일본에서는 녹나무 줄기에서 분리한 정유의 하나인 camphor는 강심제등 약용으로 사용하고 있지만, 녹나무 잎 추출물에 대한 연구도 적고 특히 항당뇨 효과에 대한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 녹나무 잎 추출물이 in vitro에서 인슐린 작용, 인슐린 분비 또는 탄수화물의 소화에 효과적인지를 조사함으로 항당뇨에 효과적인지 여부를 조사하였다. 녹나무 잎을 $70\%$에탄올로 추출한 후 메탄올과 물을 섞은 용액으로 단계별로 XAD-4 column으로 분획 하였다. 녹나무 잎 추출물은 고농도(1 mg/mL)에서도 MTT로 측정하였을 때 세포 독성을 나타내지 않았다 녹나무 잎 추출분획 물 중 40과 $60\%$ 메탄올층은 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 인슐린의 작용을 향상시켜 포도당의 흡수를 증가시키는 효과가 매우 컸다. 이 추출분획 물들은 3T3-L1 지방세포에 존재하는 인슐린의 작용을 향상시켜 인슐린을 10 nM을 처리한 것보다도 효과적으로 포도당 흡수를 증가시켰다. 또한 $40\%$ 메탄올층은 3T3-L1섬유아세포에 분화 유도물질를 처리하였을 때 PPAR$\gamma$인 pioglitazone과 마찬가지로 지방 세포로의 분화를 촉진시키고 지방의 축적도 증가시켰다. 그러므로 $40\%$ 메탄올층에는 PPAR-$\gamma$ agonist로 작용하는 물질이 함유되어 있을 가능성이 높다. 베타세포라인인 Min6세포에 녹나무 잎 추출분획물을 처리한 후 저농도와 고농도 포도당 자극시 인슐린 분비를 측정하였을 때 두 농도에서 모두 인슐린 분비에 영향을 미치지 않았다. 또한 녹나무 잎 추출분획물은 탄수화물의 소화에 작용하는 효소인 $\alpha$-glucoamylase의 활성에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로 녹나무 잎에는 인슐린 분비나 탄수화물의 소화에 관여하는 성분의 없지만, 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성물질이 함유되어 있을 가능성이 높다. 특히 $40\%$ 메탄올층에는 PPAR$\gamma$ agnist로 작용하는 인슐린 민감성 물질이 존재할 가능성이 높다.
일본에서는 녹나무 줄기에서 분리한 정유의 하나인 camphor는 강심제등 약용으로 사용하고 있지만, 녹나무 잎 추출물에 대한 연구도 적고 특히 항당뇨 효과에 대한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 녹나무 잎 추출물이 in vitro에서 인슐린 작용, 인슐린 분비 또는 탄수화물의 소화에 효과적인지를 조사함으로 항당뇨에 효과적인지 여부를 조사하였다. 녹나무 잎을 $70\%$ 에탄올로 추출한 후 메탄올과 물을 섞은 용액으로 단계별로 XAD-4 column으로 분획 하였다. 녹나무 잎 추출물은 고농도(1 mg/mL)에서도 MTT로 측정하였을 때 세포 독성을 나타내지 않았다 녹나무 잎 추출분획 물 중 40과 $60\%$ 메탄올층은 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 인슐린의 작용을 향상시켜 포도당의 흡수를 증가시키는 효과가 매우 컸다. 이 추출분획 물들은 3T3-L1 지방세포에 존재하는 인슐린의 작용을 향상시켜 인슐린을 10 nM을 처리한 것보다도 효과적으로 포도당 흡수를 증가시켰다. 또한 $40\%$ 메탄올층은 3T3-L1 섬유아세포에 분화 유도물질를 처리하였을 때 PPAR$\gamma$인 pioglitazone과 마찬가지로 지방 세포로의 분화를 촉진시키고 지방의 축적도 증가시켰다. 그러므로 $40\%$ 메탄올층에는 PPAR-$\gamma$ agonist로 작용하는 물질이 함유되어 있을 가능성이 높다. 베타세포라인인 Min6세포에 녹나무 잎 추출분획물을 처리한 후 저농도와 고농도 포도당 자극시 인슐린 분비를 측정하였을 때 두 농도에서 모두 인슐린 분비에 영향을 미치지 않았다. 또한 녹나무 잎 추출분획물은 탄수화물의 소화에 작용하는 효소인 $\alpha$-glucoamylase의 활성에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로 녹나무 잎에는 인슐린 분비나 탄수화물의 소화에 관여하는 성분의 없지만, 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성물질이 함유되어 있을 가능성이 높다. 특히 $40\%$ 메탄올층에는 PPAR$\gamma$ agnist로 작용하는 인슐린 민감성 물질이 존재할 가능성이 높다.
