-29, HepG2) 을 이용하여 홍경천의 용매별 분획물을 첨가 시 켰을 때의 암세포 증식 억제 효과를 비교 연구하여 보았고, 그 결과는 Fig. 1〜5에 나타내었다.
- 시료를 추출. 분획하여 인체 암세포 주에 대한 증식억제 효과(cyto- toxicity), quinone reductase(QR) 유도 활성 효과(QR-indue- ing effect) 및 항산화 효과(antioxidative effect) 검색에 사용하였다.
- 세 포의 형태 학적 관찰 : 세포배양용 petridish에 HepG2 세포는 24시간 동안 안 정화 시 킨 다음 홍경천을 농도별로 처 리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰한 후에 사진 촬영하였다.
- 위 4종의 세포주는 일주일에 2〜3회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포가 5X104 cells/mL 정도 증식되면 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.0)으로 2번 세척한 후 trypsin-EDTA를 처 리 하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배 양액 으로 암세 포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75 flask에 10mL씩 분할하여 주입하고 4〜5일마다 계대배양 하면서 실험에 사용하였다. 계 대 배양 시 각각의 passage number가 10회 이상일 때는 액체질소 탱크로부터 새로운 세포를 꺼내 어 다시 배양하여 실험하였다.
- 이를 위해 각 세포주를 1 X 105cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL의 농도로 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan 이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi detection microplate-1- 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 대조군 세 포수를 100%로 정 하고 상대적인 세포성 장 억제율을 구하였다.
- 홍경천의 각 추출, 분획물의 DPPH radical 소거에 의한 항산화 효과 결과를 Fig. 7에 나타내 었으며 대조군으로서 는 일반적으로 널리 알려진 강한 항산화제인 BHA와 Vit C의 항산화 효과를 홍경천의 결과와 함께 비교하여 보았다. Fig.
- 홍경천의 분획물 첨가에 HepG2세포주의 형태가 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 여러 농도의 홍경천 분획물을 48시간 동안 처리한 후 위상차현미경을 이용하여 암세포의 형태를 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 홍경천 (Rhodiola sachalinensis A. Bor. RS)은 2003년 1월 중국 상해에서 구입하였다. 시료를 추출.
- 세포 배양 : 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 간암 세 포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma), 자궁경부암 세포인 HeLa(human cervix adenocarcinoma), 유방암 세포인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 대장암 세포인 HT-29(human colon adenocarcinoma)^- 서 2003년 3월 부산대학 병원으로부터 분양받아 사용하였다. HepG2, HeLa와 MCF-7세 포주는 DMEM medium, HT- 29세 포주는 RPMI1640 medium 에 10%의 fetal bovine serum (FBS) 와 1% 100 units/mL의 penicillin/streptomycin0] 함유된 것으로 T-75 flask에 이식한 후, 37°C 5% CO2 incubator에서 monolayer^.
- 시료로 사용된 홍경천 (J갸zodk汨 sachcdinensis A. Bor. RS)은 건조 후 분쇄하여 시료와 메탄올을 1:5(W/V)로 첨가한 후 37°C에서 진탕 배양 후 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감암 농축 후 동결 건조하였으며, 홍경천의 methanol 추출물(RSM)을 얻은 후 각 용매별로 분획하여 hexane(RSMH), ethylether층(RSMEE), ethylacetate 층(RSMEA), Butanol층(RSMB) 및 수층 분획 물(RSMA)로 각각 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
- 시약 : 세포실험에 사용된 시약 중 NP-40과 menadione은 Sigma사 제품을 구입 하였고 flavin adenine dinucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase 는 Amresco사 제품을 구입하였으며, minimum essential medium(MEM), Dulbeco' s Eagle modified medium(DMEM) 과 phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(USA) 에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급 또는 일급을 사용하였다.
- 실험기기 : 암세포 배양을 위해 사용한 실험기기는 CO2 incubator(Forma scientific 3546, Ohio, USA), Clean bench (Vision Scientific Co. LTD., VST_400LS, Seoul, Korea), Rotary evaporator(Tokyo Rikakikai Co., LTD, NN10522423, Tokyo, Japan), Microscopy(Leica Mikroskopie & Systeme Gembhy Wetzlas 520802, Wetzlar, Germany), Deep freezer (DF 9071, Ilsin Enginering Co., Seoul, Korea) 및 Multi-de tection microplate(BIO~TEK, synergy HT. Winooski, USA) 등이었다.