In the present study, we screened candidates for enhancing insulin action and secretion from Cinnamomum camphora (CC) fractions, in 3T3-L1 adipocytes and Min6 cells by investigating insulin- stimulated glucose uptake and glucose-stimulated insulin secretion, respectively. CC were extracted by $...
In the present study, we screened candidates for enhancing insulin action and secretion from Cinnamomum camphora (CC) fractions, in 3T3-L1 adipocytes and Min6 cells by investigating insulin- stimulated glucose uptake and glucose-stimulated insulin secretion, respectively. CC were extracted by $70\%$ ethanol followed by XAD-4 column chromatography with serial mixture solvents of methanol and water, and the fractional extractions were utilized for determining insulin action and secretion, and $\alpha$-glucoamylase suppressing activity, A significant insulin-stimulated glucose uptake was observed in 3T3-L1 adipocytes, giving 0.5 or $5{\mu}g/mL$ of $40\%\;and\;60\%$ methanol fractions plus 0.2 nM insulin, compared to the treatment of DMSO plus 0.2 nM insulin. The treatments of $40\%\;and\;60\%$ methanol fractions plus 0.2 nM insulin reached the glucose uptake of 10 nM insulin treatment. The $40\%$ methanol fraction increased triglyceride accumulation by stimulating differentiation and triglyceride synthesis similar to pioglitazone, PPAR-$\gamma$ agonist. No inhibition of $\alpha$-glucoamylase activity of CC fractions was observed. They did not modulate the insulin secretion capacity In either low or high glucose media. These results suggest that $40\%$ methanol fraction contains a potential insulin sensitizer to have a similar function of PPAR-$\gamma$ agonist. Crude CC extract may improve glucose utilization by enhancing insulin-stimulated glucose uptake without elevating glucose stimulated insulin secretion.
In the present study, we screened candidates for enhancing insulin action and secretion from Cinnamomum camphora (CC) fractions, in 3T3-L1 adipocytes and Min6 cells by investigating insulin- stimulated glucose uptake and glucose-stimulated insulin secretion, respectively. CC were extracted by $70\%$ ethanol followed by XAD-4 column chromatography with serial mixture solvents of methanol and water, and the fractional extractions were utilized for determining insulin action and secretion, and $\alpha$-glucoamylase suppressing activity, A significant insulin-stimulated glucose uptake was observed in 3T3-L1 adipocytes, giving 0.5 or $5{\mu}g/mL$ of $40\%\;and\;60\%$ methanol fractions plus 0.2 nM insulin, compared to the treatment of DMSO plus 0.2 nM insulin. The treatments of $40\%\;and\;60\%$ methanol fractions plus 0.2 nM insulin reached the glucose uptake of 10 nM insulin treatment. The $40\%$ methanol fraction increased triglyceride accumulation by stimulating differentiation and triglyceride synthesis similar to pioglitazone, PPAR-$\gamma$ agonist. No inhibition of $\alpha$-glucoamylase activity of CC fractions was observed. They did not modulate the insulin secretion capacity In either low or high glucose media. These results suggest that $40\%$ methanol fraction contains a potential insulin sensitizer to have a similar function of PPAR-$\gamma$ agonist. Crude CC extract may improve glucose utilization by enhancing insulin-stimulated glucose uptake without elevating glucose stimulated insulin secretion.
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문제 정의
3). 그러므로 녹나무 잎 추출분 획물 중 40% 메탄올층은 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수도 증가시키면서 지방의 축적도 증가 시 키는 것으로 보아 PPAR- / agonist가 함유되어 있을 가능성을 시사하는 것이다. 반 면에 20% 메탄올층인 CC20는 대조군에 비해 중성지방의 축적을 통계적으로 유의하게 저하시켰다(Fig.
본 연구에서는 3T3-L1 지방세포에 소량의 인슐린인 0.2 nM과 녹나무 잎 추출 분획 물을 처리 하였을 때 10 nM 인슐린 을 처리 하였을 때와 마찬가지로 포도당의 흡수를 증가 시 키는 지를 조사하였다. 녹나무 잎 추출 분획물을 0.
일본에서는 녹나무 줄기에서 분리한 정유의 하나인 camphor는 강심제 등 약용으로 사용하고 있지만, 녹나무 잎 추출물에 대한 연구도 적고 특히 항당뇨 효과에 대한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 녹나무 잎 추출물이 in uzTtp에서 인슐린 작용, 인슐린 분비 또는 탄수화물의 소화에 효과적 인지를 조사함으로 항당뇨에 효과적 인지 여부를 조사하였다. 녹나무 잎을 70% 에탄올로 추출한 후 메탄올과 물을 섞은 용액으로 단계별로 XAD-4 column으로 분획하였다.
아직 까지 녹나무 잎이 혈당 강하 효과에 대한 연구는 거의 없지만, 제주도에서는 민간요법으로 녹나무 잎 다린 물을 당뇨병 치료에 사용해 왔다. 본 연구에서는 녹나무 잎 추출물이 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 효과, 인슐린처럼 작용하는 인슐린 성 물질로서의 효과 그리고 a -gluco- amylase의 억제제로의 효과가 있는 지 여부를 조사하였다.
또한, 둥굴 레 뿌리에 함유되어 있는 steroidal glycosides가 90% 췌장 제거 백서에서 인슐린 민감성 물질로 작용한다는 것을 확인하였다(15). 본 연구팀이 한약재가 혈당 강하에 대한 효과가 있는지를 조사할 때 표적(target)으로 조사한 것은 인슐린의 작용을 향상 시 키는 인슐린 민감성 효과, 인슐린처럼 작용하는 인슐린 성 효과, 탄수화물의 소화 흡수를 방해하는 a- glucoamylase 억제 효과를 가지고 있는 지 여부를 탐색하는 것이었다.
가설 설정
1)DMSO: The solvent of CC fractions as a negative control. CC0-CC100: Each of methanol 0%, 20%, 40%, 60%, 80% and 100 % fractions of CC ethanol extracts by XAD-4 column.
3) Values are mean ± SD (n=10).
3)Values are mean±SD (n=8).
제안 방법
배양한 후 새로운 DMEM배지로 교환하였다. 3T3-L1 섬유아세포에 DMSO(control), 10 lig/mL 녹나무 잎 추출 분획물 또는 20 J1M pioglitazone(positive control)과 분화유도물질인 0.2511M의 dexamethasone(DEX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 0.5 mM의 1 -methy 1 -3-isobutyIxanthine(IBMX, Si- gma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 10 Ug/mL의 인슐린(Sigma, St. Louis, MI, USA)과 함께 처리 하여 4일 동안 분화시켰다. 다시 배지를 교환하고 분화유도물질 없이 DMSO 또는 pioglitazone 또는 녹나무 잎 추 줄 분획 물을 배 지 에 처리 하고 6일 동안 배양하였다.
다시 배지를 교환하고 분화유도물질 없이 DMSO 또는 pioglitazone 또는 녹나무 잎 추 줄 분획 물을 배 지 에 처리 하고 6일 동안 배양하였다. 6일째에 세포에 glycerol이 포함 되어 있지 않은 lysis buffer(20 mM Tris, pH 7.4, 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 12 mM glycerol phosphate와 protease inhibitors)로 용줄한 후 축적된 triglyceride 함량을 Trinder kit(영동제약, 서울)로 측정하였다(12, 14). 또한 상층액의 단백질 함량을 Bradford 방법 을 응용하여 제조된 Bio-Rad's protein assay kit(Bio-Rad Laboratory, Hercules, California)을 사용하여 비색 정 량으 로 측정하였다.