이론/모형
- 4) 혼합액을 250 卩L씩 첨가하여 효소 반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 610 nm에 서 흡광도 를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다(10).
- 단백질량은 동일한 set의 w이1 plate에 대한 crystal vi이et 염색 방법으로 정량하였다. 24 well plate에 1 x 104 cells/well 농도로 분주하고, 37°C, 5% CO2 incubator에 서 2시간 배양한 후 증류수로 2분간 세척하였다.
- 암세포 증식 억제 효과(cytotoxicity) 측정 : 홍경천 추출 분획물의 암세 포 증식 억제 효과는 3-(4, 5-dimethylthia- zol-2-yl)-2, 5_diphenyItetrazolium bromide(MTT assay)를 사용하여 행하였다(6, 7). MTT assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 de- hydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT에 위해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한다.
성능/효과
- 중국, 일본 및 한국에서 약용으로 이 용되 는 홍경 천을 시료로 하여 추출, 각 용매별로 분획하여 생리활성 물질을 검색하였다. 4종의 암세포 주인 HeLa, MCF-7, HT-29 및 HepG2 를 이용하여 암세포 성장억제실험을 한 결과 홍경천의 eth- ylether층인 RSMEE에서는 다른 층에 비해서 비교적 높은 암세포 성장억제 효과가 나타났다. 특히 HepG2 세포주에서 는 시료 최고첨가농도인 500 Ug/mL을 첨가하였을 때 90%의 비교적 높은 암세포 억제 효과를 보였으며, MCF-7 세포 주에서도 비슷한 결과였다.
- 홍경천의 항산화 효과는 이미 항산화제로 널리 알려진 Vit. C의 효과와 비슷하였으며 200}ig/mL의 홍경천 첨가 시 첨가 전보다 암세포 수 감소와 더 불어 형태 학적으로 괴 사가 일어나기 시작함을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 여러 실험 결과에 의하면 예로부터 민간요법에서 애용되어 온 홍경천은 암 예방 및 암세포 증식억제 효과가 있으며 항산화력도 매우 좋은 건강 기능성 식품 소재로 추천할 수 있다고 생각된다.
- 홍경천의 분획물 첨가에 HepG2세포주의 형태가 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 여러 농도의 홍경천 분획물을 48시간 동안 처리한 후 위상차현미경을 이용하여 암세포의 형태를 관찰하였다. Fig. 5에서 나타난 바오} 같이 시료의 처리 농도 의존적으로 세포 밀도의 감소 현상과 형태적인 변화를 관찰할 수 있으며, 각 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리 농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는 dendrite-like structure가 관찰되었다. 이것으로 보아 암세포의 심한 형태적 변형의 정도는 홍경천 분획물의 처리에 따른 암세포 성장억제가 진행되었음을 보여준다고 할 수 있겠다.
- 7에 나타내 었으며 대조군으로서 는 일반적으로 널리 알려진 강한 항산화제인 BHA와 Vit C의 항산화 효과를 홍경천의 결과와 함께 비교하여 보았다. Fig. 7에서와 같이 첨가 시료 농도가 100 ppm일 때 electron do nations activity(EDA)는 홍경천의 6가지의 분획물 중 RSM, RSMEE, RSMEA, RSMB에서 각각 72, 71, 70 및 73%로 나타났으며, 이 수치는 Vit C, BHT의 경우인 각각 74%, 64%를 나타낸 경우와 유사한 EDA를 보여 홍경천의 높은 항산화 효과를 볼 수 있었다. Lee 등(15)은 홍경천의 acetone 분획물에서 DPPH radical 소거 능을 나타내는 항산화 성분인 gallic acid, (-)- epigallocatechin-3-O-gallate, kaempferol 7-0- a -L-rhamnopyranoside, herbacetin 7-0- a -L-rham- nopyranoside, rhodiolinin 등의 페놀 성분을 보고한 바 있다.
- 즉, 초기농도인 100 Hg/mL에서는 RSMEE와 RSMEA에 서 각각 64%, 20%로 큰 차이를 보였으나 시료 첨가 농도를 300 Ug/mL 가한 경우 차츰 비슷한 증식억제 패턴을 보여 마지막 첨가농도인 500 Ug/mL에서는 각각 84%, 83%의 거의 동일한 효과를 나타내었다. 대장암 세포인 HT-29의 결과 는 Fig. 3에 나타내었으며 HT-29세포에서도 역시 RSMEE 에서 첨가 농도인 500pg/mL에서 60%의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었으며, 인체 간암 세포주인 HepG2에서 다른 암세포에서와 마찬가지로 RSMEE/} 비교적 높은 암세포 증식 억제 효과가 나타났다. 특히 저농도인 100, 200iig/mL의 RSMEE 첨가에서는 거의 효과가 약하였으나, 300, 400 Ug /mL 첨가농도에서는 75%, 80%로 암세포 증식억제 효과를 서서히 나타내었으며, 최종첨가농도인 5001ig/mL에서는 거의 90%의 효과를 보여 이 농도에서의 MCF-7의 경우와 비슷하였다.