1% BSA로 제조하였다. 각각의 KRB 용액에 각각 DMSO, 5 Ug/mL 녹나무 추출 분획물 또는 5 nM exendin-4(positive control)을 처리한 후 30분 동안 분비 되는 인슐린의 양을 배지에 함유된 인슐린 농도로 측정하였다. 인슐린 농도는 Linco 인슐린 kit(Linco Research, St.
건조된 녹나무 잎 1 kg을 분쇄하여 증류수 10 L을 넣고 2시간 열수로 2회 반복 추출한 후 거즈로 여 과하고 450 X g로 원심 분리 (Megafuge 1.0R, USA)하여 상등액을 회전 진공 농축기 (Buchi R-114, USA)로 35℃에서 감압 농축한 후 동결 건조(Ilshin Freeze dryer, Korea)하여 분말 추출시료를 만들었다. 열수 분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁 시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경 , 30 mm; 길이, 300 mm)으로 정제하였다.
녹나무 잎 추출 분획물이 인슐린 분비 능에 미치는 영향을 조사하기 위해서 베타세포 라인인 Min6cell에 녹나무 잎 추출물을 첨가하였을 때 저농도와 고농도 포도당 배지에서 인슐린 분비 정도를 .측정하였다.
나머지 lysis buffer에 05NNaOH를 넣어 攵을세포로부터 용출 시 키고 초산으로 중화 시 킨 후 “C의 함량을 베타 counter(Tri- Carb 2100TR, Packard Bioscience, IL)로 측정하였다(12, 14). 녹나무 잎 추출 분획물이 지방세포에서 세포 내로의 포도당 유입에 미치는 영향을 조사하기 위해서 녹나무 잎 추출분 획물을 DMSO에 1 mg/mL으로 녹인 후 이것을 PBS에 0.5 Ug/mL 와 5 Ug/mL로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당 유입을 측정하였다. 녹나무 잎의 각 추출 분획물에 인슐린 민감 성제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 0.
5 Ug/mL 와 5 Ug/mL로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당 유입을 측정하였다. 녹나무 잎의 각 추출 분획물에 인슐린 민감 성제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 0.2 nM과 함께 각 추출 분획물 또는 20 pioglitazone(positive control)을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 유입 정도를 인슐린 10 nM에서의 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0, 1 nM 그리고 10 nM을 사용하였다.
반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 포도당 정량 kit(영 동제 약, 서울)로 측정 하여 a -이 ucoamylase의 활성을을 결정하였다(12, 14). 대조군은 녹나무 잎 추출 분획물의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 1 unit의 a-glucoamylase가 1시간 동안 dextrin을 분해하여 생성하는 포도당의 양(ug)으로 계산하였다(14).
4, 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 12 mM glycerol phosphate와 protease inhibitors)로 용줄한 후 축적된 triglyceride 함량을 Trinder kit(영동제약, 서울)로 측정하였다(12, 14). 또한 상층액의 단백질 함량을 Bradford 방법 을 응용하여 제조된 Bio-Rad's protein assay kit(Bio-Rad Laboratory, Hercules, California)을 사용하여 비색 정 량으 로 측정하였다.
2 M 초산 용액을 넣어 중화시켰다. 반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 포도당 정량 kit(영 동제 약, 서울)로 측정 하여 a -이 ucoamylase의 활성을을 결정하였다(12, 14). 대조군은 녹나무 잎 추출 분획물의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다.
본 연구에서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 OmM, 0.2 nM, 0.6 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM과 15 nM을 처리 한 후 세포 내로의 포도당 유입 정도를 측정하였을. 때 인슐린 농도가;10, nM 까지는 인슐린 농도가 증가함에 따라 포도당 유입이 증가하였고, 10 nM보다 높은 인슐린 농도에서는 인슐린 농도에 따른 세포 내로의 포도당 유입에 차이를 나타내지 않았다 (Fig.
본 연구에서 사용한 3T3-L1 섬 유아세 포는 생물학적 잘특성이 잘 밝혀져 있고, 인슐린과 같은 유도물질의 존재하에서는 지방세포로 분화되는 특성을 갖고 있어 분화를 촉진하는 물질인 인슐린과 유사한 물질(인슐린 성 물질)의 존재 여부를 탐색하는 실험에 사용한다. 3T3-L1 섬유아세포는 인슐린, DEX 와 IBMX로 조성된 분화유도물질을 첨가하였을 때 지방세포로 전환되는데(21, 22), 이 기전은 아직 확실하게 알려지지는 않았다.
본 연구에서는 3T3-L1 섬유아세포에서 유도 분화 물질을 첨가하여 지 방세포로 분화를 유도할 때 3T3-L1 섬 유아세 포에 분화 유도물질과 함께 녹나무 잎 분획 추출물을 10 Hg/mL의 농도로 처리하였을 때 지방세포로 분화되어 지방이 축적되는 정도를 측정하였다. 결과는 대조군인 DMSO를 처리한 것에 대한 녹나무 잎 추출 분획물을 처리한 것의 백분율로 계산하여 비교하였다.
민간요법으로 사용되고 있는 많은 약초에 대해서도 아직까지 그 효과가 밝혀진 것은 많지 않고 특히 어떤 기 전으로 혈당을 낮추는지에 대한 연구는 거의 없었다. 본 연구팀은 동의보감에서 당뇨병의 처방에 많이 사용하는 90여 종의 약초들을 중심으로 먼저 3T3-L1 섬 유아 세포와 지방세포를 사용하여 in I说m에서 인슐린 민 감성이나 인슐린 유사성 물질을 탐색하였다(11-14). 이들 중 효과가 있는 한약재의 추출 분획물은 더 분리하여 단일 물질로 분리하고 있으며, 이 물질들의 효과는 백서에 장기간 투여하였을 때 인슐린 민감성이나 인슐린 분비 능의 변화를 조사하고 있다.
각각의 추출 분획물은 10% DMSO에 1 mg/mL로 녹인 후 sonicator로 20초 동안 진탕하여 침전물 없이 모두 용해시켰다(12). 분리한 시료의 세포독성을 조사하기 위해서 세포의 배양액 에 각각의 물질을 1 lig/mL, 100 [ig/mL 그리고 1000 Ug/mL의 농도로 녹여 12시간 동안 배양하면서 MTT assay kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 생성된 수용성의 formazan product를 ELISA reader로 광학적 으로 측정하여 정량하였다.
Well plate에 옮긴 지방세포를 PBS로 세척한 후 500 虬의 1% BSA를 함유하고 있는 저농도의 포도당을 함유한 DMEM에서 12시간 이상 지난 후에 HEPES 용액으로 37℃에서 30분 동안 배양한 후 1 RCi/mL의 ["C]2-deoxy-glucose와 1 mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포 내로의 유입 정도를 "C。】 세포 내로 이동한 양으로 측정하였다(12, 14). 비특이적인 포도당 유입을 배제하기 위해서 glucose transporter 4(GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포 내로 유입된 포도당의 양을 측정하였다. 세포는 10 mM 포도당이 함유된 PBS으로 세척하고 소량의 lysis buffer로 세포를 용출 시켜 일부를 취하여 단백질 함량을 Bio-Rad protein assay kit를 사용하여 비색정량으로 측정하였다.
비특이적인 포도당 유입을 배제하기 위해서 glucose transporter 4(GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포 내로 유입된 포도당의 양을 측정하였다. 세포는 10 mM 포도당이 함유된 PBS으로 세척하고 소량의 lysis buffer로 세포를 용출 시켜 일부를 취하여 단백질 함량을 Bio-Rad protein assay kit를 사용하여 비색정량으로 측정하였다. 나머지 lysis buffer에 05NNaOH를 넣어 攵을세포로부터 용출 시 키고 초산으로 중화 시 킨 후 “C의 함량을 베타 counter(Tri- Carb 2100TR, Packard Bioscience, IL)로 측정하였다(12, 14).
0R, USA)하여 상등액을 회전 진공 농축기 (Buchi R-114, USA)로 35℃에서 감압 농축한 후 동결 건조(Ilshin Freeze dryer, Korea)하여 분말 추출시료를 만들었다. 열수 분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁 시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경 , 30 mm; 길이, 300 mm)으로 정제하였다. 이때 용출액 은 메탄올의 양을 증량 시켜 극성을 변화시키면서 H2O(CC0), 20% 메탄올(CC20), 40% 메탄올(CC40), 60% 메탄올(CC60), 80% 메탄올(CC80) 및 100% 메탄올(CC100)으로 나누어 분 획 하여 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다.