- 6과 같다. 용매 대조군을 1.0으로 하여 HepG2 암세포 주에 대한 홍 경 천 분획물을 50, 100, 150 및 200 lig/mL 첨가하여 QR 유도 효과를 비교한 결과, hexane 분획 층인 RSMH에서 각각 2.3, 3.0, 3.0 및 3.5의 아주 높은 QR 유도 활성이 나타났으며, RSMEE에서는 각각 1.0, 1.5, 1.7 및 2.0의 약한 유도 활성이 나타났다. QR 유도 활성에 관한 연구로는 Shim 등(11)의 석류의 etheylether 분획층을 50 Ug/mL 첨가했을 때 1.
- 5배의 높은 효과를 보였다. 이와 같은 결과에서, 한방에서 여러 가지 약용으로 쓰이 는 홍경 천 은 ethylether층 즉 TSMEE에서 암세 포성 장저 지 효과가 제 일 컸고, 암 예방 지수인 QR 유도 활성은 hexane층인 RSMH 이제 일 높았으며 RSMEE층은 그다음으로 효과가 있었다. 홍경천의 항산화 효과는 이미 항산화제로 널리 알려진 Vit.
- 즉, 초기농도인 100 Hg/mL에서는 RSMEE와 RSMEA에 서 각각 64%, 20%로 큰 차이를 보였으나 시료 첨가 농도를 300 Ug/mL 가한 경우 차츰 비슷한 증식억제 패턴을 보여 마지막 첨가농도인 500 Ug/mL에서는 각각 84%, 83%의 거의 동일한 효과를 나타내었다. 대장암 세포인 HT-29의 결과 는 Fig.
- 3에 나타내었으며 HT-29세포에서도 역시 RSMEE 에서 첨가 농도인 500pg/mL에서 60%의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었으며, 인체 간암 세포주인 HepG2에서 다른 암세포에서와 마찬가지로 RSMEE/} 비교적 높은 암세포 증식 억제 효과가 나타났다. 특히 저농도인 100, 200iig/mL의 RSMEE 첨가에서는 거의 효과가 약하였으나, 300, 400 Ug /mL 첨가농도에서는 75%, 80%로 암세포 증식억제 효과를 서서히 나타내었으며, 최종첨가농도인 5001ig/mL에서는 거의 90%의 효과를 보여 이 농도에서의 MCF-7의 경우와 비슷하였다. Fig.
- 특히 HepG2 세포주에서 는 시료 최고첨가농도인 500 Ug/mL을 첨가하였을 때 90%의 비교적 높은 암세포 억제 효과를 보였으며, MCF-7 세포 주에서도 비슷한 결과였다. 한편 HepG2 세포주에 대한 홍경천의 QR 유도 활성 효과는 분획물의 농도를 증가시킬수록 증가하였으며 특히 hexane층인 RSMH에서는 시료 최종첨가농도인 200 Ug/mL에서 3.5배의 높은 효과를 보였다. 이와 같은 결과에서, 한방에서 여러 가지 약용으로 쓰이 는 홍경 천 은 ethylether층 즉 TSMEE에서 암세 포성 장저 지 효과가 제 일 컸고, 암 예방 지수인 QR 유도 활성은 hexane층인 RSMH 이제 일 높았으며 RSMEE층은 그다음으로 효과가 있었다.
후속연구
- 홍경천에서는 hexan 분획층에서 가장 높은 QR 유도 활성을 나 타내었으며, 이와 같은 결과로 hexan 분획층의 quinone re ductase inducer의 존재를 추정할 수 있고, Song 등(14)의 연구에 의한 HepG2 세포주에서 간 보호 효과를 나타내는 홍 경 천의 phenol 성분인 Kaempferl, salidroside 등의 항산화물 질들에 대한 암 예방효과도 생각해 볼 수 있다. 일반적으로 높은 QR 유도 활성이 있다고 할 수 있는 홍경천에 대한 더욱 심도 있는 연구를 통해 암 예방 효과를 지닌 기능성 식품의 개발에 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
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