예비실험으로 녹나무 잎 추출 분획물의 세포 독성을 조사하기 위해서 1 Hg/mL~l mg/mL의 농도에서 3-(4, 5~dime~ thylthiazol-2-y 1)-2, 5-diphenyItetrazolium bromide(MTT) 실험을 하였다. Fig.
flask에 완전히 채워질 때까지 배양하였다. 위에서 언급하였듯이 배양 용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도 분화 물질을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한 번씩 고농도 포도당 DMEM 용액으로 새로 바꾸어 주어 지방세포로 완전히 전환된 10~ 15일 사이에 포도당 유입 실험을 하였다. 배양 용기에 있는지 방세 포의 수를 세어 (5 X 105 cells/mL) 24 well plate의 well을 빈 공간없이 완전히 채울 수 있도록 분주하였다.
열수 분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁 시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경 , 30 mm; 길이, 300 mm)으로 정제하였다. 이때 용출액 은 메탄올의 양을 증량 시켜 극성을 변화시키면서 H2O(CC0), 20% 메탄올(CC20), 40% 메탄올(CC40), 60% 메탄올(CC60), 80% 메탄올(CC80) 및 100% 메탄올(CC100)으로 나누어 분 획 하여 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다. 각각의 추출 분획물은 10% DMSO에 1 mg/mL로 녹인 후 sonicator로 20초 동안 진탕하여 침전물 없이 모두 용해시켰다(12).
대상 데이터
이 well들은 둘로 나누어 반은 저농도 포도당 Krebs Ringer Bicarbonate(KRB) 용액으로 교환하고, 나머지 반은 고농도 포도당 KRB 배지로 교환하였다. KRB 용액은 115 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 1.2 mM MgSCZ, 1.28 mM CaCh,1.2 mM KH2PO4, 25 mM Hepes, 8.4%(w/v) NaHCO3(pH7.4) 그리고 0.1% BSA로 제조하였다. 각각의 KRB 용액에 각각 DMSO, 5 Ug/mL 녹나무 추출 분획물 또는 5 nM exendin-4(positive control)을 처리한 후 30분 동안 분비 되는 인슐린의 양을 배지에 함유된 인슐린 농도로 측정하였다.
계 대 배양한 후 3T3-L1 섬 유아 세포를 75 cm2 flask에 완전히 채워질 때까지 배양하였다. 위에서 언급하였듯이 배양 용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도 분화 물질을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한 번씩 고농도 포도당 DMEM 용액으로 새로 바꾸어 주어 지방세포로 완전히 전환된 10~ 15일 사이에 포도당 유입 실험을 하였다.
2 nM과 함께 각 추출 분획물 또는 20 pioglitazone(positive control)을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 유입 정도를 인슐린 10 nM에서의 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0, 1 nM 그리고 10 nM을 사용하였다. 분리한 물질이 인슐린의 작용에 관계없이 detergent로 작용하여 세포막을 파괴 시 켜 포도당 유입을 증가 시 키는 것을 배제하기 위해서'인슐린어 OnM에서 분리한 물질과 함께 포도당 유입을 측정하였을 때.
본 실험 에 사용한 녹나무 잎은 제주도 한라수목원의 협조를 받아 직접 채취하여 사용하였고, 일련번호(2004-kiom-ko-11)를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
데이터처리
모든 결과는 네 번 반복에 대한 평균과 표준편차로 계산하여 나타내었다. 각 실험에서 녹나무 잎 추출 분획물들과 대조군 (control)과의 통계적 유의성은 Student t-test로 검증하였다.
본 연구에서는 3T3-L1 섬유아세포에서 유도 분화 물질을 첨가하여 지 방세포로 분화를 유도할 때 3T3-L1 섬 유아세 포에 분화 유도물질과 함께 녹나무 잎 분획 추출물을 10 Hg/mL의 농도로 처리하였을 때 지방세포로 분화되어 지방이 축적되는 정도를 측정하였다. 결과는 대조군인 DMSO를 처리한 것에 대한 녹나무 잎 추출 분획물을 처리한 것의 백분율로 계산하여 비교하였다. 녹나무 잎 추출물 처리군 중 40% 메탄 올 추출물만 대조군에 비해 지방 세포로의 전환을 증가 시 켰고 이것은 PPAR- 7 agonist로 알려진 pioglitaonze과 유사한 정도로 증가시켰다(Fig.
모든 결과는 네 번 반복에 대한 평균과 표준편차로 계산하여 나타내었다. 각 실험에서 녹나무 잎 추출 분획물들과 대조군 (control)과의 통계적 유의성은 Student t-test로 검증하였다.
이론/모형
각각의 KRB 용액에 각각 DMSO, 5 Ug/mL 녹나무 추출 분획물 또는 5 nM exendin-4(positive control)을 처리한 후 30분 동안 분비 되는 인슐린의 양을 배지에 함유된 인슐린 농도로 측정하였다. 인슐린 농도는 Linco 인슐린 kit(Linco Research, St. Charles) 을 사용하여 radioimmunoassay 방법으로 측정하였다(17).
성능/효과
또한 녹나 무 잎 추출 분획물은 탄수화물의 소화에 작용하는 효소인 a - glucoamylase의 활성에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로 녹나무 잎에는 인슐린 분비나 탄수화물의 소화에 관여하는 성분의 없지만, 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있을 가능성이 높다. 특히 40% 메탄올층에는 PPAR- Y agnist로 작용하는 인슐린만 감성 물질이 존재할 가능성이 높다
결론적으로 본 연구에서 녹나무 잎 추출 분획물은 인슐린 분비 촉진제와 a -glucoamylase 억제제로는 효과가 없었지만, 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 제제로는 그 효과가 컸다. 특히 녹나무 잎 분획 추출물을 5 Ug/mL의 농도와 인슐린 0.
특히 CC40 은 인슐린을 10 nM를 처리하였을 때만큼 포도당 흡수를 증가시켰으며 인슐린 민감성 제제로 판매되고 있는 20 nM pioglitazone 정도로 인슐린-촉진에 의한 포도당 유입(insulin-stimulated glucose uptake)-4- 증가시켰다. 그러므로 40%와 60% 메탄올층에는 인슐린 민감성 물질을 함유할 가능성이 높음을 시사하였다
그러므로 exendin-4는 sulfonylurea 계통의 인슐린 분비 촉진제와는 달리 고혈당에서만 인슐린 분비를 촉진시켜 혈당을 정상화시키는 효과적인 인슐린 분비 촉진제이라는 것이 보고되었다(26, 27). 그러므로 본 연구에서 조사한 녹나무잎 추출 분획물은 포도당 농도에 관계 없이 인슐린 분비 촉진 제로 작용하지 않는다는 알것을 알 수 있었다.
2 nM과 녹나무 잎 추출 분획 물을 처리 하였을 때 10 nM 인슐린 을 처리 하였을 때와 마찬가지로 포도당의 흡수를 증가 시 키는 지를 조사하였다. 녹나무 잎 추출 분획물을 0.5 ng/mL 농도로 처리하였을 때 그 중 CC60인 60% 메탄올층에서 포도당 흡수를 효과적으로 증가시켰다. 특히 인슐린과 함께 0.
결과는 대조군인 DMSO를 처리한 것에 대한 녹나무 잎 추출 분획물을 처리한 것의 백분율로 계산하여 비교하였다. 녹나무 잎 추출물 처리군 중 40% 메탄 올 추출물만 대조군에 비해 지방 세포로의 전환을 증가 시 켰고 이것은 PPAR- 7 agonist로 알려진 pioglitaonze과 유사한 정도로 증가시켰다(Fig. 3). 그러므로 녹나무 잎 추출분 획물 중 40% 메탄올층은 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수도 증가시키면서 지방의 축적도 증가 시 키는 것으로 보아 PPAR- / agonist가 함유되어 있을 가능성을 시사하는 것이다.
녹나무 잎 추출물은 고농도(1 mg/mL)에서도 MTT로 측정하였을 때 세포 독성을 나타내지 않았다. 녹나무 잎 추출분 획물 중 40과 60% 메탄올층은 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 인슐린의 작용을 향상 시 켜 포도당의 흡수를 증가 시 키는 효과가 매우 컸다. 이 추출 분획물들은 3T3-L1 지방세포에 존재하는 인슐린의 작용을 향상시켜 인슐린을 10 nM 을 처리 한 것 보다도 효과적으로 포도당 흡수를 증가 시 켰다.
6 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM과 15 nM을 처리 한 후 세포 내로의 포도당 유입 정도를 측정하였을. 때 인슐린 농도가;10, nM 까지는 인슐린 농도가 증가함에 따라 포도당 유입이 증가하였고, 10 nM보다 높은 인슐린 농도에서는 인슐린 농도에 따른 세포 내로의 포도당 유입에 차이를 나타내지 않았다 (Fig. 1). 즉, 10 nM 인슐린 농도가 인슐린 수용체를 통한 인슐린 작용을 나타내는 최대 농도로 이 농도 이하에서는 인슐린 농도에 비례하여 인슐린 작용이 증가하지만 그 이상 증가하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
인슐린을 첨가하지 않고 추출 분획물만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정하였는데 그 값은 인슐린을 첨가하지 않고 포도당 유입을 조사한 Fig. 1의 기저 값과 유사하거나 오히려 낮아 추출 분획물이 세포막을 투과 적으로 만드는 detergent로 작용하여 비특이적으로 포도당의 흡수를 증가 시 키는 것은 아니라는 것을 확인하였다. 다른 연구에 서도 천연물 추출물을 처리하였을 때 인슐린 작용을 증가 시 켜 포도당 흡수를 증가시키는 것들이 있다고 보고하였다.
인슐린 민감성 물질은 존재하는 제2형 당뇨병의 근본적인 문제인 인슐린 저 항성을 완화 시 켜 소량의 인슐린으로 혈당을 정상 화시 키고 궁극적으로 혈당에 필요한 인슐린양을 저 하시 켜 고인슐린혈증을 없애 줄 수 있는 것으로 알려져 있다(1, 2,18). 즉 인슐린 민감성 물질은 당뇨병 뿐 아니라 인슐린 저 항성 증후군의 증세를 완화시킬 수 있을 것으로 사료된다. 결국 인슐린 저 항성을 완화 시 킨다는 것은 인슐린이 인슐린 수 용체와 결합한 후 세포 내에서 일어나는 신호전달 체계가 원활하게 일어날 수 있도록 도와주어 세포에서 포도당의 이용을 향상시키는 것이다.
1). 즉, 10 nM 인슐린 농도가 인슐린 수용체를 통한 인슐린 작용을 나타내는 최대 농도로 이 농도 이하에서는 인슐린 농도에 비례하여 인슐린 작용이 증가하지만 그 이상 증가하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
결론적으로 본 연구에서 녹나무 잎 추출 분획물은 인슐린 분비 촉진제와 a -glucoamylase 억제제로는 효과가 없었지만, 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 제제로는 그 효과가 컸다. 특히 녹나무 잎 분획 추출물을 5 Ug/mL의 농도와 인슐린 0.2 nM을 사용하였을 때 40%와 60% 메탄 올 추출 분획물에서 인슐린 작용을 향상시켰다. 특히 40% 메탄올 추출 분획물은 3T3-L1 섬 유아세 포를 지 방세 포로 분화 시 켜 중성지방의 축적을 증가시키는 효과도 있는 것으로 보아 PPAR- / agonist가 함유되어 있을 가능성이 높다.
후속연구
특히 40% 메탄올 추출 분획물은 3T3-L1 섬 유아세 포를 지 방세 포로 분화 시 켜 중성지방의 축적을 증가시키는 효과도 있는 것으로 보아 PPAR- / agonist가 함유되어 있을 가능성이 높다. 그러 므 로 녹나무 잎 추출물에는 PPAR- / 로 작용하는 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있어서 당뇨병 및 인슐린 저항성의 치료와 예방에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
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